长非编码rna及在作为调控神经干细胞增殖和分化中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生理和生物医学领域，涉及一种长非编码RNA及在作为调控神经干细胞 增殖和分化中的应用。
【背景技术】
[0002] 人类和小鼠大脑皮层的正常发育，依赖于神经干细胞（neuralstemcell,NSC) 和神经祖细胞（neuralprogenitor)的精确增殖、分化，及神经元的生成。这个过程需 要精确的分子调控。神经干细胞的增殖、分化对大脑的正常发育至关重要，与大脑的功 能戚戚相关。遗传和环境因素可以引起基因突变，导致大脑发育畸形。例如，多小脑回 症（polymicrogyria)是由许多的小的脑回（gyri)引起的。患者一般有癫痫，智障和运 动障碍。和神经祖细胞分裂相关基因的突变，例如orphanGprotein-coupledreceptor 56(GPCR56)的突变，被证明和多小脑回症相关。又如，小脑症（microc印haly)的显著特 征是婴儿大脑尺寸明显减小。患者一般身材矮小，有智障和语言障碍。控制神经干细胞、 祖细胞扩增的基因发生突变是引起小脑症的主要原因。例如ASPM(abnormalspindle protein-like,microcephalyassociated)的突变已被检测出。由此可见，阐释神经干细 胞、祖细胞增殖、存活、分化的分子机制，将有助于揭示大脑皮层的正常发育机理，并探寻大 脑发育畸形的病因。
[0003] 那么什么分子机制可能调控神经干细胞、祖细胞的增值和分化哪？长期以来，人 们的研究对象一直是蛋白质编码基因（proteincodinggenes)。近几年的最新研究成果 显示，非编码RNAs(noncodingRNAs)同样起着举足轻重的作用，尤其是长非编码RNA(long noncodingRNA,IncRNA)。长非编码RNA-般长度大于200个核苷酸，和蛋白编码基因的表 达没有明显区别，只是没有合成蛋白质的能力。目前的研究显示，长非编码RNA可以在细 胞核和细胞质中行使功能，在特异的细胞中表达，参与基因的转录调控。但人们对长非编码 RNA的作用机制，依然不清楚。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种长非编码RNA及在作为调控神 经干细胞增殖和分化中的应用。研究神经分化的分子机制，可以诱导神经干细胞定向分化 成特异性的神经元，用于治疗神经系统疾病。我们筛选了在小鼠胚胎神经干细胞中表达的 长非编码RNA:Sox2ot(Sox2overlappingtranscript)。我们首次发现Sox2ot促进神经干 细胞的分化，产生更多神经元。本申请发现，长非编码RNA对神经干细胞增值和分化发挥重 要作用。我们发现长非编码RNA在神经干细胞中表达。当过表达长非编码RNA时，会引起 神经干细胞、神经祖细胞增值减少，导致神经干细胞分化，产生更多神经元。这些研究表明， 和蛋白质编码基因一样，长非编码RNA在神经发生中起重要作用，可以用于诱导神经分化。 因此，Sox2ot可以作为诱导神经分化的新手段。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 第一方面，本发明提供一种长非编码RNASox2ot，其基因组序列如SEQIDNo. 2所 不。
[0007] 所述长非编码RNASox2ot在小鼠基因组中和SEQIDNo. 1所示的Sox2基因序列 重叠：Sox2基因是在胚胎干细胞、神经干细胞中高表达的基因。Sox2能够促进干细胞增值， 保持干细胞处于分裂状态。有意义的是，长非编码RNASox2ot和Sox2在小鼠胚胎大脑皮层 表达较高（图1)。另外，长非编码RNASox2ot在基因组中和Sox2重叠，并按同一个方向转 录（图2)。这说明Sox2ot很可能调控Sox2的表达，并参与干细胞增值和分化的调控。
