专利名称：一种酶解和膜分离制备免疫活性大豆肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蛋白酶酶解和膜分离制备大豆蛋白免疫活性肽的方法，属于 大豆蛋白深加工技术领域。
背景技术：
健康人体的免疫系统需要维持一个合理的平衡。若免疫力弱，人容易感染、引发肿 瘤等疾病。随着在细胞和分子水平机理研究的深入，以及对免疫体系内部错综复杂的网络 结构的了解，人们逐渐认识到免疫调节在维持健康方面的作用比以前要大得多。近年来人 们发现了很多能够对天然免疫响应进行调节的小肽，被称为免疫活性肽，它们可能作为抗 原性物质或免疫细胞网络内的化学递质而发挥作用。免疫活性肽对于增强防病能力、延缓 衰老等具有深远的意义，它们可以通过饮食来增强人体的免疫力、提高机体抵御外界病原 体感染能力，因此研究不同食物蛋白中潜在的免疫活性肽是一项对于维持人体健康、增强 人体免疫力很有意义的研究工作。2009年我国大豆产量约1450万吨，占世界总产量的7%，居第四位。随着国内对大 豆功能性成分越来越深入的研究，大豆肽作为一种新型的大豆深加工产品，必将得到进一 步的开发利用，并蕴含着巨大的市场潜力。研究报道的免疫活性肽中主要是合成肽，而其中一小部分的食物源免疫活性肽的 研究也主要集中在乳蛋白来源，关于大豆蛋白来源的免疫活性肽的研究较少。Yoshikawa 和Takahashi应用高效液相色谱技术从大豆蛋白的胰蛋白酶酶解物中得到一个肽链顺序 为His-CyS-Gln-Arg-Pro-Arg的六肽，这种肽能刺激巨噬细胞和多核白细胞的吞噬作用， 具有免疫调节功能。南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室的杨小军等人研究 发现，大豆蛋白用胃蛋白酶水解得到的溶液能显著促进大鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、刺激 外周血淋巴细胞转化、提高肠腔SlgA水平，而且大豆蛋白酶解物的作用优于面筋蛋白酶解 物。大豆肽是指大豆蛋白经酶解或微生物技术处理得到的水解产物，它是由大豆蛋白 水解后的多种肽分子混合组成，其中包括少量游离氨基酸、大豆低聚糖、无机盐等成分。目 前市场上的大豆肽产品存在纯度和活性都不高等问题，本发明通过酶解制备大豆肽，进一 步采用膜分离技术富集纯化大豆肽，最终获得高肽含量、高免疫活性的大豆肽产品。
发明内容
本发明目的是提供一种通过酶水解和膜分离制备免疫活性大豆肽的方法，获得的 肽含量高，免疫活性高，提高了大豆蛋白的综合价值。本发明的技术方案一种酶解和膜分离制备免疫活性大豆肽的方法，所述方法步 骤为
(1)对脱脂大豆蛋白粉进行酸洗得到酸洗大豆蛋白以脱脂大豆蛋白粉为原料，按 g/mL为l:l(Tl:20 (w/v)加酸洗液，酸洗液采用质量浓度2g/L的Na2SO3水溶液，调节ρΗ4. (Γ5. 0，温度5(T60°C，洗涤时间l(T20min，酸洗2、次，酸洗后离心除去上清液，得到酸
洗大豆蛋白；
(2)使用Alcalase蛋白酶在一定条件下进行酶水解得到粗大豆肽液将步骤(1)所得 的酸洗大豆蛋白，按g/mL为l:l(Tl:20 (w/v)加水，调节ρΗ至8.0，调至ρΗ8.0过程中，蛋 白粘度逐渐增大，要搅勻，调节温度为55飞5°C，添加Alcalase蛋白酶，E/S=l. 09Γ3. 0%，反 应过程中保持PH值恒定，当水解度DH=20%时，调节pH至4. 0灭酶，3000r/min离心15min， 所得上清液即为粗大豆肽液；
(3)采用微滤、超滤和纳滤对所制备得到的粗大豆肽液进行澄清、富集、脱盐处理； 采用微滤对所制备得到的粗大豆肽液进行澄清除杂处理在室温下对大豆肽液进行
全回流微滤操作，采用的微滤膜为孔径0. 1(Γ0. 45 μ m的聚砜膜；在处理过程中，微滤以 ISOmin为一个运行周期，收集得到澄清透明的粗大豆肽液；运行周期结束后停机进行膜组 件的清洗和再生；
