H7.9,0.5M 化Cl, 10%Glycerol，40mM Imidazole(咪挫））洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，洗脱液 为纯化产物。
[0033] 实施例2:间日追原虫締醇化酶(enolase)的鉴定：
[0034] 第一种方法:聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法:将实施例1的纯化产物经12 % 聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。（如图2所示）。图2中，第1道带为分子量，第2道为诱 导前全菌，第3道为诱导后全菌，第4道为细菌超声后上清，第5道为细菌超声后沉淀，第6道 为儀柱纯化后产物；W上结果说明获得了可溶性表达的重组enolase;
[0035] 第二种方法:免疫印迹方法：向实施例1的纯化产物中加入等体积的2XSDS上样缓 冲液，沸水浴5min;待SDS-PAGE胶凝固后，放入电泳槽中固定，加入电泳缓冲液，将处理好的 样品进行12 % SDS-PAGE分离，电压80-130V;电泳完毕后，将PAGE胶、转移用海绵浸泡于转移 缓冲液中15-30111111;剪取与口466胶大小相同的口￥0。膜先浸润于100%甲醇中103，然后浸泡 于去离子水2-5min，最后浸泡于转移缓冲液中15-30min;按照从电极负极开始，先海绵，后 PAGE胶和PVDF膜，最后海绵的顺序要求制作转移Ξ明治，将Ξ明治夹子放入转移电泳槽中， 放进冰盒，加入足量转移缓冲液，加盖，接通电源，恒流350mA、1.5h;转移完成后，将PVDF膜 用TBS试剂洗5min，再放入含5 %脱脂奶粉的TBS试剂中封闭1小时。封闭结束后PVDF膜用 TBST试剂洗3次，每次5min;加入抗化S标签的抗体作为一抗，4°C解育过夜。经TBST清洗膜3 次，每次5min;加入辣根过氧化物酶标记的鼠源抗IgG抗体作为二抗进行杂交，室溫解育化，
[0036] 经TBST试剂清洗PVDF膜3次，每次5min ;加入TMB试剂显色，如图2所示，最左侧 Marker为纯化蛋白免疫印迹结果，进一步证明获得了重组enolase蛋白。
[0037] 实施例3:抗间日追原虫締醇化酶(enolase)抗体滴度分析：
[0038] 对小鼠进行enolase蛋白免疫并用酶联免疫吸附测定化LISA)方法对抗体滴度进 行分析，具体采用W下方法：
[0039] (1)用生理盐水将20yg抗原enolase稀释到2倍最终浓度（按每针次50μ1用量配 制）；
[0040] (2)充分混匀佐剂，无菌条件下取出所需用量(按每针次50μ1)与抗原按体积比1:1 迅速混匀；
[0041] (3)通过后腿小腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠注射10化1;
[0042] (4)第14天按同样方式加强免疫一针；
[0043] (5)第21天采微量尾血进行ELISA测定；结果如图3所示抗间日追原虫締醇化酶 (eno lase)抗体效价达到100万W上。
[0044] 表 1
[0045]
[0047]表3中，横向1:1000、1: 2000等数值为制备的抗締醇化酶血清稀释倍数;纵向a、b、 c、d等分别指随机选择的7只免疫締醇化酶的小鼠血清，blank指为没有免疫締醇化酶的小 鼠血清;表3中数值指抗抗締醇化酶血清和締醇化酶反应0D值。
[004引实施例4:抗间日追原虫締醇化酶(enolase)抗体体外抑制恶性追原虫：
[0049]用体外抑制试验来评价:抗间日追原虫締醇化酶(enolase)抗体抑制恶性追原虫 生长的作用。其方法为:采用我国海南恶性追原虫FCC1/HN株(江苏省血吸虫病防治研究所 重点实验室保存），将体外培养的恶性追原虫稀释至0.5 % -1.0 %的起始原虫密度和2 %的 红细胞压积(红细胞压积为从无锡市红十字血站购买的血液离屯、后红细胞的沉淀的体积）， 将该培养物置于96孔板中，每孔180yL，再加入含不同浓度抗间日追原虫締醇化酶 (eno lase)抗体液20化，混匀后置蜡烛缸内培养，每2地换液一次，分别培养24，48，和7化后 制作薄血膜计数10000个红细胞中的原虫数，计算原虫感染率(结果如图3所示）。图3中横坐 标为解育时间，分别为化、24h、4化和72h;纵坐标为红细胞原虫感染率；图3中柱形1为对照 组，柱形2为免疫前血清，柱形3为免疫后血清。由图3可知，不同浓度抗间日追原虫締醇化酶 (enolase)抗体作用于恶性追原虫，随着作用时间的延长，恶性追原虫感染红细胞降低，最 终被完全抑制。
[0050] 实施例5:间日追原虫締醇化酶(enolase)体内抑制追原虫生长并保护宿主：
