植物Cas9变体蛋白VRER及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体为对植物基因进行编辑的化S9蛋白变体VWR及其 编码基因的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，CRISPR-化S9W其高效、简便的技术特点，在植物中迅速成为最为重要的 基因组编辑手段。CRI SPR-CaS原为广泛分布存在于原核生物中的免疫系统，CRI SPRs (Clustered regularly interspaced short palin化omic r邱eats)即规律成簇间隔短回 文重复，化s蛋白则是一种受RNA引导的核酸酶。
[0003] 目前所使用的CRISPR-Cas9系统，是基于II型CRISPR-Cas所开发的基因组编辑技 术。该技术所设及到的化S蛋白仅有化s9-种，受化acrRNA和crRNA组成的引导RNA(后被优 化为sgRNA)所引导，Cas9蛋白的HNH结构域及RuvC结构域在PAMs(p;rotospacer adjacent motif s)序列上游的3-8bp处进行双链切割并造成双链断裂。当双链断裂发生，细胞便会启 动两套修复机制，即非同源末端链接(Non-homologous ending-joining,NHEJ)与同源重组 (Homologous recombination,皿）。非同源末端链接通常造成双链断裂处产生单个或多个 碱基的缺失、插入，W该方式修复的个体常常产生某个基因的定点突变。同源重组则是W同 源序列作为模板，进行高保真修复。
[0004] 在CRISPR/Cas9系统中，前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif， PAM)序列决定了整个基因组中祀序列的分布。PAM是位于目标DM附近的一段序列，具有识 别祀DNA的功能，只有当正确结合PM序列时，才能活化化s9的两个内切酶活性区。祀序列末 端的Ξ核巧酸区域PAM(5'-NGG-3'）为化s9识别位点，是实现剪切功能的关键。然而运并不 能完全满足人们对于植物基因编辑范围的需求。由于CRI SPR-Cas9系统祀位点的选择受到 PAM序列NGG的限制，因此在植物中发现及改造能识别新PAM的化s9变体变得十分重要。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种新型植物Cas9变体蛋白VRER及其编码基因 和应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物化s9变体蛋白VRER，该蛋白质的氨 基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0007] 作为本发明的植物化s9变体蛋白VRER的改进:蛋白质还包括在SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
[000引本发明还同时提供了一种植物化s9变体基因 VRER，该基因编码植物化s9变体蛋白 VRER，所述基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 作为本发明的植物化s9变体基因 VRER的改进:所述基因还包括在SEQ ID NO: 1所 示的核巧酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核巧酸生成的突变体、等位基因和衍 生物。
[0010]本发明还同时提供了一种重组表达载体，其包含上述基因。
[001。 本发明还同时提供了上述植物Cas9变体蛋白VRER的用途：能够在PAM区为5 ' - NGCG-3 '的情况下实现基因组编辑功能。N代表A，T，C，G任意一种核巧酸。
[0012] 本发明的方案具体如下：
[0013] 本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b):
[0014] (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0015] (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同活性功能由序列2衍生的蛋白质。
[0016] 上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0017] 编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
[0018] 上述基因是如下（1)-(3)中任一所述的DNA分子：
[0019] 1)序列表中序列1的DNA序列；
[0020] 2)编码序列表中序列2蛋白质序列的多核巧酸；
[0021] 3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90% W上同源性，且编码相同功能蛋白质 的DNA序列；
[0022] 含有W上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。
