专利名称：辛伐他汀在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的新用途，具体地，涉及辛伐他汀在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用。
背景技术：
心血管疾病每年夺走1200万人的生命，接近世界人口总死亡的1/4，成为人类健康的头号大敌。对于心肌梗死或心力衰竭，传统的治疗方法，包括药物、介入和外科手术均不能使缺失的心肌细胞再生，由于心肌缺失造成不可逆转的心肌重塑过程，终至心力衰竭和死亡。近年来，干细胞再生医学在心血管疾病治疗中取得了突破性进展，该技术又被称为细胞心肌成形术(cellular cardiomyoplasty)，即通过移植干细胞或心肌细胞，或者动员外周循环血干细胞或骨髓干细胞迁移到心肌受损部位来实现损伤心肌的修复。移植干细胞实施细胞心肌成形术是改善心肌梗死造成的血液动力学和神经体液紊乱的一种可行的方法。各种前期动物实验表明干细胞具有修复心肌细胞的能力，能改善梗死区的灌注和心功能[Schuster MD, Kocher AA, Seki Τ, Martens TP, Xiang G, Homma S, et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am JPhysiol Heart CircPhysiol 2004 ；287 :H525-532. (Schuster MD, Kocher AA, Seki T，Martens TP, Xiang G，Homma S等，骨髓成血管细胞引起的血管新生导致心肌细胞再生.美国生理杂志心脏和循环分册2004 ；287 :H525-532.)]。尽管干细胞被用于心肌修复的临床研究，但由于缺血/再灌注及炎性因子等的影响导致在局部缺血心脏的供体细胞死亡，因此细胞心肌成形术的发展因植入细胞存活率低而受到阻碍。研究表明大量细胞在移植入受损的心脏后死亡，其中绝大部分细胞在移植后24小时内流失，12周后仅剩下15%存活[Muller-Ehmsen J, Whittaker P, Kloner RA, Dow JS, Sakoda T, Long Tl, et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J Mol Cell Cardiol 2002 ；34 107-116. [PMID :11851351](Muller-Ehmsen J, Whittaker P, Kloner RA, Dow JS, Sakoda T,Long Tl，等.新生大鼠的心肌细胞移植入成年大鼠心肌后的生存和发育.分子细胞心脏病学杂志,2002 ；34 :107-116.)]。急性心肌梗死会导致严重的局部心肌缺血、炎症反应、氧化应激和凋亡，这将明显降低移植细胞的存活率。因此，保护局部移植的干细胞，减少或避免其死亡对临床应用具有重要意义。目前已有几种可以改善植入细胞存活率的方法(1)热休克疗法能改善移植细胞对体内缺血/再灌注损伤的耐受性，提高植入心脏后的存活率[Suzuki K, Smolensk! RT, Jayakumar J, Murtuza B, Brand NJ, Yacoub ΜΗ. Heat shock treatment enhances graft cell survival in skeletal myoblast transplantation to the heart. Circulation 2000 ；102 :111216-221. [PMID :11082390]) (Suzuki K, Smolenski RT, Jayakumar J,Murtuza B，Brand NJ,Yacoub ΜΗ.热休克疗法增强骨髓成肌细胞移植到心脏后的存活.循环.2000 ；102 :111216-221.)] ； O)Akt修饰的骨髓间质干细胞可以进一步改善梗死心脏功能[Mangi AA, Noiseux N, Kong D, He H, Rezvani M, Ingwall JS, et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med2003；9 :1195-1201. [PMID :12910262](Mangi AA, Noiseux N, Kong D，He H，Rezvani M，Ingwall JS等，Akt修饰的间充质干细胞阻止梗死心脏重构和恢复心脏功能.