[0008] 第二方面，本发明提供一种所述长非编码RNASox2ot在调控神经干细胞发育中的 应用。
[0009] 第三方面，本发明提供一种用所述长非编码RNASox2ot调控神经干细胞发育的方 法，所述方法包括：原位杂交（insituhybridization)的方法用以验证Sox2ot在大脑皮 层中表达的部位及细胞。
[0010] 为确定Sox2ot是否和Sox2 -样也对神经干细胞发育起作用，我们采用原位杂交 的方法检测了Sox2ot和Sox2在小鼠胚胎13. 5和15. 5天大脑中的表达状态。我们发现 Sox2表达于神经干细胞集中的皮层脑室区（ventricularzone,VZ)(图3)。和Sox2相似， Sox2ot也表达在皮层脑室区。我们的结果表明Sox2ot和Sox2可能有相近的功能，同样调 控神经干细胞发育。
[0011] 第四方面，本发明提供一种所述长非编码RNASox2ot在诱导神经干细胞分化中的 应用。
[0012] 第五方面，本发明提供一种用所述长非编码RNASox2ot诱导神经干细胞分化的方 法，所述方法包括：小鼠胚胎电转的方法。即在胚胎期小鼠的脑室内注射DNA，通过电击的 方法，使Sox2ot外源DNA表达在大脑皮层的神经干细胞中。
[0013] 我们进一步探索了在大脑发育中Sox2ot的功能。通过小鼠胚胎电转的方法，我 们在胚胎13. 5天大脑皮层中过表达Sox2ot，然后观察胚胎14. 5天大脑皮层中神经干细胞 的发育。我们发现，当用BrdU标记处于分裂状态的神经干细胞、神经祖细胞时，在过表达 Sox2ot的小鼠大脑皮层中，BrdU阳性细胞数明显减少。进一步的，Sox2标记的神经干细胞 数，也因过表达Sox2ot而明显减少（图4)。我们的结果表明：和Sox2的作用相反，Sox2ot 的功能是促进神经干细胞分化。
[0014] 第六方面，本发明提供一种所述长非编码RNASox2ot在促进神经元生成中的应 用。
[0015] 第七方面，本发明提供一种用所述长非编码RNASox2ot促进神经元生成的方法， 所述方法包括：小鼠胚胎电转的方法。即在胚胎期小鼠的脑室内注射DNA，通过电击的方 法，使Sox2ot外源DNA表达在大脑皮层的神经干细胞中。之后，让神经干细胞在体内继续 发育4天，标记神经元的生成。
[0016] 通过小鼠胚胎电转的方法，我们在胚胎13. 5天大脑皮层中过表达Sox2ot，然后检 测胚胎17. 5天大脑皮层中神经元的生成（图5A)。我们发现，Tbrl和Satb2标记的新生神 经元数量均显著升高（图5)。我们的结果表明：Sox2ot的功能是促进神经元生成。
[0017] 第八方面，本发明提供了一种所述长非编码RNASox2ot在开发检测影响大脑早期 发育基因的临床诊断试剂以预防小脑症发生中的应用。
[0018] 本专利将对基础研究和进一步的临床应用具有现实意义。人类小脑症的病因是由 于大脑神经干细胞、神经祖细胞数目的减少，新生神经元生成的降低。诱导神经干细胞扩 增，促进神经元生成将是治疗小脑症的有效手段。与现有技术相比，本发明具有如下的有益 效果：
[0019] 从技术层面上，本申请发现了调控神经干细胞发育的长非编码RNASox2ot，并首次 确认了它在神经元生成中的促进作用。这些发现将有助于我们从体内水平直接改变长非编 码RNASox2ot的表达，以影响神经干细胞发育。从临床角度上，通过探索非编码RNASox2ot 在神经干细胞中的作用，有助于我们进一步开发检测影响大脑早期发育的基因的临床诊断 试剂，以预防小脑症发生。进一步地，由于非编码RNA易于在体外合成和干预它的表达水 平，我们可以直接利用非编码RNA调控神经干细胞的增殖和分化。这将为临床上开发应用 神经干细胞治疗人类神经系统疾病，提供新的疗法和技术手段。
【附图说明】
[0020] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0021] 图1、Sox2和长非编码RNAS〇x2〇t在胚胎期小鼠大脑皮层中表达量较高。
