一种乳酸菌的固定化胶囊及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种乳酸菌的固定化胶囊及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]亚硝酸盐是广泛存在于自然环境中的化学物质，是强致癌物亚硝胺的前体物质，其在胃部可与食品中蛋白质分解的中间产物仲胺反应形成亚硝胺，进而诱发多种癌症如胃癌、肝癌、大肠癌和食道癌等。虽然国家对食品中亚硝酸盐的添加量有着严格的限制，但由于食物中亚硝酸盐过量而引起食物中毒的事件时有发生。目前，由于氮肥的大量使用以及一些地区使用生活污水和工业废水灌溉，导致地下水亚硝酸盐污染严重，粮食蔬菜中亚硝酸盐含量超标也较为普遍。此外，传统腌制泡菜及各种加工肉制品中也一直存在亚硝酸盐超标问题。另外，根据一项流行病学调查发现，癌症高发区居民饮水中亚硝酸盐含量高于低发区。
[0003]鉴于食品中亚硝酸盐超标引起的严重危害，人们正在努力地寻找有效的控制或降解亚硝酸盐的方法，生物法降解食品中过量的亚硝酸盐是一条可行的途径。目前，人们已经从自然界中分离获得了一些亚硝酸盐降解菌，其中，乳酸菌作为一种益生菌也能有效地降解亚硝酸盐。
[0004]但目前尚没有乳酸菌的固定化胶囊用于降解亚硝酸盐。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种乳酸菌的固定化胶囊，该乳酸菌的固定化胶囊采用海藻酸钠和壳聚糖作为固定化材料。
[0006]本发明的目的之二在于提供上述一种乳酸菌的固定化胶囊的制备方法。
[0007]本发明的目的之三在于将上述乳酸菌的固定化胶囊用于降解食品中的亚硝酸盐。
[0008]本发明的技术原理
对于生物降解亚硝酸盐，固定化细胞是一种有效的方法，它不仅可以提高细胞对苯酚的耐受性，而且可以重复使用。包埋法是应用最广泛的固定化方法。海藻酸钠、壳聚糖由于价格低廉、对细胞无毒性而成为广泛使用的包埋材料，因此，可用其作为固定化细胞的载体。
[0009]采用柠檬酸钠将微胶囊固芯液化，可以减小细胞生长的空间位阻和微胶囊的传质阻力，有助于微囊化细胞的生长和生产。
[0010]本发明的技术方案
一种乳酸菌的固定化胶囊，通过包括如下步骤的方法制备而成:
(I)、湿乳酸菌菌体的制备
挑取一环斜面保存的乳酸菌于5 ml的MRS液体培养基中，37°C静止培养20h，得第一代菌种；
将第一代菌种，按体积百分比计算，以10%的接种量接种到MR液体S培养基，37°C静止培养20h，得第二代菌种；
将第二代菌种，按体积百分比计算，以10%的接种量接种到MRS液体培养基中，37°C静止培养12h，即得培养液I ;
向所得的培养液I中加入为培养液I体积0.01倍的浓度为0.8-lmol/L亚硝酸盐水溶液进行培养8h，即得培养液2 ;
将所得的培养液2于4 °C、4000rpm离心lOmin，收集菌体，用无菌水振荡洗涤后4000rpm离心lOmin，重复无菌水振荡洗涤、离心步骤一次，得到的沉淀即为湿乳酸菌菌体；
(2)、将湿乳酸菌菌体与质量百分比浓度为2%的海藻酸钠水溶液混合均匀，静止
15-20min后，得到混合液；
上述湿乳酸菌菌体与质量百分比浓度为2%的海藻酸钠水溶液的用量，按湿乳酸菌菌体:质量百分比浓度为2%的海藻酸钠水溶液为lg:1Oml的比例计算；
(3)、将步骤(2)所得的混合液吸入到无菌注射器中，以1.5-2ml/min的速度的垂直滴入到质量百分比浓度为1.5%的氯化钙水溶液中，以150r/min转速搅拌，固化20_30min，通过过滤方法除去氯化钙水溶液，得到凝胶珠；
(4)、将步骤(3)所得的凝胶珠用无菌蒸馏水洗涤三次，然后加入凝胶珠体积10倍的质量百分比浓度为2%的壳聚糖醋酸水溶液进行成膜反应15min，所得的反应液中加入为其体积10倍的质量百分比浓度为0.15%的海藻酸钠水溶液进行固定lOmin，然后用普通滤纸过滤，所得沉淀I用PH5.0、浓度为0.055mol/L的柠檬酸钠水溶液作用lOmin，然后用100目的筛网过滤，所得沉淀2即为乳酸菌的固定化胶囊，乳酸菌的固定化胶囊的直径为1.0-2.5mm0