自然医学，2003 ；9 :1195-1201.)] ； (3)在局部缺血心肌注射质粒载体使亚铁血红素加氧酶-1过度表达，减少单核细胞浸润的数量，下调炎症因子的表达[Tang YL, Tang Y, ZhangC,Qian KP,Shen LP, Phillips I. Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia—regulated Heme Oxygenase-Ivector. J Am CollCardiol 2005 ；46 :1339-1350. [PMID :1619885]) (TangY, Zhang C, Qian KP, Shen LP,Phillips I.亚铁血红素加氧酶-1过度表达的间充质干细胞移植到缺血心脏后生存改善.美国心脏病学院杂志2005 ；46 :1339-1350.)]。但是，以上方法均建立在供体细胞水平的基础上，而决定移植细胞在心脏中的命运之关键是梗死局部心肌的微环境，因此针对梗死心肌微环境进行的干预可能更加有效的促进移植细胞的存活和发挥生物学效应。
发明内容
本发明目的是提供辛伐他汀在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用。为实现辛伐他汀在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用，可以将辛伐他汀制成胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊剂或滴丸剂。本发明优选的方案是是辛伐他汀在制备用自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病的辅助药物中的应用。本发明更优选的方案是辛伐他汀在制备用自体骨髓间质干细胞治疗心肌梗塞的辅助药物中的应用。本发明还优选为辛伐他汀在制备用自体骨髓间质干细胞治疗急性心肌梗塞的辅助药物中的应用。发明人经过大量试验研究，研究数据表明，使用辛伐他汀干预对运用自体骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用。微点阵探测梗塞后心脏的基因表达剖面发现单一使用低剂量辛伐他汀可以使基因表达产生积极变化，包括对抗炎、抗凋亡、抗纤维化基因的增量调节，因此，认为使用辛伐他汀干预能改善急性心肌梗塞后的局部微环境，从而显著提高植入的骨髓间质干细胞的存活和分化能力。进而，实验数据还证明，使用辛伐他汀干预可以有效改善急性心肌梗塞后的局部内环境，对运用自体骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用，从而对骨髓间质干细胞的移植的临床应用具有重要意义。在本发明所述辛伐他汀的应用方案中，将辛伐他汀制成胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊剂或滴丸剂中的一种，为实现这些剂型的制备，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如填充剂、崩解齐 、润滑剂、助悬齐 、粘合齐 、甜味齐 、矫味齐 、防腐齐 、基质等。填充剂包括淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括糖精钠、阿斯帕坦、 蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括甜味剂及各种香精；防腐剂包括尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括PEG6000， PEG4000,虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。为实现本发明所述应用方案，辛伐他汀的使用量推荐起始剂量为IOmg/日，剂量范围10-60mg/日，口服，每日一次。为证实辛伐他汀促进促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的作用，发明人进行了如下实验材料与方法实验动物10月龄的中华小型猪，体重(30kg±^g)，由中国农业大学实验动物中心提供。 所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。并且，所有实验方案均得到了中国医学科学院实验动物管理委员会和中国协和医科大学阜外心血管病医院实验动物伦理委员会的认可。