游离芽孢漆酶酶活。该游离芽孢漆酶作为对照组，与固定化芽孢漆 酶具有相同的芽孢量，其处理过程与固定化芽孢漆酶相同（不添加载体）。
[0045] 滤出液酶活是指：芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附后，过滤处理得到的 滤出液的酶活。
[0046] 固定化率=(初始酶活一滤出液酶活）/初始酶活*100%
[0047] 相对酶活是指：在固定化条件选择、最适pH和最适温度实验中，相对酶活为各条 件下的酶活与最高酶活的百分比，设最高酶活为100% ;在稳定性实验中，相对酶活为各条 件下的酶活与未经处理的固定化芽孢漆酶的酶活的百分比，设未经处理的固定化芽孢漆酶 的酶活为1〇〇%。
[0048] 实施例1芽孢漆酶的固定化方法1
[0049] 添加5倍柱体积的去离子水对DEAE-纤维素进行溶涨、搅拌，并静置过夜。抽滤溶 涨好的DEAE-纤维素，然后用0. 5MHC1处理lh，水洗到中性，过滤，再用碱处理lh，水洗到中 性，过滤并收集。将活化好的DEAE-纤维素与制备好的芽孢以配比为50mg湿重芽孢：lg 干重DEAE-纤维素进行混合，在37°C，180r/min条件下吸附10h，然后过滤，收集固定化芽孢 漆酶和滤液并检测酶活。最终固定化芽孢漆酶的固定化率为99. 23%。在检测芽孢量的影 响中，本实验条件得到的固定化芽孢漆酶的相对酶活达到最大值的98. 22%。在检测吸附时 间的影响中，本实验条件得到的固定化芽孢漆酶其相对酶活达到最大值的99. 69 %。
[0050] 实施例2芽孢漆酶的固定化方法2
[0051] 吸附pH为8,其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的固定化率为 90. 41 % 〇
[0052] 实施例3芽孢漆酶的固定化方法3
[0053] 吸附pH为5,其他步骤与实施例1相同，最终固定化芽孢漆酶的固定化率为 80. 73%〇
[0054] 实施例4芽孢漆酶的固定化方法4
[0055] 芽孢量与DEAE-纤维素的配比变为30mg: lg，其他步骤与实施例1相同。最终固 定化芽孢漆酶的相对酶活达到最大值的72. 68%。
[0056] 实施例5芽孢漆酶的固定化方法5
[0057] 芽孢量与DEAE-纤维素的配比变为90mg:lg，其他步骤与实施例1相同。最终固 定化芽孢漆酶的相对酶活为100. 00%。
[0058] 实施例6芽孢漆酶的固定化方法6
[0059] 吸附时间为0.5h，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活为 62. 31%。实施例7芽孢漆酶的固定化方法7
[0060] 吸附时间为24h，其他步骤与实施例1相同。最终固定化芽孢漆酶的相对酶活达到 最大值的的100. 00%。
[0061] 实施例8固定化芽孢漆酶的最适pH和pH稳定性
[0062] 以实施例1制得的固定化芽孢漆酶作为测试对象检测其最适pH与pH稳定性。
[0063] 最适pH的检测：将50mg干重DEAE-纤维素所获得的固定化芽孢漆酶置于3. 5ml 缓冲液中（缓冲液pH范围为3. 0 - 9. 0)，根据处理的缓冲液选择底物并检测吸光值，检测 方法如前所述。结果表明固定化芽孢漆酶的最适pH分别为3. 2、7. 0和7. 0。
[0064]pH稳定性的检测：取上述相同酶量的固定化芽孢漆酶置于5ml离心管中。离心管 被分为pH3、pH7和pH9三组，每组11管，各添加3. 5ml缓冲液，分别保存0 - 10天，检测残 余酶活。检测体系与检测方法如前所述。结果如图4所示，固定化芽孢漆酶具有广泛的pH适应能力。例如，在pH3、pH7和pH9三个条件下保存10天，固定化芽孢漆酶的相对酶活分 别为 29. 73%，52. 46%和 46. 35%。
[0065]上述的缓冲液包括：0? 1M柠檬酸一磷酸盐缓冲液（pH3.0-pH7.0)，0?lMTris-HCl 缓冲液（pH7.0-9. 0)。底物为ABTS(0. 5mM，在酸性条件下使用），丁香醛连氮（0.05mM，在 中性条件使用），2,6 -甲氧基苯酚（2mM，在碱性条件下使用）。
[0066] 实施例9固定化芽孢漆酶的最适温度及温度稳定性
[0067] 最适温度检测：与实施例8的检测方法基本相同，不同之处在于，保温及反应温度 分别为 25 °C、35 °C、45 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 °C、75 °C、80°C和 90 °C，共 10 个梯度，缓冲液统 一为0. 1M柠檬酸一磷酸盐缓冲液（pH6. 8)。实验结果表明，固定化芽孢漆酶的最适温度为 55。。。
