一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，属于微生物培养技术领域。
【背景技术】
[0002]尾孢属真菌是植物病原菌，可寄生在植物的茎、叶、花或果实上引起病害发生。玉米灰斑病(Cercospora zeina) (Meisel B, Korsman J, Kloppers F J, et al.Cercosporazeina is the causal agent of grey leaf spot disease of maize in southernAfrica [J].European journal of plant pathology, 2009，124 (4): 577-583.)、甜菜褐斑病(Cercospora beticola)(Holtschulte B, Asher M J C, Molard M R, et al.Cercosporabeticola-worldwide distribut1n and incidence[J].Cercospora beticola Sacc.b1logy, agronomic influence and control measures in sugar beet.，2000:5-16.)、辣椒褐斑病(Cercospora capsici) (Kawagoe H.1nfluence of temperature andrelative humidity on disease occurrence of sweet pepper caused by Cercosporacapsici in a plastic house[J].Annals of the Phytopathological Society ofJapan, 1998, 64(2): 137-138.)等都是尾孢属真菌引起的，造成很大的经济损失，因此，系统地研究尾孢属致病菌种类及发生规律，有效地降低病害发生几率，对减少经济损失具有重要意义。尾孢属真菌生长速度缓慢，普通的病组织分离法常无法分离到目标病原菌或易被杂菌污染。
[0003]目前，常用单孢分离法分离病原菌，单孢分离法是植物病害研究中常用的分离方法之一，该技术不仅涉及病原真菌的分离纯化、孢子形态观察方面，而且在研究群体遗传变异、生理生化特性等领域也有应用。单孢分离方法有很多，总结概括为两种类型，即使用特殊装置或手工操作分离。
[0004]其中，“单抱子分离器”是一种单抱分离装置(Constantinescu 0.An instrumentand procedure for single-spore isolat1n[J].Transact1ns of the BritishMycological Society, 1988,91(4): 700-702.)，但该装置安装较为复杂，需要对显微镜设备改造，且国内未见此装置的广泛使用。相比之下，手工操作分离较为普遍，但不同方法也存在一些不足，例如，切取器分离法(Ho W C，Ko W H.A simple method forobtaining single-spore isolates of fungi[J].Botanical Bulletin of AcademiaSinica, 1997，38.)，需要在显微镜下对单孢子处标记，然后用切取器切割单孢琼脂块，常出现切割的范围不准确，无法切到单孢的情况；直接在显微镜下挑取涂有孢子的琼脂平板，但培养皿不能固定，也不能随意移动，造成分离率降低(方中达.植病研究方法[M].北京:农业出版社，1998.);玻璃针法(Choi Y W，Hyde K D, Ho W H.Single spore isolat1n offung1.Fungal Diversity, 1999，3:29-38.)、眉针法(刘长华，王振华.玉米丝黑穗病田间接种浓度与发病率关系的研究[J].玉米科学，2008，16(1): 119-121.)，这些方法基本都是通过挑针挑取孢子，制作挑针的工具多为昆虫针或玻璃挑针，昆虫针较细，在显微镜下易确定孢子位置，但昆虫针较软，不易挑取粘有孢子的琼脂块，而玻璃挑针的硬度适中，但直径较粗，在显微镜视下观察常常占满整个视野，不能确定孢子的位置，同时，玻璃挑针的尖端易碎，在操作时要格外小心。这些因素降低了单孢分离的成功率和操作效率，在一定程度上限制了单孢分离法的应用。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明在病原菌孢子分离过程中，综合已有的单孢分离方法，利用病原分离中简单的设备，组成一种简易单孢分离器，并结合一种新的单孢分离方法，其具有操作简便、设备简单、分离速度快、准确性高、不宜污染等优点。
