一种引发急性溶血性输血反应的a变异型血型的snp位点的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种用于检测ABO血型系统A型变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，为新的A型变异型基因编码区域由起始密码子起第467和第689位碱基。本发明提供了A型变异型基因的新的用途，从而提供了一种有效的对能够引发的急性血管内溶血性输血反应的快速基因诊断、基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血及胎儿绒毛或羊水进行新的A型变异型基因突变位点的快速检测。
【专利说明】
-种引发急性溶血性输血反应的A变异型血型的SNP位点
技术领域
[0001] 本发明属于基因诊断制品技术领域，具体设及一种用于检测AB0血型系统A型变异 型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点。
[0002] 发明背景
[0003] 急性溶血性输血反应(Acute Hemol}ftic Trans化sion Reaction;AHTR) -般在输 血后24h内发生，多于输血后立即发生，是最严重的输血副反应，一旦发生需立即抢救，否则 致死率很高。只要输入5~10ml AB0不相容血液即可出现明显症状;输血量超过200ml，将会 造成严重后果。临床上常表现为血管内溶血，患者有发热、寒战、恶屯、、背痛，随后出现血红 蛋白尿，血红蛋白血症，低血压休克，均应考虑为急性血管内溶血性输血反应，应迅速停止 输血并进行各项检查。同时运一过程会引起补体激活，启动凝血系统，释放缓激肤和儿茶酪 胺，诱发DIC;甚至发生循环与肾功能衰竭;因此通常把低血压休克、DIC、急性肾衰竭称为急 性血管内溶血=联症。
[0004] 无论是在国内或是国外，AB0血型的错误输注是引起急性溶血性输血反应最为常 见的因素，根据美国FDA报告，急性溶血反应死亡159例中139例是AB0血型不合的输血所致。 其次比较常见的是A变异型(A2变异型最为常见）患者因免疫性因素(输血、妊娠或流产)产 生抗A1抗体，如果再次输入A1型血液就造成急性或迟发性免疫性溶血反应。针对此种情况， 必须强调预防的重要性。因此，在进行临床患者AB0血型鉴定时，需要进行正反定型，只有正 反定型相符才能确定患者的AB0血型，由于目前市售商品化的正定性抗-A试剂与A2变异型 也呈现强凝集，反定型实验中只有2-5%的A2型和25%的A2B能够产生抗-A1的抗体，因此，A 变异型极易漏检，从而输注不配合的血液，产生急性或迟发性免疫性溶血反应。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种AB0血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输 血反应的SNP位点，从而弥补现有技术的不足。
[0006]
【申请人】对一个呈常染色体9q34.1-9q34.2显性遗传的A型变异型血型基因的家系 成员进行了测序，找到了该家系成员A型变异型基因存在遗传上的致病突变，造成了 A抗原 数量和质量的改变，并且可W通过免疫刺激产生抗-A1抗体，为了避免其通过输血造成急性 溶血性输血反应，从而促成了本项发明。
[0007] 本发明提供一种用于检测AB0血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输 血反应的SNP位点，为AB0血型基因编码区域由起始密码子起第467和689位碱基。
[000引其中用于检测上述SNP位点的直接扩增及测序引物信息如下：
[0009] AB0-E7F:5'-ATCCGCCTGCCTTGCAGATA-3'SEQ ID NO:1
[0010] AB0-E7R:5'-AGCCTAGGCTTCAGTTACTCACAACA-3'SEQ ID NO:2
[0011] 用于检测上述SNP位点单倍型扩增及测序引物信息如下：
[0012] AB0-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'SEQ ID NO:3
[0013] AB0-E7mo:5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'沈Q ID N0:4
[0014]本发明提供了 ABO血型A型变异型基因检测的新用途，从而提供了一种有效的避免 急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本 发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可W有效的用于临床患者外周血进行AB0血型A型 变异型基因突变位点的快速检测。
【附图说明】
[001引图1:AB0血型A型变异型基因先证者AB0基因突变位点测序图；
[0016] 图2:先证者直接测序图；
[0017] 图3:先证者克隆测序图，先证者AB0基因编码区域由起始密码子起第467位、第689 位碱基发生了突变(nt467C>T;nt689G>T)。
【具体实施方式】
[0018]
【申请人】在一个AB0血型A型变异型基因家系中发现A型变异型基因的突变位点，并 证实该基因的突变是导致A型血型发生变异产生同种抗-A1抗体从而引发急性溶血性输血 反应的致病基因，从而促成了本发明。
[0019] A变异型位于染色体9q34.1-9q34.2,可转录成大约1065bp的mRNA(NCBI登录号为 NM_020469.2)，直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。
[0020] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0021 ] 实施例1:从AB0血型A型变异型基因先证者基因检测确认A型变异型的突变位点。
[0022] 1、提取外周血基因组DNA:
[0023] 在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取AB0血型A型变异型 基因家系成员外周静脉血2-5ml，放入抓TA-N32抗凝管内，-80°C冻存备用；DNA提取使用 LIFE公司的DNA提取试剂盒，具体操作流程如下：
[0024] 冻存的抓TA抗凝血在室溫融化后，取500ul放于离屯、管，加入等体积的红细胞裂 解液(P册.0)，满旋混匀5分钟，12000巧m离屯、5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500ul 满旋混匀5分钟，12000巧m离屯、5分钟，弃上清。
[0025] 沉淀物满旋混匀5分钟，加入核裂解液50ul，满旋混匀5分钟，置于56°C金属浴15分 钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液13加1。满旋充分混匀，至于4°C30分钟。