[0022] 图2、长非编码RNASox2ot在小鼠基因组中和Sox2重叠，并转录方向一致；
[0023] 图3、原位杂交结果显示，Sox2和Sox2ot表达在小鼠胚胎13. 5和15. 5天大脑皮 层脑室区，神经干细胞集中的区域；
[0024]图4、在小鼠大脑皮层中过表达Sox2ot(Sox2ot_0E)，诱导神经干细胞分化，引起 BrdU和Sox2标记的细胞数减少；
[0025]图5、在小鼠大脑皮层中过表达Sox2ot(Sox2ot-0E)，引起Tbrl和Satb2标记的细 胞数升高，诱导神经元生成。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0027] 实施例1
[0028] 本申请所述长非编码RNASox2ot在小鼠基因组中和SEQIDNo. 1所示的Sox2基因 序列重叠：首先，我们通过解剖，收集了BL6小鼠胚胎期12. 5天、15. 5天，和出生后0天及成 年的大脑皮层组织[1]。利用Trizol我们提取了RNA，进行了RNA反转录PCR分析（RT-PCR)
[1]。我们设计了扩增Sox2ot和Sox2基因的PCR引物。它们的序列如下：
[0029]Sox2ot:F:5'-TGCTACAAGACAACACCCTGA-3'（SEQIDNo. 3)，
[0030] R:5, -GTTGCCTGGCTTCTCTTTTG-3,(SEQIDNo. 4)；
[0031]Sox2 :F:5'-TACAGCATGTCCTACTCGCA-3'（SEQIDNo. 5)，
[0032] R:5,-TGGAGTGGGAGGAAGAGGTA-3'（SEQIDNo. 6)。
[0033] 通过RNA反转录PCR分析比对Sox2ot和Sox2在不同发育时期的表达水平，我们 检测到转录因子Sox2和非编码RNASox2ot在小鼠胚胎期12. 5天和15. 5的大脑皮层组织 中呈现较高表达（图1)。这两个基因在胚胎期的较高表达说明它们可能调控神经干细胞和 神经祖细胞的发育。
[0034] 进一步通过基因注释和基因序列的比对[2]，我们发现长非编码RNASox2ot和转 录因子Sox2位于小鼠基因组第3号染色体上。Sox2ot基因由5个外显子组成，转录产物 约3000bp。Sox2基因由一个外显子组成，转录产物约2500bp。Sox2基因在基因组中位于 Sox2ot的内含子中，和Sox2ot重叠，并按同一个方向转录（图2)。由于Sox2基因在胚胎 干细胞、神经干细胞中高表达，并能够促进干细胞增值，这说明Sox2ot很可能调控Sox2的 表达，也参与在干细胞增值和分化的调控过程中。
[0035] 实施例2
[0036] 我们发现Sox2ot在小鼠胚胎神经干细胞中表达：为确定Sox2ot是否和Sox2 -样 也对神经干细胞发育起作用，我们采用原位杂交（insituhybridization)的方法检测了 Sox2ot和Sox2在小鼠胚胎13. 5和15. 5天大脑中的表达状态[3]。通过RNA体外合成的 方式，我们分别合成了DIG-标记的Sox2ot和Sox2的探针（probe)(图2) [2]。
[0037] Sox2ot探针的序列如下：
[0038] 5?cagcaaatggaaaatgaggtctttcttagttgcacaagagatgtctgaactctcagaccaaagcc atcaaccagattctcttaagcggatcttgaggaaagtacaatttctaggttcgatctcggagttgagagctttct tctgtaatatgtctgttgcctggcttctcttttgcgtgtaccagctgcagagattttccgatttgggactacagg cttggacccgcggcgaccatgccagatcagggtgttgtcttgtagcagtttgattggcaggtaaaaagcactgaa cgtgaaggctccggagcctctc