密码子优化型1型鸭甲肝病毒vp1基因及其重组蛋白的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物医学领域，具体涉及一种密码子优化型VP1基因及其重组蛋白的 应用。
【背景技术】
[0002] 鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis)为主要由1型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus typel，DHAV-1)引起的雏鸭的一种急性、高度致病性传染病，发病急， 传播迅速，病程短，死亡率高。临床表现角弓反张，剖检见肝脏肿大和大量的出血性斑点，是 危害养鸭业的主要疾病之一。虽然我国研制的鸭肝炎鸡胚化弱毒疫苗和灭活苗，在全国应 用推广，对种鸭、雏鸭进行免疫预防，取得很好的效果，然而，对DHAV-1特异性抗体的监测 是评价DHAV-1弱毒疫苗和灭活苗免疫效果及制定合理免疫程序的关键，也是确认DHAV-1 感染的手段之一。目前，用于DHAV-1抗体检测的方法主要有中和试验（neutralization test，NT)、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、琼脂凝胶 扩散试验、Dot-ELISA测定法、间接血凝及血凝抑制试验等。其中经典的方法是血清中和试 验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性 强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DHAV-1感染早期快速诊断和免疫抗体监测的 有效手段，但检测过程耗时费力。
[0003] DHAV-1病毒主要由衣壳和核酸组成。生物信息学分析表明，基因组由5'端非编码 区、一个大的开放阅读框、及3'端非编码区组成。0RF编码含2249个氨基酸的多聚蛋白，编 码的多聚蛋白在病毒包装过程中，先进行自我切割，最终裂解为3种结构蛋白（VPO、VP3和 VP1)和7种非结构蛋白（24、28、2(：、3六、38、3(：和30)。其中，￥?1全长71牝口，编码238个氨 基酸，是DHAV-1最重要的结构蛋白之一。对其他小RNA病毒的研究表明，VP1蛋白位于病 毒最外部，是病毒中占有优势的表面结构蛋白，含有多个抗原表位和关键的抗原决定簇，能 诱导机体产生中和抗体，从而产生免疫反应，因而被认为是检测感染该病毒的最可靠的指 示器。刘明等建立了以VP1蛋白作为包被抗原的ELISA检测方法。因此，VP1蛋白可作为 研制新型疫苗和诊断抗原的候选分子，对于鸭肝炎病毒的诊断具有重大作用。但采用大肠 杆菌原核表达蛋白时，常常遇到由于密码子的偏嗜性问题而影响重组蛋白的表达和表达蛋 白的活性低而影响应用等问题。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种密码子优化型VP1基因及其重组蛋白，基 于该重组蛋白制备的胶体金免疫层析试纸在检测DHAV-1抗体方面具有操作简单，灵敏度 高，特异性好等特点。
[0005] 本发明采取的技术方案如下：
[0006] 1、1型鸭甲肝病毒密码子优化型VP1基因（optiVPl)，核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示。
[0007] 优选的，所述基因为针对大肠杆菌表达进行密码子优化获得的VP1基因。
[0008] 2、1型鸭甲肝病毒密码子优化型VP1基因编码的重组蛋白在制备检测I型鸭甲肝 病毒抗体的胶体金免疫层析试纸中的应用。
[0009] 3、胶体金免疫层析试纸，由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，所 述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度彡l.〇mg/ml的所述optiVPl基因编码的重组蛋白包被 而成，质控线由浓度彡〇. 4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度 彡0? 06mg/ml的optiVPl基因编码的重组蛋白和胶体金标记的浓度彡0? 05mg/ml的A抗B IgG包被而成；所述A抗BIgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗另 一种任一种动物IgG。
[0010] 优选的，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度为1. 〇mg/ml的optiVPl基因编码 的重组蛋白包被而成，质控线由浓度为0. 4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由 胶体金标记的浓度为〇. 〇6mg/ml的optiVPl基因编码的重组蛋白和胶体金标记的浓度为 0? 05mg/ml的A抗BIgG包被而成。
[0011] 优选的，所述A抗B IgG为羊抗兔IgG。
[0012] 4、胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：
[0013] (1)硝酸纤维素膜上质控线和测试线的喷制：将optiVPl基因编码的重组蛋白点 于硝酸纤维素膜上形成测试线，将A抗B IgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，37°C干燥 后低温密封保存；
[0014] (2)金标垫的制备：将胶体金标记的optiVPl基因编码的重组蛋白和胶体金标记 的A抗B IgG均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4°C冻干后低温密封保存；
