细胞团继续培养，9天后即可获得有中央区出现透明状突起的初级晶状体小体；
[0078]mTesR培养液中含有以下生长因子:20ng/ml的BMP4、20ng/ml的BMP7以及10ng/ml 的 bFBF ；
[0079](4)诱导初级晶状体小体分化为更成熟的晶状体小体
[0080]继续培养步骤(3)中获得的初级晶状体小体，每日换液，10日后即可获得晶状体小体；mTesR培养液中含有以下生长因子:20ng/ml的Wnt3a、100ng/ml的bFBF。
[0081]实施例3
[0082]—种新型诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤:
[0083](I)定向诱导多能干细胞成初级神经外胚层细胞团
[0084]先用基质胶(matrigel)溶液包被六孔板，在37°C、5% 0)2及饱和湿度的培养箱内放置分钟，随后将包被液吸走，用DMEM/F12培养液快速洗一次；再将多能干细胞接种在六孔板上用mTesR培养液培养7天，获得初级神经外胚层细胞团；
[0085]基质胶溶液为胚胎干细胞基质胶G3D matrigel?hESC-qualified Matrix)溶解在DMEM/F12培养液中形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为1.2% ;mTeSR培养液中含有的人生长因子为110ng/ml的noggin ；
[0086]显微镜下可观察到获得的初级外胚层细胞团具有三类细胞，位于最外层的细胞体积最大、胞质最多、排列相对最疏松，位于内部的细胞排列紧密、细胞核大细胞质少、与多能干细胞形态一致，而中间的数层细胞形态介于两者之间；
[0087](2)分离挑选纯化神经外胚层细胞团
[0088]将步骤⑴中获得的初级神经外胚层细胞团用乙二胺四乙酸(Ethylene DiamineTetraacetic Acid, EDTA)溶液消化后放置在显微镜下，在超净台中用针头将细胞团周边数层细胞划割开后用移液器吸起，得神经外胚层细胞团；
[0089]乙二胺四乙酸溶液为:0.6mM的EDTA溶解在PBS(磷酸盐缓冲液)中，并加入0.20% (Μ/V)氯化钠使其渗透压为360m0sm ;划割获得的神经外胚层细胞团包括10层的内层细胞、7层的中层细胞和7层的外层细胞；
[0090](3)诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体
[0091]将步骤(2)中获得的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶包被的六孔板中培养并且每日换液，7天后状态佳的细胞团可出现“荷包蛋样”(中间较厚、周边为相连的裙边状)的细胞排列结构，将培养皿中未出现“荷包蛋样”细胞排列结构的细胞团剔除，剩余细胞团继续培养，10天后即可获得有中央区出现透明状突起的初级晶状体小体；
[0092]mTesR培养液中含有以下生长因子:23ng/ml的BMP4、23ng/ml的BMP7以及120ng/ml 的 bFBF ；
[0093](4)诱导初级晶状体小体分化为更成熟的晶状体小体
[0094]继续培养步骤(3)中获得的初级晶状体小体，每日换液，11日后即可获得晶状体小体；mTesR培养液中含有以下生长因子:23ng/ml的Wnt3a、120ng/ml的bFBF。
[0095]二、获得的晶状体小体
[0096]获得的晶状体小体呈现透明的3D结构如图1所示，为圆形或椭圆形，直径约l-3mm，表达晶状体特异性蛋白包括α-Α、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP ;在电镜下可以观察到晶状体小体具有囊膜、晶状体上皮细胞、初级晶状体纤维细胞、成熟晶状体纤维细胞等结构，与正常的人晶状体结构类似。
[0097]所述的α-Α、α-Β、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP为特异性表达在晶状体的蛋白。α-Α、α-Β、β、γ四种晶状体蛋白为晶状体纤维细胞的结构蛋白，水通道蛋白MIP为表达在晶状体上皮细胞以及晶状体纤维细胞细胞膜上的通道蛋白。