猪骨髓间质干细胞(MSCs)的分离和培养肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉，两种药物剂量分别为25mg/kg和Img/ kg。在无菌操作下对猪的左髂嵴处备皮、铺单，用含12，500单位肝素的注射器抽取约50ml 骨髓。所有实验动物在送回饲养间之前均肌肉注射丁丙诺啡0. 3mg止痛。MSCs的分离和培养按以前报道方法略作修改。即抽取的骨髓用磷酸盐缓冲液 (PBS)稀释1倍，加入硅石胶态悬浮液(Percoll分离液，1. 077g/ml, Sigma公司)，在4°C条件下，800g离心30分钟分离出单个核细胞。细胞沉淀物用PBS冲洗2次，后以5X 105/cm2 的密度铺于正常培养基[含低葡萄糖DMEM(Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco)，100U/ml 青霉素和链霉素]上，置于37°C、含5%二氧化碳的潮湿培养箱中培养。三天后，通过更换培养基去除造血细胞、成纤维细胞和其它非贴壁细胞。保留下的贴壁的纯化骨髓间质干细胞进一步培养增殖。实验过程中每三天更换一次培养基。经过10天培养，贴壁细胞形成均一的细胞克隆。当贴壁细胞达到80%融合后，加入0. 25%胰酶-0.02% EDTA液(Sigma)使其重新悬浮，以1 3的比率传代进行进一步培养。心肌梗死模型，移植细胞的制备及本发明药物组的促进作用观头中华小型猪平均分为4组，每组7只第一组为对照组、第二组(单一使用低剂量辛伐他汀干预治疗)、第三组(单一进行MSCs移植干预治疗)和第四组(联合使用 MSCs移植和辛伐他汀干预治疗)。在MSCs达80%融合后，将其从培养瓶中分离，在含10% 胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养基中使其重新悬浮，用4'，6 二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI) (50 μ g/ml, Sigma)在37°C条件下标记30分钟。将细胞在PBS液中洗涤6次去除未结合的 DAPI，然后每个实验动物选取3X 10个细胞置于温暖的DMEM中保存数分钟后进行移植。标记过程非常重要，需确保所有的移植细胞核着色。
肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉，两种药物剂量分别是25mg/kg和Img/ kg，气管插管，连接机械呼吸机进行人工通气，通过血管内注射氯胺酮和地西泮维持麻醉。 沿胸骨正中线开胸，分离冠状动脉左前降支(LAD)至第一对角支，并用塑胶套管结扎，确保局部缺血部位的形成。冠脉结扎前静脉注射利多卡因ang/kg，后持续静脉内给药直至手术结束，持续剂量为0. 5mg/min。阻塞冠状动脉左前降支(LAD) 90分钟形成心肌梗死/再灌注模型。再灌注后30分钟，在每个实验动物的梗死区及其周边区注入自体骨髓间质干细胞(3 X IO7个细胞)悬浮液500 μ 1。对照组动物注入等体积的DMEM液。移植结束后，关闭胸腔，同时放置一个18F纵隔导管以重建胸腔内负压并引流残留血液和灌洗液。此后，停止使用麻醉剂，在适当时候拔除气管插管使伤口愈合。在没有气体渗漏或残余血液的时候拔除胸部导管。所有实验动物术后均接受抗菌治疗，肌肉注射先锋霉素VI. 0，每天两次，连续三天；同时肌肉注射丁丙诺啡止痛，每天两次，每次0. 3mg,连用三天。根据既往实验研究确定的剂量，从实施骨髓间质干细胞移植前三天至移植后四天给第二和第四组动物喂养辛伐他汀，使用剂量为0. 25mg. kg"1 · cf1。核磁共振影像(MRI)在细胞移植一周后和六周后分别采用电影MRI和增强MRI采集实验动物心功能参数。采用临床使用的配有射频接收线圈的1. 5T磁共振成像扫描机(西门子，德国(Siemens， Germany))进行核磁共振成像。肌肉注射氯胺酮和地西泮对实验动物进行麻醉，剂量分别是25mg/kg和lmg/kg。MRI采用无线心电门控自旋回波。电影MRI和相应的增强MRI每 4mm扫描一层，自二尖瓣水平开始，一共6-8层。测定横向和矢向视图以确定短轴的正确位面，每60°确定一个长轴的影像。联合使用全聚焦稳态快速梯度回波(TrueFisp)脉冲序列与敏感度编码(TSENSE)平行成像技术获取电影MRI影像。典型成像参数如下循环时间 (TR) = 41. 7ms，回波时间(TE) = 1. 39ms，带宽(Bff) = 965Hz/PX，翻转角度(FA) = 48°， 影像矩阵=109X 192，空间分辨率=3. 