一种苍白杆菌及其生物制剂和制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种苍白杆菌及其生物制剂和制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]农药现代农业生产中对病虫害的的防治是必不可少的，但同时随着农药的广泛大量地使用，也给环境造成人为的污染，农产品中导致农药残留的产生，直接威胁着人们的健康。我国已经提出了“农药零增长计划”，目的就是减少农药对环境、人的影响。在减少农残方面，除了筛选高效低残留的农药、科学施用方法、农药替代等技术外，生物降解也是有效的技术之一。美国科学家从上世纪60年代开始，着手研究污染环境的异生物质包括化学农药等的微生物降解，旨在通过微生物技术清除环境污染物。国内外有许多报道将微生物作为接种剂直接接种到自然环境中，降解、清除环境中污染物成功的例子。利用微生物对农药污染物进行降解和转化有着巨大潜力，这与微生物所具备的几个方面的特点有关:微生物个体微小，比表面积大，代谢速度快；微生物种类繁多，分布广，代谢类型多样；微生物繁殖快、易变异、适应性强；在自然界的生态系统中微生物可产生降解酶将农药分解为无毒的小分子化合物甚至完全矿化为二氧化碳和水；另外微生物可通过共代谢作用，加快或促进农药残留的降解速度。国内外已分离筛选到许多降解或转化一种或几种农药的微生物类群。据不完全统计，已报道的农药降解细菌至少有28各属、真菌有14个属，放线菌有5个属。细菌主要有假单胞菌属棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽跑杆菌属(SaciWiAs)、节杆菌属(AriAraAacter)、黄杆菌属、黄担保杆菌属{Xanthomolza^)。真菌主要有曲霉属(AspergUJua)、青霉属{Penlcilliuii)、木霉罵(Trichoderma)和镰刀菌属{Fuariuni)。农药残留的微生物降解技术相比于物理化学修复技术，具有经济、高效和无二次污染等优点，是一个有潜力的、充满希望的农药污染修复方法。农药的微生物降解研究受到国内外的关注，在大农业农残的降解和环境修复中逐步得到应用。甲基托布津是一种高效杀菌剂农药，化学名为1、2 —二( 3 -甲氧碳基-2-硫脲基)苯，通用名为甲基硫菌灵。由于其化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位，易致累积效应，由于使用过量常会造成农产品的农药残留。然而，目前学术界对甲基托布津残留降解问题生物降解研究报道较少，市场上也没有可以大面积使用的甲基托布津降解剂产品。
【发明内容】
[0003]本发明第一目的在于提供一种苍白杆菌，第二目的在于提供一种以所述苍白杆菌作为活性成分的生物制剂，第三目的在于提供所述以苍白杆菌作为活性成分的生物制剂制备方法，第四目的在于提供所述苍白杆菌作为活性成分的生物制剂的应用。
[0004]本发明第一目的是这样实现的，所述的苍白杆菌为中间型苍白杆菌(Ochrobac trum in termedium) TP 206，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏编号:CGMCC N0.10035 ;所述苍白杆菌属于细菌界，变形菌门，α -变形菌纲，根瘤菌目，布鲁氏菌，苍白杆菌属。
[0005]中间型苍白杆菌(in termedium) TP 206的获得与鉴定:
菌株分离筛选方法:
分离培养基:Na2HP04 3g，ΚΗ2Ρ04 1.5g，NH4C1 0.5g，蒸馏水 500ml，琼脂 7_8g，pH 7.0(用NaOH调节)，在倒平板的时候再加入0.5ml的CaCljP MgSO 4.7Η20，终浓度为0.1 %的甲基托布津。
[0006]量取45ml水放入小三角瓶内，在121°C、20min高压蒸汽灭菌一称取5g烟叶样品放入灭菌后的小三角瓶内，放入30°C，150r/min摇床，30min后取出静置片刻一用移液枪吸取200ul上层液于已经倒好的的分离培养基平板上，用涂布器涂布均匀一放于37°C恒温培养箱培养7d—待长出多个单菌落后，在操作台内挑选长出的单个菌落于已经装满1ml LB液体培养基的保存管内一再放于放入30°C，150r/min摇床培养3d —待菌长满保存管后一加入甘油终浓度达到40%，放于-80 °C冰箱内保藏。
[0007]分离的菌株通过液体培养的方法鉴定其降解甲基托布津的能力。上述分离菌株在LB培养基中培养1天，加入终浓度为200ppm的甲基托布津农药，继续振荡培养3天，取样通过HPLC检测方法检测甲基托布津的残留量。
[0008]甲基托布津的HPLC检测方法:取lmL培养液，过0.22 μ m有机相滤膜，待测。色谱柱:Z0RBAX Eclipse XDB- C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);柱温:30.0°C ;检测波长:275nm，流动相A:CH30H，B:H20，C:CH3CN ;流速:0.7mL/min ;进样量:10.Ομ?，洗脱采用梯度洗脱。
[0009]菌株分离筛选结果:
通过分离和筛选得到一株能够在3天培养后高效降解甲基托布津的菌株，降解率达到99.3%,该菌株分离自云南省玉溪市红塔区烟叶表面，标记为ΤΡ206。该菌株于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册的编号CGMCCΝ0.10035ο
[0010]菌株鉴定方法