[0098]囊膜为晶状体外层包绕的一层透明薄膜，晶状体体上皮细胞为囊膜下的仅有的一层柱状或立方状上皮细胞，初级晶状体纤维细胞为部分细胞器细胞核开始退化的由晶状体上皮细胞分化而来的纤维细胞，成熟晶状体纤维细胞为胞内细胞器细胞核完全退化由初级晶状体纤维细胞分化而来的细胞。
[0099]三、晶状体小体mRNA (信使核糖核酸)水平上α -Α、α -B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的表达检测
[0100]通过Real-time Quantitative Polymerase Chain React1n (RT-qPCR)(试剂购自TaKaRa公司)技术来检测，将获得的晶状体小体用PBS冲洗2遍后，加入Trizol (购自invitrogen公司)1ml，置于冰上用勾楽器反复研磨5分钟，充分裂解细胞。收集裂解产物转移到1.5ml的EP管中，加入氯仿200ml，用力震荡15秒，室温下静置2_3分钟后离心(4度，12000g，15 分钟)。
[0101]离心后液体分为三层，上层澄清层为RNA，中间白色层为DNA，底下红色层为蛋白。小心吸取上清液，勿吸入中间蛋白层，加入等体积异丙醇，混匀，室温下静置20分钟后离心(4度，12000g，10分钟)，弃上清液体。加入lml75%乙醇洗杂质，震荡30秒后再次离心(4度，7500g, 5分钟)。弃无水乙醇，室温放置3?5分钟，待其挥发至干燥时，加入20ul DEPC水溶解RNA。准备一个0.2ml的EP管，加入RNA500ng，用DEPC水补足至8ul，再加入2uloligo DT，将三者混匀后70度水浴5分钟，立即放置于冰上退火。再加入3ul 5XBuffer,0.3ul DEPC水、0.7ul dNTP、0.5ulRNA酶抑制剂、0.5ul逆转录酶，混匀。将上诉混合物置于PCR仪中，42度I小时、70度15分钟后，取出后置于-20度保存。由此获得cDNA混合物。取一块 RT-PCR 反应板，各孔中分别加入 SYBR 1ul、ROX 0.4ul、DEPC 水 Iul、cDNA 0.6ul，再加入引物8ul，混匀，贴膜。室温下3000rpm离心2分钟将孔壁上的液体甩下。放入RT-PCR仪中，调整参数:95度30分钟、95度5秒、60度34分钟、95度15分钟、60度I小时、95度15秒。以iPSCs为对照，计算晶状体小体中α -Α、α -B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的表达变化。
[0102]如图2-1至图2-5所示:RT_qPCR结果显示晶状体小体中α -Α、α -B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的表达明显升高，而iPSCs中这五类蛋白基本没有表达。
[0103]四、晶状体小体表达α -K、α -B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的免疫荧光染色(参见图3-1-1至图3-5-4)
[0104]将晶状体小体的培养液吸干，用PBS洗3次，吸干。用4% (M/V)PFA(购自sigma公司)溶液室温固定15分钟，将PFA吸干，用PBS洗三次，每次10分钟，吸干。用0.3% (V/V) Triton X (in PBS)处理15分钟穿透细胞膜，用0.1 % Triton X (in PBS)洗三次，每次10分钟。用20% (V/V)驴血清(in 0.1% Triton X)室温下封闭I小时，低速震荡。将0.1%Triton X稀释的相应一抗(均购自Santa Cruz B1technology公司)加在细胞样品上，放置在湿盒中4°C过夜。过夜后用0.1% Triton X洗三次，每次10分钟，吸干。将0.1 %Triton X稀释的二抗(购自)加在细胞样品上，避光低速震荡1.5小时。用0.1% TritonX洗三次，每次10分钟，吸干；加入5ug/ml的DAPI (购自sigma公司)避光低速震荡染色10分钟。用PBS洗三次，每次10分钟，吸干后再加入PBS避免细胞干燥。倒置荧光显微镜下观察。
[0105]免疫荧光结果显示晶状体小体表达α-Α、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP这五种晶状体特异性蛋白。
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