用于培养树突状细胞的诱导剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种用于培养树突状细胞的诱导剂及其应 用。
【背景技术】
[0002] 细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传 统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有 发展前途的一种治疗手段，也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。
[0003] 细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增 多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变 的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。目前在 临床中使用最多的细胞免疫治疗疗法主要是DC治疗、CIK治疗和DC-CIK联合免疫治疗。
[0004] DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)， 一方面，其能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答;另一方面，树突状细胞还能够呈递抗 原给MHC-I类限制性CD8+和MHC-II类限制性CD4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为 "天然免疫佐剂"，因此，树突状细胞在诱导免疫应答中具有独特的地位。
[0005] 近年来，以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已 取得较大进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临 床应用前景。目前，从外周血单个核细胞(PBMC)经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基 本得到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，国内主要采用TNF-a因子，但该方 法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度 上限制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步 完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术培养出的树突状细胞体外诱导成熟 率低，细胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一种能够提高树突状细胞成熟率及抗 原提呈性能的用于培养树突状细胞的诱导剂及其应用。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种用于培养树突状细胞的诱 导剂，包括rhTNF-α和，番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。
[0008] 在本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂中，所述rhTNF-a的浓度为800~ 1200U/ml和，番茄脂溶性提取物的浓度为5~15μg/ml或所述番茄水溶性提取物的浓度为5 ~15μg/ml〇
[0009] 在本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂中，所述rhTNF-a的浓度为1000U/ ml和，番茄脂溶性提取物的浓度为lOμg/ml或所述番茄水溶性提取物的浓度为10μg/ml。 [0010]在本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂中，所述rhTNF-a的浓度为800U/ml 和，番茄脂溶性提取物的浓度为5μg/ml或所述番茄水溶性提取物的浓度为5μg/ml。
[0011]在本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂中，所述rhTNF-α的浓度为1200U/ ml和，番茄脂溶性提取物的浓度为15μg/ml或所述番茄水溶性提取物的浓度为15μg/ml。本 发明还提供了上述用于培养树突状细胞的诱导剂在培养树突状细胞成熟过程中的应用。 [0012]实施本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂及其应用，可以达到以下有益效 果:与现有培养树突状细胞的诱导剂相比，本发明提供的DC诱导活化剂，能够促进提高树突 状细胞的细胞活性，提高树突状细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈 性。
【具体实施方式】
[0013] 本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂包括rhTNF-a(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重组人肿瘤坏死因子α)和番前脂溶性提取物;其中，可采用番 茄水溶性提取物代替番茄脂溶性提取物。
[0014] 进一步地，rhTNF-α能够刺激树突状细胞成熟，以提高树突状细胞抗原提呈能力； 优选地，rhTNF-a的浓度为800~1200U/ml。
[0015] 番茄中有活性作用的主要脂溶性化合物为类胡萝卜素等，类胡萝卜素及其他番茄脂 溶性提取物能够促进未成熟的树突状细胞的生长和增殖，抑制细胞代谢过程中产生的H 2〇2 对细胞膜的损伤，降低细胞R〇S、LPO含量，增加 SOD酶活性，减少DNA损伤，提高树突状细胞的 活性及存活率并促进其成熟。优选地，番茄脂溶性提取物的终浓度为5~15μg/ml。
[0016] 番茄脂溶性提取物的提取方法为:取新鲜番茄处理成浆状后，干燥成粉末备用。取 番茄粉末加入乙醇-正丁烷萃取液混匀，离心，收集上清液；向残留物中添加正丁烷混匀，离 心，再次收集上清液；可重复该提取步骤2~3次，然后将收集的上清液混合，用蒸馏水和 NaCl溶液清洗后，用氮气吹干即可;使用时，取番茄脂溶性提取物溶解于甲醇-甲基叔丁基 醚-水溶液，过滤备用；需要说明的是，该提取步骤全程均在避光条件下操作，以防止类胡萝 卜素氧化。
[0017] 番茄中有活性作用的主要水溶性化合物为酚类化合物等，酚类化合物能够清除细 胞代谢过程中产生的自由基，减少对细胞的损伤，提高树突状细胞的细胞活性，促进其增 殖。优选地，番茄水溶性提取物的终浓度为5~15μg/ml。
[0018] 番茄水溶性提取物的提取方法为：取番茄粉末，加入乙醇提取液，加热至40~70 °C、1~2小时，冷却后离心;于相同条件下提取残渣两次，合并上清液，过滤备用。
[0019 ]本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂，应用于培养树突状细胞的方法，包 括以下步骤：
[0020] S1、获取树突状细胞前体单个核细胞；
[0021] S2、采用第一诱导剂将树突状前体细胞当个核细胞诱导分化成未成熟树突状细 胞；
[0022] S3、采用第二诱导剂将未成熟树突状细胞诱导分化成成熟的树突状细胞。
[0023] 具体地，步骤S1中，优选地，树突状细胞前体单个核细胞来源于新鲜外周血，相比 经过冷库储存或者培养传代之后的树突状细胞，从新鲜血液中制备的树突状细胞前体单个 核细胞离体时间较短，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于保持 其免疫性能。在本发明中，树突状细胞前体单个核细胞的具体获取过程为：
[0024]抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10~20分钟后，分离获取外周血 单个核细胞；
[0025] 用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml链霉素的完全 培养基悬浮细胞浓度至(2~6) X106个/ml，孵育1~3小时，更换新的完全培养基，收集细胞 悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。
[0026] 步骤S2的具体过程为：
[0027] 取步骤S1获得的树突状细胞前体单个核细胞悬液，离心洗涤后计数，使细胞浓度 达到（1~3) X106个/ml，用完全培养基培养，并与培养当天添加第一诱导剂，培养4~7天， 每隔2~3天更换培养基。
[0028] 其中，第一诱导剂包括rhGM_CSF(Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，重组人粒-巨细胞集落刺激因子）和rhIL_4(Recombinant human interleukin 4,重组人白细胞介素4);其中，rhGM-CSF的终浓度为800~1200U/ml和 rhIL-4的终浓度为800~1200U/ml;更为优选地，rhGM-CSF的终浓度为1000U/ml，rhIL-4的 终浓度为l〇〇〇U/ml。
[0029] 第一诱导剂所含成分能够诱导树突状细胞前体单个核细胞转化为未成熟的树突 状细胞，增大细胞体积，并促进细胞的生长增殖和分化，促进细胞形成集落；同时，对已分化 的未成熟树突状细胞进行预刺激，使未成熟树突状细胞能够快速成熟。
[0030] 步骤S3的具体过程为：
[0031 ]向步骤S2a获得的未成熟树突状细胞中添加第二诱导剂培养2~4天至未成熟的树 突状细胞全部成熟;其中，第二诱导剂即为本发明提供的用于培养树突状细胞的诱导剂，该 第二诱导剂包括rhTNF-α(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重组人肿瘤坏 死因子a)和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物;且rhTNF-a的终浓度为800~1200U/ ml、番茄脂溶性提取物的终浓度为5~15μg/ml或番茄水溶性提取物的浓度为5~15μg/ml; 更为优选地，rhTNF-a的终浓度为l〇〇〇U/ml，番茄脂溶性提取物的终浓度为10μg/ml，番茄水 溶性提取物的终浓度为l〇μg/ml。
[0032]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行