[0023] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0024] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体（如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、 pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-加 iN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。
[0025] 上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在编辑植物 基因组中的应用也是本发明保护的范围。
[00%]本发明经对编码化s9的基因进行突变，产生一种编码新型化s9变体蛋白VRm?的基 因，识别的PAM为NGCG。在水稻WNGCG为PAM序列筛选祀位点并编辑化1 -1基因的实验中，经 转基因手段，成功得到化1-1功能缺失的突变体植株，表明该蛋白能够识别5 ' -NGCG作为PAM 序列并对祀位点进行编辑。本发明在扩大植物基因编辑范围上有广阔的应用前景。
[0027] 本发明的用途是：用于对植物基因组特定的祀位点进行基因编辑，即PAM区为5'- NGCG-3'的祀位点。作为基因编辑技术CRISPR-Cas9系统中的一员，相较于传统化s9蛋白只 能编辑PAM区为5'-NGG-3'的祀位点的限制，扩大了该系统在植物基因组中可编辑的范围。
【附图说明】
[0028] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0029] 图1为重组载体部分元件及突变位点示意图。
[0030] 图2为化1-1祀位点酶切检测结果;Μ为marker; 1，5，6，7，11，12，15，16，17为敲除杂 合体植株;14为敲除纯合体植株;最后两个泳道分别为酶切和未经酶切的野生型;其余泳道 则为敲除阴性植株，酶切结果与酶切的野生型无异。
[0031] 图3为化1-1祀位点测序结果;下划波浪线标示的为祀位点；单下划线标示的为PAM 序列;框标示的为酶切识别位点;缺失W短横杠表示，插入W小写字母表示。
[0032] 图4为野生型中花11及突变体GL1-1的表型。
[0033] 图5为LGl祀位点测序结果;下划波浪线标示的为祀位点；单下划线标示的为PAM序 列;框标示的为酶切识别位点;缺失W短横杠表示，插入W小写字母表示。
【具体实施方式】
[0034] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036] 实施例lXas9变体V旭R的获得
[0037] 通过重叠延伸PCR技术将突变引入化s9编码基因中的特定位点。需将完整的化s9 W1135位的氨基酸、1218位氨基酸和1336位氨基酸处为界，分为4段，再通过PC时尋其编码序 列扩出。所使用的引物如表1所示;K0D FX DNA聚合酶(购自东洋纺生物科技有限公司）PCR 扩增目的条带，反应条件如下：
[00；3 引
[0039]
[0040] 备注说明：pC1300-Cas9可来自申请号201510485573.2。
[0041] 反应程序：94°C，变性2分钟；然后98°C变性10秒，58°C退火30秒，68°C延伸 (lOOObp/min)，扩增35个循环;最后在68°C下延伸5分钟。
[0042] 1，2、2,3和3,4段之间包含20bp重叠区域;第一段和第四段分别包含与载体上、下 游同源的区域。在设计引物之初，将特定突变包含在两个片段的重叠部分。片段1的反向引 物和片段2的正向引物的重叠部分包含氨基酸?'的密码子，替换原来1135位的氨基酸"护。 片段2的反向引物和片段3的正向引物的重叠部分包含氨基酸"R"的密码子，替换原来1218 位的氨基酸"护。片段3的反向引物和片段4的正向引物的重叠部分包含氨基酸和"R"的 密码子，分别替换原来1335位的氨基酸"R"和1337位氨基酸?'。片段1的正向引物和片段3 的反向引物则分别包含与载体上、下游同源的序列。随后通过多片段的重组技术，将数个的 扩增片段重叠拼接成完整的化s9变体VWR编码序列。多片段重组试剂盒购自南京诺唯赞生 物科技有限公司，载体pCl300-化s9经AatII和SpeI (购自肥B公司）双酶切线性化，双酶切反 应体系如下：
[0043]
[0044] 37°C酶切3小时，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯 化;得片段 pC1300-Cas9/AatII+SpeI。
[0045] 重组反应体系如下： 舶战0 Up 10 20 .uL 5^CE MulliS BuiTcr 4 fiL
[0046] pC BOO-C犯9过加片窗細 跳0 ng 片段1 40 ng 片段2 40 ng 片段3 40 ng
[0047] 片段4 40 ng Exnasc? MulliS 2 μL^
[0048] 置于37°C反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。产物 转化大肠杆菌感受态细胞D册α得到重组质粒PC1300-VRER，测序重组质粒确定突变引入正 确。即，该重组质粒PC1300-VR邸中包含如沈Q ID Ν0:1所示的基因。
[0049] 备注说明：
[(Κ)加 ]SEQ ID Ν0:1为VR邸DNA序列；下划线为核定位信号区域(NLS);大写为终止密码 子;其余部分为VRER蛋白编码序列，改造位点计数从V