采用超滤对微滤后的粗大豆肽液进行富集处理在室温下对微滤后的粗大豆肽液进行 全回流超滤操作，采用的超滤膜的截留分子量(MWCO)为5000、000，料液的大豆肽初始浓 度为6. 09Γ8. 0%，ρΗ为4. 0，压力在0. 35 0. 8MPa之间，收集滤出液，实现对活性大豆肽液 的富集；
采用纳滤对超滤后的粗大豆肽液进行脱盐处理在室温下对超滤后的粗大豆肽液进行 全回流纳滤操作，采用的纳滤膜的截留分子量(MWCO)为15(Γ300，操作pH为4.0，压力在 0. 4 0. 7MPa之间，收集滤出液；
(4)对纳滤后收集的滤出液通过喷雾干燥得到粉状的免疫活性大豆肽；
(5)采用吞噬中性红试验或淋巴细胞增殖法(MTT)测定大豆肽活性，表明制备所得的大 豆肽具有良好的免疫活性。采用下面两种方法对大豆肽的免疫活性进行测定 1.淋巴细胞增殖法(MTT法)
MTT法是依据活细胞线粒体中富含琥珀酸脱氢酶，此酶可使MTT分解产生蓝色结晶状 甲肷，并沉积于细胞内活细胞周围，形成甲肷量与细胞增值程度呈正相关。溶解甲肷之后用 酶标仪测定OD值，就可以得到细胞的增殖情况。这种方法相对来说简单易行，现在被广泛 应用于评价外源物对淋巴细胞或机体免疫功能的作用。具体方法如下小鼠断颈处死后无菌取脾，置于盛有适量无菌PBS液的小平皿中， 用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，用PBS液洗3次，每次离心 转速1500 r/min，时间8min。然后将细胞悬浮于完全培养液中，调整细胞的密度为4X IO9 个/L。将细胞悬液加入24孔培养板中，每孔0.5 mL，再按下列设置分别加入完全培养液或 400mg/L的肽液，使每孔总体积达到1 mL，每样品设8个复孔，其中4孔加入ConA溶液，使之 终浓度为7 mg/L，另外4孔不加ConA溶液，置37°C、50 mL/L CO2孵育箱中培养72 h。培养 结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液，加入0. 7 mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加 入MTT (5 g/L) 50 μ L/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打 混勻，使紫色结晶完全溶解。然后转移到96孔培养板中，用酶联免疫检测仪，于波长570nm 测定吸光度值。实验中以培养液组作为空白对照。大豆肽的免疫调节活性用刺激指数(Si) 表示，SI值越大，说明酶解产物的免疫调节活性越强，计算公式为SI=阳性OD值/阴性OD
4值。2.中性红吞噬实验
巨噬细胞是机体免疫系统的一种重要的免疫细胞，具有吞噬和杀伤多种病原微生物、 处理和呈递抗原、分泌细胞因子(IL21、IL26、IL28、IL212、TNF2a)等作用，在炎症、感染 和肿瘤等许多疾病治疗过程中均发挥了重要作用，有活性的巨噬细胞可吞噬中性红染色， OD值大小反映细胞吞噬能力的大小。具体方法如下取健康小鼠，剪开腹壁皮肤，腹腔注射5mL PBS轻柔5min，慢慢抽 吸细胞悬液，加入离心管中，离心洗涤2次，用1640完全培养液将细胞浓度调至1.8 X IO6/ mL，于96孔平底板各孔加IOOyL细胞悬液及不同浓度的药物，置37°C、5%C02培养箱，培 养22 h后取出培养板，弃上清，于每孔各加入0.073 %的中性红50uL继续培养30min，弃 去中性红，用预温的PBS洗2次，再加细胞裂解剂(醋酸无水乙醇=1:1) 100yL，2h后 用酶标仪在540nm处测定吸光度。结果以吞噬指数(phagocytic index, PI)表示PI=实 验孔OD54tl值/对照孔OD54tl均值。本发明的有益效果本发明采用酶解和膜分离技术，在水解得到大豆肽的基础上 达到澄清、富集免疫活性大豆肽及除盐等目的，大大提高了大豆肽产品的免疫活性质量。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明进行进一步阐述。实施例1
