一种聚乙二醇修饰的l-门冬酰胺酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用聚乙二醇修饰药物，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] L-门冬酰胺酶（L-ASNase,L-asparaginase,EC. 3. 5. 1. 1)，又名L-天冬酰胺酶或 L-天门冬酰胺酶，其目前主要用于临床上治疗急性淋巴细胞白血病（ALL)。其对儿童的完 全缓解率可达57. 8 %，有效率为85. 2 %;对成人的完全缓解率为32. 8 %，有效率为64. 3 %。 同时，对单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病均 有一定疗效。
[0003] 1974年，国内就已经将L-门冬酰胺酶投入生产（天津生化制药厂等.医药工业， 1974, 4XIV8.)，后因囷种退化等原因而退出市场，现基本依赖进口。
[0004] 由于L-门冬酰胺酶是以大肠杆菌为主要来源的一种异源蛋白质，存在半衰期短， 稳定性低，具有较强的免疫原性等缺点，易于诱导产生过敏反应，形成中和抗体，缩短半 衰期以及难以维持有效的血药浓度等缺陷。虽然与其它化疗药物相比，其具有选择性杀伤 癌细胞的优点，并且对骨髓的抑制作用较小，但该酶在血液循环系统中会由于胰蛋白酶的 消化作用而很快失活，因此相对地就需要较高浓度、大剂量的酶来维持疗效，而这种大剂量 又会引起更大范围的毒副作用。因而，如何获得低免疫原性，低毒副作用L-门冬酰胺酶用 于临床给药，一直是研宄的重点。
[0005] 聚乙二醇（PEG)是一种中性，无毒，具有良好生物相容性的高分子聚合物（分子量 几百到几万），也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。对蛋白质 药物进行适当的化学修饰研宄中应用最多，成功率最高的也是PEG化修饰技术。
[0006] PEG化原理是将PEG末端羟基转化成高反应活性基团，与蛋白质的巯基、氨基、羧 基或是羟基进行偶联反应，生成PEG-蛋白质偶联物。PEG化蛋白质药物在临床用药上具有 改善多肽类药物的稳定性及可溶性，降低其免疫原性，提高生物利用度等优点。经PEG修饰 的L-门冬酰胺酶除了降低免疫原性与延长半衰期外还有效增加了其稳定性，使临床上的 用药频率降低，最终降低了治疗费用。
[0007] 中国专利CN1498965A公开了一种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法，该专利 使用聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯（SS-PEG)对其进行修饰。而后对修饰产物使用中空纤 维柱超滤进行分离。由于SS-PEG属于第一代活化的聚乙二醇修饰剂，其修饰产物具有易 水解及稳定性低的缺点。且水解后会有琥珀酸尾巴作为半抗原残留在生物体内从而增加 了L-门冬酰胺酶的免疫原性。而通过超滤手段无法彻底的将单点和多点修饰产物分开，从 该公开专利的附图1中可以发现这种药物实际为一种多种修饰的混合产物，其缺点显而易 见。
[0008] 中国专利CN101082043B也公开了一种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法。该 专利使用线性单甲氧基聚乙二醇对其进行修饰。而后使用离子交换层析和凝胶树脂过滤层 析对修饰后产物进行分离。但由于采用线性的聚乙二醇修饰，为了降低免疫原性，就需要多 点修饰。而多点修饰存在使修饰后的药物活性被大幅度降低，无法更好的满足临床应用的 需求。
[0009]因而本专利迫切需要提供一种由新一代的聚乙二醇修饰剂修饰的L-门冬酰胺 酶，同时达到降低免疫原性与活性损失的目的，已更好的满足临床应用方面的要求。
【发明内容】
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明有以下几个目的：第一、提供一种新型的聚乙二醇 共价修饰的L-门冬酰胺酶，该酶具有更低的免疫原性，活性损失更少，半衰期更长等特点， 更适合临床应用；第二、提供上述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶的制备方法；第三、 提供上述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶的医药用途。
[0011] 为实现上述第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0012] 聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，该L-门冬酰胺酶采用支链化聚乙二醇对其 进行修饰；支链化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇，并且单一活性功能基 团设置在端点，所述的含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇的结构式如下：
【主权项】
