一种用于评价固体熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的方法及装置与流程

本发明属于农业技术领域，尤其涉及一种用于评价固体熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的方法及装置。

背景技术：

近年来，由于我国保护地栽培的迅速发展和连年重茬种植，土传病害问题越来越重，农作物产量和品质受到严重影响。土壤熏蒸剂因其防病彻底且增产显著而备受种植者欢迎，用量逐年上升。土壤熏蒸剂作为具有强挥发性且毒性较高的一类特殊农药，其环境毒理登记试验的操作非常困难，目前缺乏一种准确可靠且操作安全、方便的评价方法。

尽管经济合作发展组织(OECD)、美国国家环境保护局(USEPA)和我国环境保护部专门为了规范环境毒理评价试验，都对常规农药进行蚯蚓急性毒性的提供了标准方法，但由于上述方法中建议的试验装置为玻璃烧杯而具有强烈挥发性熏蒸剂会在试验过程中出现大量逃逸，从而引起试验结果的不准确，同时会对试验操作人员形成很大的安全威胁。同时，上述方法中建议的土壤含水量为人工干土重的35％左右(即达到饱和含水量或者说相对含水量为100％)，如果直接将上述玻璃装置烧杯换成一个密闭的玻璃容器进行试验，空白对照处理的蚯蚓也会短期出现大量死亡，从而导致试验失败。目前，亟需摸索试验出一种专门适用于评价具有强烈挥发性熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的准确可靠且操作安全的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于室内评价固体土壤熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的方法及装置，本发明的方法及装置，评价结果准确可靠，而且重复性高；同时本发明方法及装置具有对试验操作人员安全、操作简便快捷而且成本低廉等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种用于评价固体熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的方法，包括以下步骤：

1)将自然土壤置于熏蒸装置中；

2)调节温度和光照强度，将多个蚯蚓放在步骤1)的自然土壤的表面；

3)待蚯蚓全部钻入自然土壤中后，将固体熏蒸剂均匀混布到自然土壤中；将熏蒸装置密封，之后进行熏蒸处理；

4)调查蚯蚓的死亡情况，并计算蚯蚓的死亡率，根据蚯蚓的死亡率来评价熏蒸剂对蚯蚓急性毒性。

本发明的有益效果是：本发明所述的方法具有评价结果准确可靠，而且重复性高；将熏蒸装置密封，有利于保证熏蒸的效果更加准确，同时避免熏蒸剂从熏蒸装置逸出对试验操作人员的健康产生威胁。本发明的方法对试验操作人员安全、操作简便快捷而且成本低廉等优点。在步骤2)中是将蚯蚓放在自然土壤的表面，这样设置可以检查挑选蚯蚓的活泼和健康程度。如果放于自然土壤表面的蚯蚓在适宜光照和温度条件(例如：400Lx-800Lx，18-22℃)下可以在15分钟内钻入自然土壤中，说明蚯蚓生长健康；如果15分钟内没有钻入自然土壤中，说明蚯蚓不活泼或生长不良，需要更换新的健康蚯蚓重新放入。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1)中，所述自然土壤的含水量为该自然土壤饱和含水量的30％-80％，优选40％-60％，最佳为50％。

自然土壤这里指的是5年内未施用过化肥或农药的非耕地土壤。土层深度为0-30cm，剔除大的石块或杂物后，过筛5mm后备用。

采用上述方案的有益效果是：自然土壤的含水量(即自然土壤的湿度)过大或过低均不利于蚯蚓在密闭环境中的存活。从而会影响检测结果的准确性。合适的自然土壤的含水量，可以保证蚯蚓可以自然存活4周(即4w)以上。尽可能的排除外生存条件对蚯蚓致死的影响。试验应调节自然土壤的相对含水量至30.0％-80.0％，在40.0％-60.0％范围内更好，最佳为50.0％。

进一步，步骤1)中，按照下述的比例加入自然土壤：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入自然土壤的重量为100g-4000g。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的比例，一方面有利于保证蚯蚓在空白对照自然土壤中正常存活,另一方面确保熏蒸剂发挥最佳的熏蒸效果,如果自然土壤过多，容易导致密闭容器中空气不足,从而导致蚯蚓非正常死亡问题，如果熏蒸装置容积过大，容易导致熏蒸剂施药不匀,从而导致室内熏蒸过程中药剂扩散不匀问题。