2mmX 2. 0mm，层厚(SL) = 6. 0mm，平行因素=3。采用TSENSE成像技术的回波成像元件来获取3-4短轴位的第一次流程灌注图像和一张四室图像(TR = 6. 0ms, TE = 1. 22ms, FA = 30°，空间分辨率=2. 8mmX 2. 8mm, SL = 10. 0mm，平行因素=2，每次心搏4-5张图像，所有的层面均为一次饱和前脉冲)。第一轮扫描获取约 60个心动周期的图像。将0. Immol Gd-DTPA(先灵公司(Schering))用2OmL 0.9% NaCl冲洗(流速4mL/s)。灌注后静脉注射0. lmmol/kg马根维显溶液，5分钟后静脉注射0. 2mmol/ kg 二亚乙基三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)，而后直接进行增强MRI摄影。使用反转恢复(PSIR) 闪光序列完成Tl加权，运用PS^技术对Tl进行调整。典型图像参数如下TR = 700ms， TE = 4. 8ms,Bff = 130kHz，平面分辨率=1. 8X1. 3mm,图像矩阵=156X 256，SL = 8mm。移植干细胞后6周再次拍摄所有电影MRI和增强MRI图像。根据解剖学定位使此次拍摄的短轴切片与第一次基线拍摄的相对应。另外，为提供健康对照，5只假手术组动物采用相同的 MRI实验设计进行研究。单光子发射计算机断层摄影(SPECT)为测定心肌灌注缺损面积，在细胞移植一周后与六周后对心肌进行单光子发射计算机断层摄影。静注99m锝-甲氧基异丁基异腈四61^(1 (SmCi)，45-60分钟后用γ照相机进行心肌断层显像。采用低能耗双探头Y照相机(法瑞克姆，通用公司(Varicum，GE))， 配有20%能量窗口的高分辨率准直器，置位于到140KeV γ峰值。每桢采集40s、32个影像， 采集矩阵64X64，投照范围从右前斜45° 左后斜45°，共180°。SPECT重建采用巴特渥斯(Butterworth)低滤波，截止频率0. 45，类型为5，通过对心脏轴进行调整，重建心脏短轴、垂直长轴、水平长轴三个轴面的图像数据。采用闪烁法的牛眼技术计算灌注缺损面积。组织学分析为检测移植的骨髓间质干细胞成心肌和血管分化潜力，对心肌冰冻组织切片进行荧光免疫分析，以5μπι厚度连续切片。检测的抗体包括血管内皮细胞特异性的因子 VIIKVffF 1 50，DAK0)、α-血管平滑肌肌动蛋白(SM-actin，1 50，DAK0)、α -横纹肌肌动蛋白(1 50，DAK0)、心脏肌钙蛋白T(cTn-T，l 50，Sigma)、缝隙连接蛋白43 (1 50， Sigma)。切片经PBS漂洗后，用罗丹明或异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠或兔IgG孵育。最后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照。测定体内移植的骨髓间质干细胞的存活和分化能力，自心尖至心底将左心室横断切成8片，每片随机选取5张5- μ m厚的冰冻切片。在荧光显微镜下，每张冰冻切片随机选取5个视野进行观察并计数对DAPI和cTn-T呈阳性的细胞。对cTn-T呈阳性的细胞被认为是分化的心肌样细胞。在梗死部位随机选取5张切片测定缝隙连接蛋白43的细胞间染色密度，并运用图像分析系统进行分析。测定梗死区及梗死周边区的毛细血管密度，组织制备方法为Weidner N, Semple JPjffelch WRjFolkman J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991 ；324 :1-8. [PMID :1701519](ffeidner N, Semple JP,Welch WR,Folkman J.侵入性乳腺癌中肿瘤血管发生和转移相关性.新格兰医学杂志， 1991 ；324 1-8.)所记载。用VWF抗体(1 200，DAK0)对切片进行染色。从每个试验动物的梗死区和梗塞周边区域分别选取5张和8张切片，由一名未参与细胞处理的研究人员进行分析，计数阳性染色的血管。从每张选取的切片中随机选取5个高倍视野进行计数，结果用每个高倍视野下的毛细血管数目来表达。脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡我们用TUNEL分析法(罗氏，德国)检测心肌组织中细胞凋亡情况，在实验终点时，获取所有动物梗死周边区域的心肌组织切片，石蜡切片用胰酶消化脱蜡，与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和荧光素标记的dUTP在37°C湿箱中孵育60分钟。