[0051] W小鼠鼠追为模型，验证间日追原虫締醇化酶(enolase)体内抑制追原虫生长并 保护宿主(如图4A、图4B所示），具体采用W下方法：
[0052] 第一，试验动物：
[0053] 使用昆明小鼠，每组3只，体重为20±2克。实验动物由北京试验动物中屯、购买，饲 养于江苏省血吸虫病防治研究所重点实验室的实验动物中屯、内，小鼠饲料为统一配方制的 料块；自由饮自来水。小鼠饲养室溫为23 ± 2°C，相对湿度为75 ± 10 %，人工照明，每日光照 12小时。
[0054] 第二，鼠追原虫；
[0055] 使用鼠伯氏追原虫虫株，追原虫平时W液氮冻存。实验前2周进行复苏，并经传代 后用于本试验，供体小鼠原虫率大于10 %。
[0056] 第Ξ，试验方法：
[0057] 用化ters 4天抑制性试验方法，首先对小鼠按上述方法(实施例3)进行enolase蛋 白免疫，然后每只小鼠腹腔接种IX 107个染虫红细胞，于接种原虫后(D 0,当天），w后连续 2天观察小鼠状态，并同时小鼠剪尾或者脚趾取血涂薄血膜，吉氏染色，镜检，计算小鼠的红 细胞追原虫感染率（％)。检查2 X 104个红细胞未见原虫者定为阴性。
[0058] 图4A中，横坐标为感染原虫后天数，纵坐标为小鼠原虫感染率，曲线1A为对照组， 曲线2A为免疫佐剂组，曲线3A为免疫enolase蛋白组。图4B中横坐标为感染原虫后天数，纵 坐标为小鼠存活率，曲线1B为对照组，曲线2B为免疫佐剂组，曲线3B为免疫enolase蛋白组。
【主权项】
1. 一种间日疟原虫烯醇化酶的制备，其特征是，包括以下步骤： (1) 扩增间日疟原虫烯醇化酶(enolase)基因：提取间日疟原虫基因组，采用引物P2和 引物P3扩增第一段enolase基因，然后再以第一段enolase基因为模版，以引物P1和引物P3 扩增出enolase基因； (2) 构建pET28a/ enolase表达载体： a、 纯化步骤(1)得到的enolase基因； b、 将ρΕΤ28α质粒酶切、提纯得到线性化的ρΕΤ28α质粒载体； c、 将线性化的ρΕΤ28α质粒载体和enolase基因连接，得到pET28a/ enolase表达载体； (3) 重组enolase蛋白表达和纯化：将pET28a/ en〇lase表达载体转化到BL-21(DH3) pLys感受态细菌上，培养后的细菌进行诱导、纯化。2. 如权利要求1所述的间日疟原虫烯醇化酶的制备，其特征是：所述引物PlS5'_ cggccatatggcccacgtaattactcgtatttctgcccgtgaaattttgg-3 ' ；所述弓|物P2为5'-gtatttctgcccgtgaaattttggactcccgaggaaacccaaccg-3' ；所述弓 | 物 P3为5'-agcagcggccgctcaacttaattggtgcctaaatttctc-3'〇3. 如权利要求1所述的间日疟原虫烯醇化酶的制备，其特征是:所述步骤（1)扩增过程 为：94°C、4min;94°C、30sec;50°C、30sec;72°C、1 ·5 min，共30个循环；72°C、7 min;4°C、12 min〇4. 如权利要求1所述的间日疟原虫烯醇化酶的制备，其特征是:所述纯化enolase基因 具体为:使用PCR产物纯化试剂盒提纯步骤（1)得到的enolase基因后，以限制性内切酶Nde I和Notl进行酶切提纯，经1%琼脂糖凝胶电泳后，用Agaose Gel Extraction Kit提纯。5. -种间日疟原虫烯醇化酶体内抑制疟原虫生长并保护宿主的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种间日疟原虫烯醇化酶的制备及其应用，特征是，包括以下步骤：（1）扩增间日疟原虫烯醇化酶（enolase）基因：提取间日疟原虫基因组，采用引物P2和引物P3扩增第一段enolase基因，然后再以第一段enolase基因为模版，以引物P1和引物P3扩增出enolase基因；（2）构建pET28α/enolase表达载体；（3）重组enolase蛋白表达和纯化：将pET28α/enolase表达载体转化到BL-21（DH3）pLys感受态细菌上，培养后的细菌进行诱导、纯化。本发明能够简便的大量制备间日疟原虫烯醇化酶，并实现抑制疟原虫生长的应用。
【IPC分类】C12N9/88, A61P33/06, C12N15/60, C12N15/70
【公开号】CN105543203
【申请号】CN201610099144
【发明人】张超, 顾亚萍, 唐建霞, 曹俊, 高琪
【申请人】江苏省血吸虫病防治研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月23日