进一步，步骤2)中，按照下述的比例加入蚯蚓：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入5-30条蚯蚓。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的比例，有利于蚯蚓在合适的密度下生存，如果熏蒸装置容积过大，容易导致熏蒸剂施药不匀,从而导致室内熏蒸过程中药剂扩散不匀问题；如果蚯蚓数量过多，容易导致蚯蚓因生存空间不足相互竞争引发非正常死亡问题。

进一步，步骤2)中，温度为18℃-22℃。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的温度，可以避免蚯蚓因培养温度的不合适失水死亡，从而使检测结果更加准确。

进一步，步骤2)中，光照强度为400Lx-800Lx。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的光照强度，可以避免蚯蚓因光照强度的不合适导致意外死亡，从而使检测结果更加准确。

进一步，步骤3)中，熏蒸处理的时间为3-21天。

采用上述方案的有益效果是：合适的熏蒸处理的时间有利于提高检测结果的准确性；如果时间过长，蚯蚓因养分不够或其他条件死亡，使检测的蚯蚓的死亡率偏高；如果时间过短，熏蒸剂还没有来的及发挥作用，使检测的蚯蚓的死亡率偏低。

进一步，根据死亡率判断熏蒸剂的急性毒性的具体标准为：剧毒，致死中浓度LC₅₀≤0.1mg a.i./Kg_干土；高毒，0.1mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤1.0mg a.i./Kg_干土；中毒，1.0mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤10mg a.i./Kg_干土；低毒，LC₅₀>10mg a.i./Kg_干土。其中，mg a.i./Kg干土指的是每千克干土中熏蒸剂有效成分的含量(mg)。LC₅₀是指半数致死浓度，即暴露周期内，杀死50％受试蚯蚓的含有受试物质的有效成分的浓度，即每千克干土中熏蒸剂有效成分的质量。

进一步，所述蚯蚓选自赤子爱胜蚯蚓、日本杜拉蚓、无锡杜拉蚓、直隶环毛蚓、湖北环毛蚓、透明环毛蚓、状重环毛蚓、夏威环毛蚓、白颈环毛蚓、舒脉环毛蚓、毛利环毛蚓中的任一种或几种。

进一步，所述熏蒸剂为固体类熏蒸剂，所述熏蒸剂选自棉隆微粒剂、氯化苦缓释颗粒剂或氰氨化钙缓释颗粒中的任一种或几种。

本发明提供一种实现上述用于评价固体熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的方法的装置，包括：温控装置、光源装置和熏蒸装置，所述温控装置用于控制整个装置所在环境的温度，所述光源装置位于熏蒸装置的上方，为整个装置提供光源；所述熏蒸装置内部可用于盛放自然土壤，自然土壤用于放置蚯蚓；

所述熏蒸装置包括容器盖和容器主体，容器盖盖合在容器主体的开口处，容器盖可以打开或密闭容器主体。

采用上述方案的有益效果是：本发明所述的装置具有评价结果准确可靠，而且重复性高等优点。温控装置和光源装置为蚯蚓提供合适的培养条件，排除因条件不适导致的蚯蚓意外死亡。

在使用时，容器盖可以密闭容器主体，有利于保证熏蒸的效果更加准确，同时避免熏蒸剂从熏蒸装置逸出对试验操作人员的健康产生威胁。本发明的装置对试验操作人员安全、操作简便快捷而且成本低廉等优点。

进一步，还包括组合架，所述组合架分成上下设置的多层，每层均放置有多个熏蒸装置，光源装置为多个，多个光源装置分别固设在每层的组合架上。

采用上述方案的有益效果是：通过组合架的设置可以在有限的空间内设置多个实验组和对照组，可以保证实验结果的准确性。

多个光源装置分别固设在每层的组合架上，可以保证每个熏蒸装置的光照条件是相同的，避免因光照不均导致的实验误差。

进一步，组合架为铁制或不锈钢制。

采用上述方案的有益效果是：具有结实、耐用且不生锈的优点。

进一步，当容器盖密闭容器主体时，容器盖与容器主体的连接处通过油脂类物质密封。

采用上述方案的有益效果是：可以进一步提高密封效果。

进一步，所述密封时用的油脂类物质为白凡士林或黄凡士林。

采用上述方案的有益效果是：进一步提高密封效果。

进一步，所述熏蒸装置为透明玻璃制的广口瓶或普通干燥器。

采用上述方案的有益效果是：采用透明玻璃的材质的熏蒸装置有利于熏蒸过程中随时观察到药剂处理后蚯蚓的行为症状,比如从自然土壤中逃逸、在自然土壤表面腐烂或在容器内壁乱爬等。

