LTURE培养基(为市售的UItraCULTURE培养基)中，使终浓度分别为4nmo 1/L、254区凡、10(^8凡、101111]101凡，置于37°(^孵育半个小时即可。
[0022]实施例2:—种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基含有以下组成:
活化素A2nmol/L
表皮生长因子20yg/L
β-神经生长因子80yg/L
尼克酰胺5mmol/L
UItraCULTURE培养基余量。
[0023]上述培养基的制备:先将活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子、尼克酰胺、加入到UI traCULTURE培养基(为市售的UItraCULTURE培养基)中，使终浓度分别为2nmo 1/L、204区凡、8(^8凡、51111]101凡置于37°(^孵育半个小时即可。
[0024]实施例3:—种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基含有以下组成:
活化素A6nmol/L
表皮生长因子30yg/L
β-神经生长因子120yg/L
尼克酰胺15mmol/L
UItraCULTURE培养基余量。
[0025]上述培养基的制备:先将活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子、尼克酰胺、加入到UI traCULTURE培养基(为市售的UItraCULTURE培养基)中，使终浓度分别为6nmo 1/L、30yg/L、120yg/L、15mmol/L，置于37°C孵育半个小时即可。
[0026]实施例4:组织块培养技术获得人脐带间充质干细胞
取新生儿脐带，通过下述步骤分离获得脐带间充质干细胞，分离操作步骤如下:
(1)按照无菌操作的要求，将取回的脐带通过传递窗送入细胞培养房；
(2)在超净工作台内打开装有脐带的无菌瓶，倒入PBS，使其没过脐带。用平口镊子夹住脐带一端，慢慢清洗脐带。然后用镊子将脐带取出，放入灭菌的无菌瓶，重新加入新鲜的PBS继续清洗，洗至尽量去除所有血块；
(3)用剪刀将脐带剪成2-3cm的小段。将其放在装有PBS的50 ml离心管中第三次清洗。清洗完后将其放在培养皿上，横向夹住脐带组织，明显可见2条脐动脉和I条脐静脉，纵向剖开脐带，露出血管，将血管从周围组织剔除；
(4)将脐带组织漂洗干净，用剪刀将脐带剪成1-1.5mm3的小块；
(5)以1-1.5mm的小块接种于含有lOmlUItraCULTURE培养基的T-75培养瓶中；
(6 )放入37 0C、5%C02培养箱中培养；
(7)培养期间尽量不要移动瓶，于一周后首次换培养液并在显微镜下观察细胞生长情况；
(8)如果细胞长得比较密集，可将组织块去除，让其继续生长一至两天后传代；如果细胞
数量较少，可在培养板中补加一定量的培养液，让其继续生长；
(9)以后每3天换一次液，每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况；
(10)当细胞长到约80%-90%融合时可将其用0.25%的胰酶消化下来，进行传代扩大培养，获得脐带间充质干细胞。
[0027]将通过组织方法从脐带中分离获得的间充质干细胞，流式细胞仪鉴定其表面标记，确定其属于间充质干细胞。
[0028]实施例5:诱导脐带间充质干细胞分化为神经样细胞:
通过组织块方法从脐带中分离获得间充质干细胞，传至将第三代，使用上述实施例1所述的培养基诱导培养，在UltraCULTURE培养基中加入4 nmol/L活化素A，25yg/L表皮生长因子，100yg/L β-神经生长因子，10 mmol/L尼克酰胺，培养至14d。以UItraCULTURE培养的脐带间充质干细胞作为阴性对照。每三天换一次液，培养14天后即可获得神经样细胞。
[0029]细胞形态学的变化:脐带间充质干细胞在向神经细胞分化的过程中细胞形态发生了一系列变化。未分化的脐带间充质干细胞成梭型;而诱导培养7d后，部分脐带间充质干细胞成神经纤维样;随着诱导培养时间的增加，更多的细胞形态开始变化;分化培养14d后，间充质干细胞的形态变为典型的神经样细胞(参见图2)。
[0030]脐带间充质干细胞表面标志的检测:取第3代人脐带间充质干细胞，PBS液洗涤细胞后，流式检测管中加入细胞数为5 X 15/管，再分别加入鼠抗人单克隆抗体⑶44、CD90、CD105、CD14、CD34、HLA-DR各1ul/管，常温避光静置15min，roS液洗涤细胞，流式细胞仪检测其表型(参见图1)。
[0031]流式细胞术检测了诱导前、诱导7d以及诱导培养14d后的细胞巢蛋白表达。发现在诱导培养的过程中，细胞的巢蛋白表达逐渐增高，说明间充质干细胞诱导神经样细胞具有巢蛋白分泌功能(参见图3)。
【主权项】
1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基，其特征在于:该培养基含有以下组分: 活化素A2?6nmol/L 表皮生长因子20?30yg/L β-神经生长因子80?120yg/L 尼克酰胺5?15mmol/L UItraCULTURE培养基 余量。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于:该培养基含有以下组分: 活化素A4nmol/L 表皮生长因子25yg/L β-神经生长因子100yg/L 尼克酰胺10mmol/L UItraCULTURE培养基 余量。3.—种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的方法，包括以组织块法提取人脐带间充质干细胞进行分离培养，将人脐带间充质干细胞用权利要求1?2任一所述的培养基进行诱导培养，诱导培养14天即可获得神经样细胞。4.权利要求3所述的诱导方法，其中所述分离培养的具体步骤为:在无菌条件下，将剔除脐带动静脉血管的脐带剪碎，至直径小于1.5mm脐带组织块，然后接种于T75cm培养瓶中，加入UItraCULTURE培养液1ml，置于5 % C02、37°C培养箱内培养，获得脐带组织间充质干细胞。5.权利要求3所述的诱导方法，其中所述分阶段定向诱导的具体步骤为:在UltraCULTURE培养基中加入4 nmol/L活化素A，25yg/L表皮生长因子，100yg/L β-神经生长因子，10 mmol/L尼克酰胺，培养至14d。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:诱导培养14天后即可获得神经样细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基及其诱导方法。该培养基含有活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子、尼克酰胺的UltraCULTURE培养基。该诱导方法为：采用上述诱导培养基对间充质干细胞进行诱导分化培养即可。本发明诱导培养基含有简单的诱导因子，不含有毒有害物质，更安全。本发明诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的方法，7天可获得神经纤维样细胞，14天可获得部分成熟分化的神经样细胞，建立了规范的、新颖的诱导方法，具有广阔的临床应用前景。
【IPC分类】C12N5/0775, C12N5/079
【公开号】CN105624115
【申请号】CN201510872905
【发明人】王意忠, 崔晓兰, 时瀚, 申义, 山霞
【申请人】王意忠
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月3日