新型诱导多能干细胞体外定向分化成晶状体小体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学技术领域，具体是一种体外诱导晶状体小体的制备方法。
【背景技术】
[0002]多能干细胞(pluripotent stem cells)包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导性多能干细胞(iPSCs)两类，是具有多分化潜能的细胞，理论上来说可以分化成任意一类细胞，将多能干细胞注射到免疫抑制的小鼠内可形成具有内中外三个胚层的畸胎瘤。
[0003]多能干细胞在药物研究、疾病机制研究及再生移植领域都有非常重要的作用。国内外已有学者利用多能干细胞定向诱导分化成特定的细胞或组织前体，作为药物毒性筛选原料，成为临床试验的第一步。在再生医学领域，国内外学者甚至已成功利用多能干细胞技术联合体外定向分化以及体内注射等手段在视网膜退行性病变、角膜病变、肝脏损害、心肌损害等多种疾病上实现了再生移植治疗。为疾病的机制研究和治疗提供了新的思路。
[0004]先天性白内障是造成儿童失明和视力损害的重要原因，任何直接或间接参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。因此，明确先天性白内障的发病机制对于治疗及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。将多能干细胞中的iPSCs技术和体外晶状体诱导技术结合，可以获得先天性白内障患者特异性的多能干细胞及晶状体，国际上将体外形成的晶状体称之为晶状体小体，通过观察和检测晶状体小体发生发展过程中各类基因、蛋白的表达变化可以更直观的描述其发病过程，为发病机制的研究提供更有力的证据，同时也为基因治疗提供了理论基础。
[0005]年龄相关性白内障为全球首位致盲眼病之一，目前尚无预防及早期治疗的有效的药物，而相关有效研究模型的缺乏是药物研究面临的最大障碍，如现有细胞模型无法在药物释放、作用以及跟体内微环境互相作用等方面无法真实反映药物在体内的作用情况；而动物模型则与人体之间存在不可避免的种族差异，因此很难构建合适的药物筛选模型。白内障摘除联合人工晶体植入术是治疗白内障最常用且迄今为止效果较为理想的方法，但人工晶体存在的局限性以及术后后囊膜混浊的发生均在一定程度上影响了患者的视觉质量，限制了人工晶体的进一步发展。总结来言，白内障作为全球首位的致盲性眼病，其发病机制、疾病预防及早期治疗、再生晶体的研究及运用由于有效模型的缺乏而停滞不前。
[0006]目前国内外已有研究小组在动物实验中通过将晶状体囊袋放置在房水中培养获得有初步晶状体结构的小体，但由于材料来源的限制而无法过渡到人晶状体上。在人晶状体发育研究中，有研究团队实现了在体外诱导胚胎干细胞定向分化成晶状体上皮细胞及晶状体纤维细胞，这个定向分化的过程部分再现了晶状体的发育过程，但其应用都由于无法形成形态良好具备光学功能的晶状体小体而受到限制。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服上述【背景技术】中的不足，提供一种新型诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法及应用，该方法应能形成形态良好且具备光学功能的晶状体小体；获得的晶状体小体可用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。
[0008]本发明提供技术方案是:
[0009]新型诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤:
[0010](I)将多能干细胞定向诱导分化成初级神经外胚层细胞团
[0011]将多能干细胞接种到基质胶溶液包被的六孔板上，用含人生长因子noggin的mTesR培养液培养5-7天后形成初级神经外胚层细胞团；所述基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2% ;
[0012](2)分离挑选初级神经外胚层细胞团
[0013]用乙二胺四乙酸溶液消化初级神经外胚层细胞团，然后用机械法将初级神经外胚层细胞团周边的数层神经外胚层细胞挑出；
[0014](3)诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体
[0015]将挑出的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶溶液包被的六孔板中，用含人生长因子bFBF、BMP4、BMP7的mTesR培养液培养5_7天并且每日更换培养液，保留出现“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其余细胞团剔除，继续培养8-10天后即可获得初级晶状体小体；所述新的基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2% ;
[0016](4)诱导初级晶状体小体分化为成熟的晶状体小体
[0017]用含人生长因子bFBF、Wnt3a的mTesR培养液培养初级晶状体小体，并且每日更换mTesR培养液，9-11天后即可获得由囊膜、晶状体上皮细胞、晶状体初级纤维细胞及晶状体成熟纤维细胞构成的晶状体小体。
[0018]所述步骤(I)中，mTesR培养液中含有90_110ng/ml的人生长因子noggin。
[0019]所述步骤⑵中的乙二胺四乙酸溶液，是在PBS中加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸含量为0.4-0.6mM，并且加入氯化钠使乙二胺四乙酸溶液的渗透压为320-360m0sm。
[0020]所述步骤(2)中挑出的神经外胚层细胞团为5-10层的内层细胞、3-7层的中层细胞以及3-7层的外层细胞。
[0021]所述步骤(3) “荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其结构为外层数十层分化的上皮样细胞，细胞体积较中央区细胞明显增大，胞质多，细胞排列相对疏松，中央区细胞体积小排列紧凑，胞质少，两类细胞相接形成类似荷包蛋的结构。
[0022]所述步骤(3)中，mTesR培养液中含有 17_23ng/ml 的 BMP4、17_23ng/ml 的 BMP7、80-120ng/ml的bFBF ;所述步骤(4)中，mTesR培养液中含有17_23ng/ml的Wnt3a以及80-120ng/ml 的 bFBF。
[0023]所述的晶状体小体呈现透明的3D结构，为圆形或椭圆形，直径l_3mm，表达晶状体特异性蛋白包括a -A、α -B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白ΜΙΡ。
[0024]所述的α -Α、α -B、β、γ四种晶状体蛋白为晶状体纤维细胞的结构蛋白，水通道蛋白MIP为表达在晶状体上皮细胞以及晶状体纤维细胞细胞膜上的通道蛋白。
[0025]所述的囊膜为晶状体外层包绕的一层透明薄膜，晶状体上皮细胞为囊膜下的仅有的一层柱状或立方状上皮细胞，初级晶状体纤维细胞为部分细胞器细胞核开始退化的由晶状体上皮细胞分化而来的纤维细胞，成熟晶状体纤维细胞为胞内细胞器细胞核完全退化由初级晶状体纤维细胞分化而来的细胞。
[0026]所述方法获得的晶状体小体，用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。
[0027]本发明的有益效果是:
[0028]本发明通过脱离饲养细胞利用不同生长因子组合配伍分化早期外胚层细胞团的分离挑选纯化来实现的，突破了既往晶状体小体结构上的限制，获得了具有3D立体结构的晶状体小体且其直径可达到l_3mm，并具有初步的光学功能、良好的透光性和一定放大比率，在结构和光学功能上更接近于人类晶状体的体外晶状体，在晶状体体外诱导上完成了质的飞跃，建立了一个更完善的稳定的晶状体体外发育模式；因此，本方法可以用于晶状体发育机制、白内障发病机制、白内障治疗药物以及再生晶体的研究，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0029]图1为晶状体小体J的摄像图。
[0030]图2-1为晶状体小体中晶状体蛋白a -A的mRNA表达的RT-qPCR结果图。
[0031]图2-2为晶状体小体中晶状体蛋白α -B的mRNA表达的RT-qPCR结果图。
[0032]图2-3为晶状体小体中晶状体蛋白β的mRNA表达的RT-qPCR结果图。
[0033]图2-4为晶状体小体中晶状体蛋白γ的mRNA表达的RT-qPCR结果图。
[0034]图2-5为晶状体小体中水通道蛋白MIP的