[0011]上述所得的乳酸菌的固定化胶囊在降解亚硝酸盐中的应用，即将所述的乳酸菌的固定化胶囊加入到亚硝酸盐水溶液中，静止放置72h，即完成亚硝酸盐的降解处理，亚硝酸盐降解率达96-98%，并且乳酸菌的固定化胶囊重复使用五次后，效果不降低，亚硝酸盐降解率仍均在96-98% ；
所述的乳酸菌的固定化胶囊的加入量，按乳酸菌的固定化胶囊:亚硝酸盐水溶液中的亚硝酸盐为lg:10-15ymol的比例计算；
所述的亚硝酸盐水溶液为质量百分比浓度为0.2g/L的亚硝酸盐水溶液，优选为质量百分比浓度为0.2g/L的亚硝酸钠水溶液。
[0012]本发明的有益效果
本发明的乳酸菌的固定化胶囊，由于采用海藻酸钠和壳聚糖作为固定化材料包埋乳酸菌，其可用于降解食品中过量亚硝酸盐。
[0013]进一步，本发明的乳酸菌的固定化胶囊，由于制备过程中采用柠檬酸钠将微胶囊固芯液化，从而可以减小细胞生长的空间位阻和微胶囊的传质阻力，因此所得的乳酸菌固定化胶囊具有生物相容性好、易于小分子扩散、耐酸碱等特点，因此该乳酸菌固定化胶囊多次应用于水中亚硝酸盐的处理，降解率较高，稳定性较好。乳酸菌的固定化胶囊重复使用五次，在72h内对质量百分比浓度为0.2g/L的亚硝酸盐的降解率在96-98%，因此乳酸菌的固定化胶囊用于生物法处理食品中过量亚硝酸盐具有高效性。
【具体实施方式】
[0014]下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
[0015]亚硝酸盐含量的测定方法采用GB 5009.33-2010中的盐酸萘乙二胺法。
[0016]本发明的实施例中所用的MRS液体培养基，按每升计算，含5.0 g葡萄糖、10.0 g牛肉膏、5.0 g酵母膏、10.0 g大豆蛋白胨、5.0 g无水乙酸钠、2.0 g梓檬酸三钱、1.0 g磷酸氢二钾、0.2 g硫酸镁、0.05 g硫酸猛，余量为去离子水，pH值7.0。
[0017]本发明的实施例中所用的乳酸菌，为植物乳杆菌h2，由上海应用技术学院生物工程室分离鉴定与保存，可对外商业提供。
[0018]实施例1
一种乳酸菌的固定化胶囊，通过包括如下步骤的方法制备而成:
(1)、湿乳酸菌菌体的制备
挑取一环斜面保存的乳酸菌于5ml的MRS液体培养基中，37°C静止培养20h，得第一代菌种；
将第一代菌种，按体积百分比计算，以10%的接种量接种到MRS液体培养基，37°C静止培养20h，得第二代菌种；
将第二代菌种，按体积百分比计算，以10%的接种量接种到MRS液体培养基中，37°C静止培养12h，即得培养液I ;
向所得的培养液I中加入为培养液I体积0.01倍的浓度为0.8-lmol/L亚硝酸盐水溶液进行培养8h，即得培养液2 ;
将所得的培养液2于4 °C、4000rpm离心lOmin，收集菌体，用无菌水振荡洗涤后4000rpm离心lOmin，重复无菌水振荡洗涤、离心步骤一次，得到的沉淀即为湿乳酸菌菌体；
(2)、将28湿乳酸菌菌体与20mL质量百分比浓度为2%的海藻酸钠水溶液混合均匀，静止10-15min后，得到混合液；
(3)、将步骤(2)所得的混合液吸入到5mL的无菌注射器中，以1.5-2.0ml/min的速度的垂直滴入到质量百分比浓度为1.5%的氯化钙水溶液中，以150r/min转速搅拌，固化20-30min，通过过滤方法除去氯化钙水溶液，得到凝胶珠；
(4)、将步骤(3)所得的凝胶珠用无菌蒸馏水洗涤三次，然后加入凝胶珠体积10倍的质量百分比浓度为2%的壳聚糖醋酸水溶液进行成膜反应15min，所得的反应液中加入为其体积10倍的质量百分比浓度为0.15%的海藻酸钠水溶液进行固定lOmin，然后用普通滤纸过滤，所得沉淀I用PH5.0、浓度为0.055mol/L的柠檬酸钠水溶液作用lOmin，然后用100目的筛网过滤，所得沉淀2即为乳酸菌的固定化胶囊，乳酸菌的固定化胶囊的直径经检测为1.0-2.5mm0
[0019]对照实施例1
一种乳酸菌的固定化胶囊，通过包括如下步骤的方法制备而成:
(I)、湿乳酸菌菌体的制备
挑取一环斜面保存的乳酸菌于5ml的MRS液体