降解菌株的培养特征及生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》。和《Bergey’ sManual of Determinative Bacter1logy》进行。菌体总DNA的提取采用高盐法，并以总DNA为模板，扩增降解菌株的16S rRNA基因序列。PCR扩增产物纯化回收，进行TA克隆后进行测序。测序结果使用原核生物鉴定数据库EzBilCloud (http: //eztaxon~e.ezb1cloud.net/)进行在线比对分析。
[0011]鉴定结果
TP 206菌株系本发明人从大量烟草叶片上筛选出来的，具有显著降低甲基托布津含量的能力，经生理生化实验和16S rDNA序列进行鉴定，确定是中间型苍白杆菌(ifcAraAacir?in termedium ) TP 206 菌株。
[0012]Ochrobac trum in termedium TP 206菌株主要特征为:菌体细胞为短杆状，排列不整齐，没有芽孢，革兰氏染色阴性。在NA培养基表面菌体形成不透明的白色小菌落，表面光滑凸起，菌落干，边缘不整齐。严格好氧，伏-普试验(V.P.)、甲基红试验、吲哚试验呈阴性，不水解淀粉和明胶，接触酶、氧化酶反应、硝酸盐还原、硫化氢试验呈阳性，能够利用葡萄糖、麦芽糖等。最适生长温度为30 °C^PpH为6.5。
[0013]本发明第二目的是这样实现的，是以所述中间型苍白杆菌(Ochrobac trumintermedium) TP 206经试管种培养、液体发酵培养后制成的生物制剂。
[0014]本发明的第三目的是这样实现的，包括试管种培养、液体发酵培养步骤，具体包括:
A、试管种培养:将中间型苍白杆菌(Ochrobactrum in termedium) TP 206接种到试管斜面培养基上，在温度28~31°C恒温培养0.5-1.5天，得试管种；
B、液体发酵培养:将试管种接种到液体培养基中，在温度28~31V下摇床培养1~3天得到目标物苍白杆菌为活性成分的生物制剂。
[0015]本发明的第四目的是这样实现的，所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在修复甲基托布津残留污染土壤中的应用。
[0016]所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在降解去除农作物甲基托布津农药残留中的应用。
[0017]本发明人使用中间型苍白杆菌(ifcAraAaciri/a? in termedium) TP 206，经发酵生产过程，制备了甲基托布津农药残留降解菌剂，该菌剂对甲基托布津残留的降解率达到80以上，可广泛用于土壤甲基托布津污染或农作物甲基托布津的农药残留。
[0018]本发明使用所述菌株TP206发酵生产的甲基托布津农药降解菌剂可广泛用于土壤中甲基托布津残留污染的修复，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或作物表面，可以有效降解去除甲基托布津农药残留，使用方便，成本低廉。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0020]本发明所述的苍白杆菌为中间型苍白杆菌(OcAraAacir.in termedium) TP 206，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏编号:CGMCC N0.10035 ;所述苍白杆菌属于细菌界，变形菌门，α -变形菌纲，根瘤菌目，布鲁氏菌，苍白杆菌属。
[0021]本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂，是以所述中间型苍白杆菌(Ochrobac trum in termedium) TP 206经试管种培养、液体发酵培养后制成的生物制剂。
[0022]所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂中菌浓度为:每ml活菌数多108o
[0023]本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂的制备方法，包括试管种培养、液体发酵培养步骤，具体包括:
A、试管种培养:将中间型苍白杆菌(Ochrobactrum in termedium) TP 206接种到试管斜面培养基上，在温度28~31°C恒温培养0.5-1.5天，得试管种；
B、液体发酵培养:将试管种接种到液体培养基中，在温度28~31V下摇床培养1~3天得到目标物苍白杆菌为活性成分的生物制剂。
[0024]A步骤中所述的试管斜面培养基的成分为:葡萄糖l~3g，牛肉浸膏0.5-1.5 g，氯化钠 0.4-0.7 g，MgS04.7H20 0.1-0.3 g，琼脂 1.5-2 g，其余为水，pH 值为 5.5-8.0。
[0025]B步骤中所述的液体培养基的成分为:葡萄糖1~2 g，牛肉膏0.1~0.3 g，豆饼粉
0.8-1.2g，氯化钠 0.3-0.5 g，MgS04.7H20 0.2-0.4 g，其余为水，pH 值为 5.5-8.0。
[0026]B步骤中所述摇床的转速为180~200rpm。
[0027]本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂的应用为所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在修复甲基托布津残留污染土壤中的应用。
[0028]本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂的应用为所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在降解去除农作物甲基托布