进一步，所述自然土壤的含水量为该自然土壤的饱和含水量的30％-80％，优选40％-60％，最佳为50％。

进一步，熏蒸装置的容积与自然土壤的重量的关系为：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入自然土壤的重量为100g-4000g。

进一步，熏蒸装置的容积与与蚯蚓的数量的关系为：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入5-30条蚯蚓。

本发明所述装置适用于各种蚯蚓，例如：所述蚯蚓选自赤子爱胜蚯蚓、日本杜拉蚓、无锡杜拉蚓、直隶环毛蚓、湖北环毛蚓、透明环毛蚓、状重环毛蚓、夏威环毛蚓、白颈环毛蚓、舒脉环毛蚓、毛利环毛蚓中的任一种或几种。

本发明所述装置适用于各种固体熏蒸剂，例如：所述固体熏蒸剂选自棉隆微粒剂、氯化苦缓释颗粒剂或氰氨化钙缓释颗粒中的任一种或几种。

附图说明

图1为本发明所述一种用于室内评价固体类土壤熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的装置的结构示意图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1、温控装置，2、光源装置，3、组合架，4、容器盖，5、容器主体，6、自然土壤，7、蚯蚓。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一种用于评价固体熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的方法，包括以下步骤：

1)将自然土壤置于熏蒸装置中；

2)调节温度和光照强度，将多个蚯蚓放在步骤1)的自然土壤的表面；

3)待蚯蚓全部钻入自然土壤中后，将固体熏蒸剂均匀混布到自然土壤中；将熏蒸装置密封，之后进行熏蒸处理；

4)调查蚯蚓的死亡情况，并计算蚯蚓的死亡率，根据蚯蚓的死亡率来评价熏蒸剂对蚯蚓急性毒性。

上述方法中，各步骤具体的控制参数如下：

步骤1)中，所述自然土壤的含水量为该自然土壤饱和含水量的30％-80％，优选40％-60％，最佳为50％。步骤1)中，按照下述的比例加入自然土壤：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入自然土壤的重量为100g-4000g。

步骤2)中，按照下述的比例加入蚯蚓：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入5-30条。步骤2)中，温度为18℃-22℃。步骤2)中，光照强度为400Lx-800Lx。

步骤3)中，熏蒸处理的时间为3-21天。

上述方法中，根据死亡率判断熏蒸剂的急性毒性的具体标准为：剧毒，致死中浓度LC₅₀≤0.1mg a.i./Kg_干土；高毒，0.1mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤1.0mg a.i./Kg_干土；中毒，1.0mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤10mg a.i./Kg_干土；低毒，LC₅₀>10mg a.i./Kg_干土。

本发明还提供一种实现上述方法的用于室内评价固体类土壤熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的装置。

如图1所示，一种用于室内评价固体类土壤熏蒸剂对蚯蚓急性毒性的装置包括：温控装置1、光源装置2和熏蒸装置，熏蒸装置包括容器盖4和容器主体5，容器盖4盖合在容器主体5的开口处，容器盖4可以打开或密闭容器主体5；所述温控装置1用于控制整个装置所在环境的温度；所述光源装置2位于容器的上方，为整个装置提供光源；所述熏蒸装置内部盛有已人工调节至合适含水量的自然土壤6，自然土壤6可放置一定数量健康并生长一致的蚯蚓7，熏蒸装置用油脂类物质密封。温控装置1可以为温箱或温室，光源装置2可以为灯棍或灯泡等室灯。

