一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用，属于基因工程 和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖（Trehalose)是由两个R比喃环葡萄糖以1，1-糖苷键连结而成，是一种稳定 的非还原性二糖，它有3种光学异构体，S卩aa型、a0型和0 0型。
[0003] 海藻糖是一种安全的非还原性二糖，广泛存在于自然界中，具有保湿性，抗冻抗干 燥性，热酸稳定性等特殊的生物学功能，对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医 学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖 生理生化和分子生物学的研宄，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。
[0004]酶法转化生产海藻糖是上世界90年代逐渐兴起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻 糖合成酶法和双酶法这三种方法。当前以淀粉为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽 寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。以该方 法生产海藻糖的转化率高达80%以上，在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推 动了海藻糖的工业化生产进程。
[0005] 麦芽寡糖基海藻糖合成酶是双酶法生产海藻糖的其中一种酶。淀粉经过高温液化 后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精，麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的 a，a-l，4_糖苷，产生a，a-l，4_糖苷键到a，a-l，l-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成 中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡 糖基与海藻糖相连的a，a-1，4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的 新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交 替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽 三糖的产物。
[0006] 双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，转化率高达80%以上，具有低成本的优点，但是 麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因在宿主菌中的可溶性表达很低，产生较多的包涵体，酶活力 低，不利于其工业化应用。因此，本发明利用基因工程和酶工程手段，在不影响麦芽寡糖基 海藻糖合成酶酶学性质和转化率的基础上提高其可溶性表达，从而提高酶活，为其工业化 生产创造条件。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，该突变体是通过将 SulfolobusacidocaldariusATCC33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的蛋白表面疏水 区域相关氨基酸残基进行取代后得到的。与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比，突变 体在宿主菌中的可溶性表达有一定程度的提高，宿主菌胞内麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活 提尚。
[0008] 所述Sulfolobus acidocaldariusATCC33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的 氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸（Leu)突变为苏氨酸 (Thr)，突变体命名为L96T。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸（Leu)突变为组氨酸 (His)，突变体命名为L96H。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第106位甲硫氨酸（Met)突变为赖 氨酸（Lys)，突变体命名为M106K。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第106位甲硫氨酸（Met)突变为组 氨酸（His)，突变体命名为M106H。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第374位脯氨酸（Pro)突变为谷氨 酸（Glu)，突变体命名为P374E。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第374位脯氨酸（Pro)突变为组氨 酸（His)，突变体命名为P374H。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第520位异亮氨酸（lie)突变为组 氨酸（His)，突变体命名为I520H。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第520位异亮氨酸（lie)突变为精 氨酸（Arg)，突变体命名为I520R。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸（Leu)突变为苏氨酸 (Thr)，同时将第106位甲硫氨酸（Met)突变为赖氨酸（Lys)，突变体命名为L96T/M106K。
[0018] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体 的制备方法，包括如下步骤：
[0019] ⑴根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖合 成酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
[0020] (2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
[0021] (3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为麦芽寡糖基海 藻糖合成酶突变体的粗酶液。
[0022] 所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
[0023] 所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
[0024] 所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
[0025] 本发明提供了一系列在宿主菌中可溶性表达强度提高的麦芽寡糖基海藻糖合成 酶突变体。在适当的培养条件下，突变体L96T、L96H、M106K、M106H、I520H、I520R、L96T/ M106K麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活分别为野生酶的2. 69倍、1. 16倍、2. 45倍、1. 92倍、 1.07 倍、1.09 倍、3. 04 倍。
【附图说明】
[0026] 图1野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和突变体（L96T、L96H、M106K、M106H、I520H、 I520R、L96T/M106K)重组菌摇瓶酶活力测定
【具体实施方式】
[0027] 实施例1野生麦芽寡糖基海藻糖合成酶的制备
[0028] (1)麦芽寡糖基海藻糖合成酶重组菌的构建
[0029]根据NCBI上的treY氨基酸序列（NCBI编号：WP_015385613. 1)，将NCBI上的treY 基因序列（NCBI编号：NC_020247. 1)进行密码子优化，采用化学全合成方法合成麦芽寡糖 基海藻糖合成酶的基因序列treY。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET24a(+)。将 pET24a(+)质粒和带有treY基因的质粒分别进行NdeI和HindIII双酶切，酶切产物经胶 回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布 于含100mg/L卡那霉素的LB平板，经37°C培养过夜，平板上挑取3个单菌落，接入LB液体 培养基，8h后抽提质粒验证，结果正确，得到富集的treY/pET24a质粒。将质粒treY/pET24a 转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑取转化子在LB液体培养基（含100mg/L卡那霉 素）中37°C培养过夜，保存甘油管，命名为treY/pET24a/BL21 (DE3)。
[0030] (2)麦芽寡糖基海藻糖合成酶的表达
[0031] 从甘油管接种treY/pET24a/BL21 (DE3)于LB液体培养基（含100mg/L卡那霉素） 生长8h，按5%接种量将种子接入TB液体发酵培养基（含100mg/L卡那霉素）。大肠杆菌 在37°C培养2h后，加入0.OlmM终浓度的IPTG(异丙基硫代--D半乳糖苷）进行诱导，并 在25°C摇床继续培养发酵24h后，将一定体积发酵液于4°C、12000r?mirT1离心lOmin去 上清液，收集菌体，菌体沉淀用50mmol?PpHS. 5Na2HP04-NaH2P0jl冲液重新悬浮，混匀。用 超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁（超声细胞破碎机的工作条件46工作探头， 工作时间5min，工作3s停3s，工作功率为20% )，然后12000r?mirT1离心lOmin，离心后 上清即为发酵胞内粗酶液。
[0032] 实施例2麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及表达
[0033] (1)突变体的制备
[0034] 来源于SulfolobusacidocaldariusATCC33909的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的 八种突变体酶L96T、L96H、M106K、M106H、P374E、P374H、I520H、I520R:根据Sulfolobus acidocaldariusATCC33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因序列，分别设计并合成引入 L96T、L96H、M106K、M106H、