[0015] (3)试纸的组装：分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在底板 上，硝酸纤维素膜上所述质控线一端靠近吸收垫，所述测试线一端靠近金标垫，切割成试纸 条后，干燥密封低温保存。
[0016] 优选的，所述步骤（1)中所述测试线和质控线之间的距离为0. 6cm，测试线和质控 线距硝酸纤维素膜边缘0. 2cm。
[0017] 优选的，所述步骤（2)中所述胶体金标记重组蛋白和A抗B IgG时，金标重组蛋白 的最佳标记pH为每毫升金溶液加入8yl 0. 2mmol/L K2C03溶液，最佳标记量为每毫升金溶 液标记12yg重组蛋白；金标A抗B IgG的最佳标记pH为每毫升金溶液加入6yl 0. 2mmol/ L K2C03溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记10ygA抗B IgG。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明通过优化密码子获得了密码子优化型VP1基因， 将该密码子优化型VP1 (optiVPl)基因的重组蛋白制备成胶体金试纸，并将其用于检测I型 鸭甲肝病毒抗体，获得了性能更高的检测DHAV-1抗体的胶体金试纸。本发明使用密码子优 化型VP1 (optiVPl)基因的重组蛋白作检测试剂可克服使用全病毒作为检测试剂时由于受 病毒培养困难（操作复杂，成本高）和纯度有限（会不同程度掺杂有许多宿主细胞成分） 等方面的技术限制而导致的成本高、稳定性差、难以标准化、检测结果的准确性差（如掺杂 的宿主细胞成分有可能会导致假阳性结果出现）等不足；本发明所述试纸条敏感性高，将 DHAV-1弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按体积稀释到16~32倍，也可以被其检测到；运用该 试纸条检测非免疫鸭阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭疫里默氏菌阳性血清、鸭沙门氏菌阳 性血清、鸭甲型肝炎病毒阳性血清及鸭大肠杆菌阳性血清，结果显示只有鸭甲型肝炎病毒 阳性血清可见两条清晰可见的两条红色条带，呈阳性结果，而其他血清只在C线处可见一 条红色条带，呈阴性结果，表明本发明所述试纸条具有很好的特异性；应用本发明所述试纸 条检测I型鸭甲肝病毒抗体具有良好的批内和批间重复性；本发明制备的试纸条可在4°C 或室温（25 °C)保存数月。
【附图说明】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0020] 图1密码子优化结果，其中，红色氨基酸进行了密码子优化。
[0021] 图2为重组表达载体pET28a(+)-〇ptiVPl的双酶切鉴定结果；其中，1泳 道为重组质粒pET28a (+) -optiVPl用EcoRI单酶切得到的产物；2泳道为重组质粒 pET28a (+)-optiVPl用EcoRI和Xhol双酶切得到的两个片段（所示小片段的分子量大小约 为714bp) ;3泳道为DL15000相对分子质量标准。
[0022] 图3为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定结果；其中，图中1泳道为表达的optiVPl 蛋白（箭头所示蛋白质分子量大小约为32KD) ;2泳道为pET28a(+)空载体表达产物；3泳 道为蛋白质相对分子质量标准。
[0023] 图4为optiVPl重组蛋白可溶性分析，M泳道为蛋白质相对分子质量标准；1泳道 为包涵体，2泳道为上清，3泳道为pET28a (+)空载体表达产物。
[0024] 图5为不同IPTG浓度诱导pET28a(+)-〇ptiVPl表达结果；M泳道为蛋白质相对分 子质量标准，1~7泳道依次为IPTG浓度0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0和1. 2mmol/L时载体表 达产物，8泳道为pET28a(+)空载体表达产物。
[0025] 图6为不同温度诱导pET28a(+)-〇ptiVPl表达结果；1泳道为蛋白质相对分子质 量标准，2~4泳道依次为温度16、25和37°C时载体表达产物，5泳道为pET28a(+)空载体 表达的产物。
[0026] 图7为不同时间诱导pET28a(+)-〇ptiVPl表达结果；M泳道为蛋白质相对分子质 量标准，1~7泳道依次为诱导时间0、2、4、6、8、10和1211载体表达产物，8泳道为口￡128 &(+) 空载体表达的产物。
[0027] 图8为optiVPl重组蛋白的纯化结果；1泳道为未纯化的蛋白，2泳道为纯化的 optiVPl蛋白，3泳道为蛋白质相对分子质量标准。
[0028] 图9为optiVPl重组蛋白免疫原性检测结果；1泳道为以兔抗DHAV-1作为一抗检 测optiVPl重组蛋白（约为32KD)，2泳道为预染蛋白质相对分子质量标准，3泳道为阴性对 照pET28a(+)空载体。
[0029] 图10为胶体金免疫层析试纸条的组装示意图。
[0030] 图11为胶体金免疫层析试纸条的判定结果。
[0031] 图12为试纸条上各物质工作浓度优化结果，其中，A图为优化NC膜T线上optiVPl 重组蛋白包被浓度；B图为优化NC膜C线上兔IgG包被浓度；C图为优化金标optiVPl重组 蛋白和金标羊抗兔IgG工作浓度。
[0032] 图13为胶体金免疫层析试纸条特异性试验结果。
[0033]图14为胶体金免疫层析试纸条敏感性试验结果。
【具体实施方式】
[0034] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[003