为了进一步提高空间的利用率以及方便在同一批次设置多个样品的检测，上述装置还包括组合架3，所述组合架3分成上下设置的多层，每层均放置有多个熏蒸装置，光源装置为多个，多个光源装置分别固设在每层的组合架上。在具体设置组合架3时，组合架3为铁制或不锈钢制。组合架3包括顶板、底板以及位于顶板和底板之间的多个隔板。多个隔板沿着竖直方向设置。每个隔板以及底板均放置有多个熏蒸装置。光源装置固定在顶板处以及隔板处。凡是有熏蒸装置的一层均有一个光源装置，保证光源装置能够照射到熏蒸装置，并且每层熏蒸装置得到光照是相同的。

为了进一步提高分离效率，所述熏蒸装置为透明玻璃制的广口瓶或普通干燥器,容积为0.3L-5L,密封用油脂类物质为白凡士林或黄凡士林；所述自然土壤的重量为100g-4000g；温控装置1提供的温度为18℃-22℃；光照强度为400Lx-800Lx。

结合上述的装置，在进行用于室内评价固体类土壤熏蒸剂对蚯蚓急性毒性时,具体操作步骤为：

1)人工调节提前风干的自然土壤至该自然土壤饱和含水量的30％-80％，优选40％-60％，最佳为50％，其中自然土壤中的水为蒸馏水或去离子水，之后称取一定重量的上述自然土壤至熏蒸装置的容器主体中，按照下述的比例加入自然土壤：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入自然土壤的重量为100g-4000g；

2)开启温控装置和光源装置，调节温度，使温度为18℃-22℃，调节光源使光照强度为400Lx-800Lx，之后挑选一定数量健康并生长一致的蚯蚓放在自然土壤的表面，按照下述的比例加入蚯蚓：每0.3L-5L容积的熏蒸装置加入5-30条蚯蚓；

3)待蚯蚓全部钻入自然土壤6中后，准确称取一定重量的固体熏蒸剂均匀到自然土壤6中，之后迅速用油脂类物质将熏蒸装置密封；之后进行熏蒸处理，熏蒸处理的时间为3-21天；

4)熏蒸结束后，打开熏蒸装置调查蚯蚓的死亡情况，并计算蚯蚓的死亡率，根据蚯蚓的死亡率来评价熏蒸剂对蚯蚓急性毒性。

根据死亡率判断熏蒸剂的急性毒性的具体标准为：剧毒，致死中浓度LC₅₀≤0.1mg a.i./Kg_干土；高毒，0.1mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤1.0mg a.i./Kg_干土；中毒，1.0mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤10mg a.i./Kg_干土；低毒，LC₅₀>10mg a.i./Kg_干土。

本发明所述的装置和方法适用于各种蚯蚓，例如：赤子爱胜蚯蚓、日本杜拉蚓、无锡杜拉蚓、直隶环毛蚓、湖北环毛蚓、透明环毛蚓、状重环毛蚓、夏威环毛蚓、白颈环毛蚓、舒脉环毛蚓、毛利环毛蚓中的任一种或几种。

本发明所述的装置和方法适用于各种固体类熏蒸剂，例如：棉隆微粒剂、氯化苦缓释颗粒剂或氰氨化钙缓释颗粒中的任一种或几种。

下面以赤子爱胜蚯蚓为例进行具体介绍。

实施例1

以赤子爱胜蚯蚓(Eisenia foetida)为例，利用上述装置评价了固体土壤熏蒸剂质量百分数为98％的棉隆微粒剂对蚯蚓的急性毒性，具体如下：

1)人工调节提前风干的自然土壤至饱和含水量的50.0％，分别称取1000g上述自然土壤置于容积为2.5L的普通干燥器中；

2)调节温度为18℃；光照强度为400Lx。每容器中放入15条生长健康一致的环带明显的赤子爱胜蚯蚓；

3)待蚯蚓全部钻入自然土壤中后，按照设置的梯度浓度12.0、6.0、3.0、1.5、0.75、0.38、0.19mg ai/kg_干土分别将相应质量的棉隆微粒剂(因制剂实际称量太低，此处需要提前采用石英砂对棉隆制剂稀释100倍后混匀备用)均匀混布到自然土壤中，之后迅速涂抹凡士林并密闭容器，并设置添加石英砂对照处理和未做任何处理的空白对照，每个处理4次重复；