[0006]术语解释:
[0007]WA琼脂液:是指用水和琼脂配制而成的培养液，也称为WA培养基(Water-agarmedium)-水-琼脂培养基。
[0008]PDA平板培养基:是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato DextroseAgar(Medium)。
[0009]本发明是通过以下方法实现的:
[0010]一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，包括以下步骤，
[0011]a.选取具有发病症状的叶片，0-4°C保存，备分离用；
[0012]b.将取孢器高温灭菌消毒，备用；所述取孢器的一端为取孢球、另一端为取孢铲，所述取孢球为扁平圆状，所述取孢铲为扁平铲子状、端部呈尖状；
[0013]c.配制浓度为0.030-0.035g/ml的WA琼脂液，灭菌，在WA琼脂液未凝固前，吸取WA琼脂液，均匀涂布在载玻片上，使WA琼脂液形成直径10-15mm，厚度1-1.5mm的圆形琼脂块，制得琼脂片，然后将琼脂片放置在超净无菌工作台上凝固备用；
[0014]d.取经过步骤a处理后的叶片，用无菌水冲洗、干燥；然后用步骤b制得的取孢球在叶片病斑处来回划动，使孢子粘附到取孢球上，再将粘附有孢子的取孢球在步骤c制得的琼脂片上均匀涂布，最后将涂布的琼脂片放在1X 10倍显微镜下，视野中观察到I个孢子即可；
[0015]e.将经过步骤d处理后的涂有孢子的琼脂片放在25-28°C的环境下保湿培养22-24h ；
[0016]f.将显微镜放在超净无菌工作台上，把经过步骤e培养后的琼脂片放在载物台上，在1X 10视野下找到刚萌发，尚未分支的目标孢子，用取孢铲将孢子周围的琼脂块与琼脂片其它部分的琼脂分离，然后用取孢铲尖状端挑取带有孢子的琼脂块，移入PDA平板培养基，放在25 °C恒温环境下培养，获得单孢菌株。
[0017]优选的，步骤a中，将叶片装入洁净的自封袋内，然后将自封袋放在装有冰袋的塑料泡沫盒中，0-4°C保存带到实验室，备分离用；
[0018]优选的，步骤b中，将取孢器放入三角烧瓶中，封口，在120-125°C、103_104Kpa条件下，灭囷20min后，备用。
[0019]优选的，步骤c中，将10ml纯净水装入200ml三角烧瓶中，放入3_3.5g琼脂制得浓度为0.030-0.035g/ml的WA琼脂液。
[0020]优选的，步骤d中，取经过步骤a处理后的叶片，用75 %酒精表面消毒，无菌水冲洗3次，然后用灭菌滤纸擦干叶片表面。
[0021]优选的，步骤d中，取孢球在叶片病斑处来回划动之前，先在含有2%乳酸的灭菌水中蘸取。此设计的好处在于，取孢球在蘸取了含2%乳酸的灭菌水后，其具有一定的黏着性，便于粘附孢子。
[0022]优选的，步骤e中，将涂有孢子的琼脂片放置在铺有湿润吸水纸的培养皿内保湿培养，25 °C下培养24h。此设计的优势在于，琼脂片较薄，含水量低，容易干燥，放置在铺有湿润吸水纸的培养皿内，利于保湿培养。
[0023]优选的，步骤f中，将显微镜放在超净无菌工作台上后，用无菌脱脂棉蘸75%酒精擦拭显微镜的镜头和载物台，紫外灯照射30min。
[0024]本发明的有益效果在于:
[0025]1.本发明单孢分离方法采用特制的取孢器挑取孢子，特制的取孢器能少量粘附病原孢子，并能均匀涂布于培养基上，保证10X10倍的视野中有I个孢子出现，孢子密度低，容易找到目标孢子，且不容易粘附叶片残体，易于分离病原孢子，有效提高了分离率和分离速度。
[0026]2.本方法采用特制的取孢器挑取的孢子为培养24小时已萌发的孢子，有效地避免了采用其他方法挑取单孢后不能萌发的结果，成功率高。
[0027]3.本方法采用特制的取孢器，使用取孢器一端的取孢球通过粘附取孢的方式进行挑取孢