[0068] 温度稳定性检测：分别检测固定化芽孢漆酶在60°C、70°C、80°C和90°C条件下保 温10h的温度稳定性。检测方法与最适温度的检测基本相同，不同之处在于，所有固定化 芽孢漆酶置于相应温度下保温，每隔lh测一次酶活，直到10h，或直到酶活消失（当酶活在 l〇h以前消失时），反应时间为3min。结果如图5所示，固定化芽孢漆酶在70°C、80°C的半 衰期分别为5. 5h和2. 2h，而在60°C条件下保温10h仍保留有73. 75%，在90°C保温lh时 还具初始酶活的10. 10%。结果说明，芽孢杆菌漆酶是非常耐热的。
[0069] 实施例10固定化芽孢漆酶在含有机溶剂溶液中的稳定性
[0070] 将干重50mgDEAE-纤维素所获得的固定化芽孢漆酶置于3. 5ml含相应浓度有机 溶剂的缓冲液中（缓冲液PH6. 8)，在37°C保温2h，添加丁香醛连氮反应5min，然后冰水浴 lOmin以终止反应，以10000r/min离心反应样品，在A= 525nm的波长下检测吸光值。以 不添加任何有机溶剂作为对照，并取其吸光值为100%。所得结果如表1所示：
[0071] 表1 :有机溶剂对固定化芽孢漆酶活性的影响
【主权项】
1. 一种固定化芽孢漆酶，其特征在于，以离子交换剂为载体，通过氢键和离子键的作用 将芽孢漆酶固定在离子交换剂表面。
2. 根据权利要求1所述的固定化芽孢漆酶，其特征在于，所述离子交换剂为DEAE-纤维 素。
3. 根据权利要求1所述的固定化芽孢漆酶，其特征在于，所述芽孢漆酶是芽孢杆菌属 菌株所产的具有漆酶活力的芽孢。
4. 一种制备权利要求1-3任一所述固定化芽孢漆酶的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 制备芽孢杆菌属菌株的芽孢； (2) 载体预处理：添加1 一 20倍柱体积的去离子水对DEAE-纤维素进行溶涨、搅拌，并 静置过夜；DEAE-纤维素溶涨过夜后沉降下来，倾去含悬浮微粒的上清液，过滤；过滤所得 的DEAE-纤维素，用酸处理0. 5 - 2h，水洗到中性，过滤，再用碱处理0. 5 - 2h，水洗到中性， 过滤并收集； (3) 将制备好的芽孢按0. 01 - 0. 5g湿重芽孢：Ig DEAE-纤维素的比例混合在缓冲液 中，在 4 一 40°C，50 - 250r/min 条件下吸附 1 一 48h ; (4) 芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附后，过滤，用缓冲液冲洗0 - 5次，过滤， 收集固定化芽孢，保藏于〇 - 40 °C。
5. 权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)溶涨DEAE-纤维素的水的体积为 5倍柱体积，所述酸为0. 5M HC1，所述碱为0. 5M NaOH，酸碱处理的时间都为lh。
6. 权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)芽孢与DEAE-纤维素的配比为 50mg湿重芽孢：Ig干重DEAE-纤维素；所用缓冲液的离子强度为0. 05M，pH值范围为5. 0 - 10. 5〇
7. 权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)吸附过程的温度为37°C，转速 180r/min，吸附时间为10h，缓冲液pH范围为pH 8. 0 - 10. 5。
8. 权利要求1所述的固定化芽孢漆酶在纺织染料废水的脱色处理中的应用。
9. 根据权利8所述的应用，其特征在于，向废水中添加介体，所述介体为1 一羟基苯并 三唑、2, 2'-联氮基-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐、丁香醛、香草醛或4 一羟基苯 甲酸。
10. 根据权利8所述的应用，其特征在于，所述的纺织染料为甲基绿、甲基红、酸性红1 或结晶紫中的一种或几种。
【专利摘要】本发明公开了一种固定化芽孢漆酶及其制备与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。本发明固定化芽孢漆酶是由芽孢杆菌属菌株所产的芽孢漆酶通过离子键和氢键固定在DEAE-纤维素上形成的，它保留了芽孢漆酶广泛的pH适应能力和耐热性；在含有机溶剂、金属离子或抑制剂的溶液中，固定化芽孢漆酶具有比游离芽孢漆酶更强的稳定性。其制备过程主要包含芽孢的制备、载体预处理、吸附和收集四个步骤，操作简便，固定化率高。本发明提供的固定化芽孢漆酶具有很强的染料脱色能力，将其应用于纺织染料如甲基绿、甲基红、酸性红1和结晶紫的脱色处理，最高脱色率可达到95％左右。载体也可以选择性地吸附染料，与漆酶形成互补作用。
【IPC分类】C12N11-12, C02F103-30, C02F3-34
【公开号】CN104745567
【申请号】CN201510166951
【发明人】管政兵, 周稳, 廖祥儒, 蔡宇杰
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月9日