4)分别于熏蒸处理1w、2w后，调查蚯蚓的死亡率；

5)使用DPS软件对毒力回归方程进行拟合，求LC₅₀和LC₉₀值，具体数据见表1和表2。

表1

表2

通过试验可以发现：1)石英砂对照处理和空白对照处理蚯蚓死亡率在1w、2w均为0.0％，说明该方法可以很好的保证蚯蚓的自然存活；2)通过死亡率调查和毒力回归方程进行拟合后发现相关系数r分别为0.94和0.95，说明拟合较好。同时可以分别得到98％的棉隆微粒剂对赤子爱胜蚯蚓在1w和2w的LC₅₀和LC₅₀值分别为0.90和0.77mg ai/Kg_干土，属于高毒性。

根据表1和表2中的数据可以看出，本发明所述的装置和方法具有评价结果准确可靠而且重复性好，同时操作简便快捷，对操作人员安全等优点。

实施例2

发明人在实施例1的基础上，调整了熏蒸装置的容积为0.3L，自然土壤的重量为100g，蚯蚓的数目为5条。培养温度为22℃，光照强度为800Lx，熏蒸时间为3天。其余操作均与实施例1相同。

实施例3

发明人在实施例1的基础上，调整了熏蒸装置的容积为5L，自然土壤的重量为4000g，蚯蚓的数目为30条。培养温度为20℃，光照强度为500Lx，熏蒸时间为21天。其余操作均与实施例1相同。

经实施例2和实施例3的验证，也能得到与实施例1类似的结果。综上所述，本发明所述的装置和方法均具有评价结果准确可靠而且重复性好，同时操作简便快捷，对操作人员安全等优点。

发明人还进一步提供了下面的实施例来证明本发明所述方法的优越性。

以赤子爱胜蚯蚓(Eisenia foetida)为例，利用上述装置，评价不同自然土壤湿度对蚯蚓存活的影响，具体如下：

1)人工调节提前风干的自然土壤至系列湿度：调节后的自然土壤分别为自然土壤饱和含水量的100％、90.0％、80.0％、70.0％、60.0％、50.0％、40.0％、30.0％、20.0％、10.0％，分别称取1000g上述自然土壤置于容积为2.5L的普通干燥器中，每个处理4次重复；

2)调节温度为18℃-22℃；光照强度为400Lx-800Lx。每容器中放入15条生长健康一致的环带明显的赤子爱胜蚯蚓；

3)待蚯蚓全部钻入自然土壤中后，之后涂抹凡士林密闭容器；

4)分别于熏蒸处理2w、4w、6w、8w后，调查蚯蚓的死亡率，具体试验数据见表3。

表3

试验结果表明:湿度过大或过低均不利于蚯蚓在密闭环境中的存活。在4w时，30.0％-80.0％的相对含水量处理蚯蚓死亡率均为0.0％，其余处理的死亡率均超过10％；在6w时，只有40.0％-60.0％的相对含水量处理的蚯蚓死亡率低于10％，其余处理的蚯蚓死亡率均高于10％，其中50.0％的相对含水量处理的蚯蚓死亡率最低，仍为0.0％；在8w时，只有50.0％的相对含水量处理的蚯蚓死亡率低于10％，其余处理的蚯蚓死亡率均高于10％。因为药剂对蚯蚓急性毒性试验通常进行1w和2w进行调查。为保证试验方法的可靠性，只有保证蚯蚓可以自然存活4w，因此，试验应调节自然土壤的相对含水量至30.0％-80.0％，优选40.0％-60.0％，最佳为50.0％。

发明人也采用了其他种类的固体熏蒸剂，例如氯化苦缓释颗粒剂或氰氨化钙缓释颗粒，发现具有评价结果准确可靠而且重复性好，同时操作简便快捷，对操作人员安全等优点。

发明人也采用了其他种类的蚯蚓进行试验，例如：日本杜拉蚓、无锡杜拉蚓、直隶环毛蚓、湖北环毛蚓、透明环毛蚓、状重环毛蚓、夏威环毛蚓、白颈环毛蚓、舒脉环毛蚓、毛利环毛蚓等，也能得到类似的结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。