低温脱脂豆粉酸洗4次。酸洗时添加质量浓度2g/LNa2S03溶液，调节pH4. 5，按1 10 (w/V)加酸洗液，温度55°C，洗涤时间lOmin，酸洗后离心除去上清液，得到酸沉蛋白。经过 酸洗的大豆蛋白，按1:10 (w/v)加水，调节pH至8.0 (调至pH8.0过程中，蛋白粘度逐渐 增大，要搅勻)，调节温度55°C，添加Alcalase蛋白酶(E/S=l. 0%)，反应过程中保持pH值恒 定。当水解度DH=20%时，调pH至4.0灭酶，3000r/min下离心15min，所得上清液即为粗 大豆肽液。采用微滤技术对粗肽液进行澄清除杂，采用孔径为0. 45 μ m的微滤膜(聚砜膜)。 在处理过程中，微滤膜以ISOmin为一个运行周期，停机进行膜组件的清洗和再生。收集得 到的澄清透明肽液。在室温下对微滤后的大豆肽液进行全回流超滤操作，采用截留分子量 (MWCO)为8000的复合膜(醋酸纤维+聚砜)作为超滤膜。料液初始浓度为8. 0%，操作压力 0. 55MPa、料液温度40°C、料液pH值4. 0、操作时间周期180min。收集滤出液，从而实现对 活性大豆肽液的富集。然后在室温下对超滤后的大豆肽液进行纳滤处理，使用截留分子量 (MWCO)为300的复合膜作为纳滤膜。操作pH为4.0，压力0.4MPa，收集滤出液。最后通过 喷雾干燥得到粉状的免疫活性大豆肽。实施例2
低温脱脂豆粉酸洗2次。酸洗时添加质量浓度2g/LNa2S03溶液，调节pH4. 0，按1 20 (w/V)加酸洗液，温度50°C，洗涤时间15min，酸洗后离心除去上清液，得到酸沉蛋白。经过 酸洗的大豆蛋白，按1:15 (w/v)加水，调节pH至8.0 (调至pH8.0过程中，蛋白粘度逐渐 增大，要搅勻)，调节温度60°C，添加Alcalase蛋白酶(E/S=3. 0%)，反应过程中保持pH值恒 定。当水解度DH=20%时，调节pH至4. 0灭酶，3000r/min下离心15min，所得上清液即为粗 大豆肽液。采用微滤技术对粗肽液进行澄清除杂。采用0. 10 μ m的微滤膜(聚砜)。在处理
5过程中，微滤膜以ISOmin为一个运行周期，停机进行膜组件的清洗和再生。最后收集得到 的澄清透明肽液。在室温下对大豆肽溶液进行全回流超滤操作。采用的超滤膜截留分子量 (MWCO)为5000 PES膜(聚醚砜)。料液初始浓度为7. 0%，操作压力0. 55MPa、料液温度40°C、 料液PH值4. 0、操作时间周期180min，收集滤出液，从而实现对活性大豆肽液的富集。然后 在室温下对大豆肽溶液进行纳滤处理。采用的纳滤膜截留分子量(MWCO)为150复合膜。操 作pH为4. 0，压力0. 6MPa,收集滤出液。最后通过喷雾干燥得到粉状的免疫活性大豆肽。实施例3
低温脱脂豆粉酸洗3次。酸洗时添加质量浓度2g/LNa2S03溶液，调节pH5. 0，按1 20 (w/V)加酸洗液，温度60°C，洗涤时间15min，酸洗后离心除去上清液，得到酸沉蛋白。经过 酸洗的大豆蛋白，按1:20 ( 八)加水，调节？!1至8.0 (调至pH8. O过程中，蛋白粘度逐渐增 大，要搅勻)，添加Alcalase蛋白酶(E/S=2. 0%)，调节温度60°C，反应过程中保持pH值恒定。 当水解度DH=20%时，调pH至4. O灭酶，3000r/min下离心15min，所得上清液即为粗大豆肽 液。采用微滤技术对粗肽液进行澄清除杂。采用的微滤膜膜孔径为0.45μπι(聚砜)。在处 理过程中，微滤膜以ISOmin为一个运行周期，停机进行膜组件的清洗和再生。最后收集得 到的澄清透明肽液。在室温下对大豆肽溶液进行全回流超滤操作。采用截留分子量(MWCO) 为5000的复合膜(聚醚砜)作为超滤膜。料液初始浓度为6. 0%，pH为4. 0，压力0. 8MPa,料 液温度40°C，操作时间180min。收集滤出液，从而实现对活性大豆肽液的富集。然后在室 温下对大豆肽溶液进行纳滤处理。采用的纳滤膜截留分子量(MWCO)为150复合膜。操作 PH为4.0，压力0.5 MPa，收集滤出液。最后通过喷雾干燥得到粉状的免疫活性大豆肽。表1实施例中得到的免疫活性大豆肽产品的肽含量及免疫活性