1. 聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于该L-门冬酰胺酶采用支链化聚乙 二醇对其进行修饰；支链化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇，并且单一活 性功能基团设置在端点，所述的含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇的结构式如下：
所述的nl、n2、n3分别为大于等于1的正整数，表示各分支链的聚合度，各个聚乙二醇 分支链链段的数均分子量在5000-100000之间；所述的R为源自醇类化合物的烷基；所述 的X为修饰L-门冬酰胺酶的活性功能基团；所述的L-门冬酰胺酶亚基上的1-8个伯氨基 被相同数目的PEG修饰。
2. 根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：所述的 L-门冬酰胺酶亚基上的1-3个伯氨基被相同数目的PEG修饰。
3. 根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：Y型聚乙 二醇的分子量为5kDa_40kDa。
4. 根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：活性功能 基团选自氰基、羧基、氨基、醛基、琥珀酸基碳酸酯、琥珀酸基琥珀酸酯、硝基苯酯和琥珀酰 亚胺酯中的一种；作为再优选，上述的活性功能基团选用琥珀酸基碳酸酯。
5. 根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：R基选用 甲基、乙基或丙基。
6. 根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：所述的 L-门冬酰胺酶是天然或重组的。
7. -种制备上述权利要求1~6任意一项权利要求所述的聚乙二醇共价修饰的L-门 冬酰胺酶的方法，该方法中含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇与L-门冬酰胺酶发生共 价结合反应的重量比例为1 :〇. 5~20,缓冲液的pH值为4-10,反应温度为4°C~37°C，反 应时间为2~36小时；在修饰反应结束后，分离纯化采用离子交换层析，凝胶过滤层析和 Hitrap-Desalting 柱脱盐。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：离子交换层析使用的介质为阴离子 交换层析或阳离子交换层析；离子交换层析介质骨架的为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖 型、琼脂糖型或球状纤维素型；作为优选，离子交换层析使用的介质为QSepharose系列、 SP Sepharose 系列，DEAE Sepharose 系列、CM Sepharose 系列，DEAE Sephacel 系列、CM Sephacel 系列，QAE Sephadex 系列、SP Sephadex 系列，DEAE Sephadex 系列、CM Sephadex 系列，SOURCE Q系列或SOURCE S系列；作为再优选，选择使用SOURCE Q系列，洗脱方式采 用梯度洗脱。
9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：凝胶过滤层析使用的介质为葡聚糖 型、琼脂糖型或球状纤维素型；优选采用Sepharose系列、Sephacel系列、Sephadex系列、 Superdex系列和Superose系列中的一种混多种混合；作为再优选，使用Sephacryl-300作 为层析介质进行分离。
10.权利要求1~6任意一项权利要求所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶用于 制备治疗单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病 的药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及用聚乙二醇修饰药物，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶及其制备方法和应用。聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，该L-门冬酰胺酶采用支链化聚乙二醇对其进行修饰；支链化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点，各个聚乙二醇分支链链段的数均分子量在5000-100000之间；所述的R为源自醇类化合物的烷基；所述的L-门冬酰胺酶亚基上的1-8个伯氨基被相同数目的PEG修饰。本发明用支链化的聚乙二醇进行修饰，降低了药物失活的比例，进一步减少药物在生物体内失活的程度，不仅降低了制作药物的成本，还减少了临床给药的频率和次数，将为患者减轻药费负担，带来福音。
【IPC分类】A61K38-50, A61K47-48, A61P35-02, C12N9-82, A61P35-00, C12N9-96
【公开号】CN104745564
【申请号】CN201510140588
【发明人】韩雯, 刘翔, 张加慧, 封小燕
【申请人】杭州北斗生物技术有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月27日