然后与氢化荧光素共轭的碱性磷酸酶特异性抗体孵育30分钟，TUNEL染色用3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色， 含有DNA断裂片断的胞核被染成蓝色。为了检测切片中凋亡胞核的比例，组织用心肌特异性的结蛋白(Desmin)单克隆抗体复染(1 100，DAK0)，组织切片在400倍显微镜下观察， 最少在8个高倍视野下计数100个以上的心肌细胞，凋亡指数(apoptotic index)为凋亡的心肌细胞占视野中心肌细胞总数的百分比。抗氧化酶活性和脂质过氧化物为了检测梗死心肌的氧化应激水平，我们在实验终点时获取梗死周边心肌组织， 超氧化物歧化酶用黄嘌呤氧化法检测(南京建成公司)，脂质过氧化物用硫代巴比妥酸法检测的心肌丙二醛水平表示(南京建成公司)。
炎症因子表达水平为了以Wfestern blotting免疫印迹法检测梗死周边区心肌组织中炎症因子白细胞介素l-β (IL 1_β)、白细胞介素6(IL 6)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α )的表达情况，各组样品均取50 μ g蛋白，在Tris/HCl缓冲系统配制的10% SDS-PAGE中进行电泳分离，电转移至 NC 膜，加入多克隆山羊抗 IL-I β (1 1，000)，IL-6(1 1，000)和 TNF-α (1 1,000) 抗体。孵育后以PBS洗膜，再加辣根酶标记二抗(1 5000) (20mlTBST+4l·! 1 二抗)温育lh，经化学发光法可以显示目标蛋白的特异性条带，再以单克隆小鼠抗-actin抗体 (1 10，000)作参照。统计分析连续变量用均数士标准差表示，用卡方检验(O对第三组和第四组分化率的组间差异进行分析。对数据进行方差齐性检验和正态分布评估，而后进行方差分析，确定各组在各个分析阶段(移植后一周为基线检测，移植后六周为终点检测)存在的差异，以移植一周后数据为参照对移植六周后数据进行分析。用最小显著差异法(LSD)检验对两组间的多个参数进行对比。用巴夫罗尼(Bonferroni)法校正，当P < 0. 05时，差异有显著意义。所有数据均使用SPSS13. 0.进行统计分析。结果在所有参数成功收集以前，对照组、第二组、第三组中各有一只动物死亡，死亡动物数据未纳入统计分析。核磁共振影像与单光子发射计算机断层摄影每组共取36个节段进行分析，移植一周后，所有参数，包括局部室壁增厚率(P = 0. 915)、左心室射血分数(LVEF，P = O. 996)、梗死面积(P = 0. 991)、左室舒张末期容积 (EDV, P = O. 852)、左室收缩末期容积(ESV，P = O. 990)、左室质量指数(LVmass index, P =0. 791)，在4组间比较无显著差异。移植6周后，与对照组相比，第四组的心功能各项参数除EDV外均有显著改善(P < 0. 05)。各组左室功能及心室几何结构的改变见表1。表1心脏核磁共振显示的左室结构和功能
权利要求
1.辛伐他汀在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊剂或滴丸剂。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其特征在于辛伐他汀在制备用自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病的辅助药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病为心肌梗塞。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病为急性心肌梗塞。
全文摘要
本发明公开了辛伐他汀在促进骨髓间质干细胞移植后在体存活和向心肌细胞分化中的应用。本发明还涉及该药在用于自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病中的应用。
文档编号A61P9/10GK102370636SQ20101025918
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者杨跃进, 钱海燕 申请人:杨跃进, 钱海燕