肱含量(以 干基计)％SIPI不力口 ConA加 ConA对照组-1.04±0.031.08±0.061.00±0.02实施例191.82%1.24 士 0.02*1.48±0.04木1,40±0.04*实施例293.2.7%1.—33±0.05*1.51±0.05 木1.39±0.01*实施例392.66%1.20±0.03*1.46 土 0.03$1.47 士 0.06 木
*表示样品与对照组有显著差异。
权利要求
一种酶解和膜分离制备免疫活性大豆肽的方法，其特征在于所述方法步骤为(1)对脱脂大豆蛋白粉进行酸洗得到酸洗大豆蛋白以脱脂大豆蛋白粉为原料，按g/mL 为1:10~1:20加酸洗液，酸洗液采用质量浓度2g/L 的Na2SO3水溶液，调节pH4.0~5.0，温度50~60℃，洗涤时间10~20min，酸洗2~4次，酸洗后离心除去上清液，得到酸洗大豆蛋白；(2)使用Alcalase蛋白酶在一定条件下进行酶水解得到粗大豆肽液将步骤(1)所得的酸洗大豆蛋白，按g/mL 为1:10~1:20加水，调节pH至8.0，调至pH8.0过程中，蛋白粘度逐渐增大，要搅匀，调节温度为55~65℃，添加Alcalase蛋白酶，E/S=1.0%~3.0%，反应过程中保持pH值恒定，当水解度DH=20%时，调节pH至4.0灭酶，3000r/min离心15min，所得上清液即为粗大豆肽液；(3)采用微滤、超滤和纳滤对所制备得到的粗大豆肽液进行澄清、富集、脱盐处理；采用微滤对所制备得到的粗大豆肽液进行澄清除杂处理在室温下对大豆肽液进行全回流微滤操作，采用的微滤膜为孔径0.10~0.45μm的聚砜膜；在处理过程中，微滤以180min为一个运行周期，收集得到澄清透明的粗大豆肽液；运行周期结束后停机进行膜组件的清洗和再生；采用超滤对微滤后的粗大豆肽液进行富集处理在室温下对微滤后的粗大豆肽液进行全回流超滤操作，采用的超滤膜的截留分子量MWCO为5000~8000，料液的大豆肽初始浓度为6.0%~8.0%，pH为4.0，压力在0.35～0.8MPa之间，收集滤出液，实现对活性大豆肽液的富集；采用纳滤对超滤后的粗大豆肽液进行脱盐处理在室温下对超滤后的粗大豆肽液进行全回流纳滤操作，采用的纳滤膜的截留分子量MWCO为150~300，操作pH为4.0，压力在0.4~0.7MPa之间，收集滤出液；(4)对纳滤后收集的滤出液通过喷雾干燥得到粉状的免疫活性大豆肽；(5)采用吞噬中性红试验或淋巴细胞增殖法测定大豆肽活性，表明制备所得的大豆肽具有良好的免疫活性。
全文摘要
一种酶解和膜分离制备免疫活性大豆肽的方法，属于大豆蛋白深加工技术领域。本发明以脱脂大豆蛋白粉为原料，首先对其进行酸洗得到酸洗大豆蛋白，然后使用Alcalase蛋白酶在一定条件下进行酶水解得到粗大豆肽液；再采用微滤对所制备得到的粗大豆肽液进行澄清处理；然后采用超滤和纳滤进行富集和脱盐处理；最后通过干燥得到粉状的免疫活性大豆肽。采用中性红吞噬试验和淋巴细胞增殖法测定大豆肽活性表明，制备所得的大豆肽具有良好的免疫活性。
文档编号C07K1/34GK101974589SQ20101052374
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者华欲飞, 孔祥珍, 张彩猛, 董蝶, 黄文凯 申请人:江南大学