[00%] 室溫下1200化pm离屯、5分钟，吸取上清液(约200ul)至一新离屯、管中。加入冰乙醇 500ul，反复震荡离屯、管，直至白色DNA沉淀物析出。室溫1200化pm离屯、2分钟，弃上清。向DNA 沉淀加入75%乙醇，漂洗一次，室溫12000rpm离屯、3分钟，弃上清，置于室溫中挥发剩余乙 醇，最后加入50化TE (P册.0)，4 °C过夜溶解DNA。
[0027] 对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和28化m比色，检测 DNA纯度及浓度。
[0028] 2、直接测序法寻找先证者A变异型基因的突变位点
[0029] PCR扩增目的片段:反应条件与反应体系：
[0030] (1 )PCR反应条件:95 °C预变性10分钟；94 °C 60秒，63 °C 90秒，72 °C 60秒，10个循环； 94 °C 60秒，6 rC 90秒，72 °C 60秒，25个循环;72 °C延伸1 Omin，扩增产物10 °C保溫。
[0031 ] (2)反应体系：（TAKARA Ex-hq polymerase)
[0032；
[0033] 应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述AB0-E7F、AB0-E7R引物的扩 增反应。
[0034] PCR产物测序:应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对 AB0-E7F:5 '-ATCCGCCTGCCTTGCAGATA-3 '；AB0-E7R:5 '-AGCCTAGGCTTCAGTTACTCACAACA-3 ' 在 先证者发现AB0血型A基因编码区域由起始密码子起第467位、第689位碱基发生了突变。其 中第467位碱基出现CT杂合序列;第689位碱基出现GT杂合序列。多次测序结果表明该突变 位点并不是因为扩增或测序错误引进的（图：1)。
[0035] 3、对AB0基因第6,7外显子及第6内含子进行单倍型测序，确定先证者A变异型基因 的突变位点
[0036] PCR扩增目的片段引物：480-66111〇:5'-〔66641〇：4161666166〔40(：圳6〇：4-3'；480- E7mo:5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3 \
[0037] PCR扩增引物也可W选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。
[0038] PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系：
[0039] (1 )PCR反应条件:95 °C预变性5分钟;95 °C 30秒，60 °C 30秒，72 °C 50秒，40个循环;72 。(:延伸5min，扩增产物10°C保溫。
[0040] (2)反应体系：（TAKARA LA-Taq polymerase)
[0041；
[0042]应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与
【发明人】设计的克隆测 序的引物进行扩增反应。将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍 型测序引物使用AB0-E6mo : 5 ' -CGGGATCCATGTGGGT GGCACCCTGCCA-3 ' ； AB0-E7mo : 5 ' - GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'（测序引物也可W选用从A型变异基因上设计的，能扩增SNP位 点的其它引物)确定样本的单倍型序列（图3)。该突变为一新发现突变。该突变不存在于下 面的S个数据库中：单核巧酸多态性数据库（f化:/7f化.ncbi . nih. gov/s吨/database/)， 血型基因突变库化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi .fcgi?cmd = b gmut/systems_info&system=abo)，表明该突变非常罕见，该突变导致了编码A血型的蛋白 组成的核巧酸发生改变，A基因编码区域由起始密码子起第467位由C>T，导致了第156位氨 基酸由脯氨酸变为亮氨酸;第689位碱基由6>1'，导致了第230位氨基酸由甘氨酸变为鄉氨 酸;氨基酸的突变从而引起了此A变异型的个体A抗原表位发生缺失，导致运种个体不需要 免疫刺激就能够产生血浆中能够产生同种的抗-A1抗体(天然免疫），当输注正常人的A型血 液时就会发生急性溶血性输血反应，从而危及患者生命。而在近300例正常当地人群的外 周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
[0043] 在青岛市中屯、血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基 因组DNA，应用上述DNA作为模板与AB0-E7F、AB0-E7R引物进行PCR目的片段的扩增，常规 Sanger测序法应用上述运对引物对PCR产物进行直接测序，发现该先证者的两名家系成员 的AB0血型A基因存在本发明中发现的SNP突变，即编码区域由起始密码子起第467位碱基发 生了CT杂合突变，第689位碱基发生了GT杂合突变。继续对发现SNP突变的两位家系成员进 行AB0基因第6,7外显子及第6内含子的单倍型测序，应用上述提取的两名家系成员的基因 组DNA作为模板与AB0-E6mo、AB0-E7mo引物进行PCR目的片段的扩增，将PCR产物克隆入T载 体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型 序列。单倍型测序发现，两位家系成员A基因编码区域由起始密码子起第467位由C>T，导致 了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸;第689位碱基由6>1'，导致了第230位氨基酸由甘氨 酸变为鄉氨酸，与先证者完全一致，而且运两名家系个体血浆中都存在同种抗-A1抗体。
[0044] 通过上述的分析，证明
【发明人】设计的引物可W用来检测个体AB0血型基因是否发 生A基因突变，从而有潜在的发生输血后急性输血型溶血反应的危险。
【主权项】
1. 一种用于检测ABO血型A变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，其特征在于， 所述的SNP位点为A型变异型基因编码区域由起始密码子第467和689位碱基。2. 权利要求1所述的SNP位点在制备用于检测AB0血型中A变异型基因相关制品中的应 用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为用于PCR目的片段扩增及直接 测序的引物对或用于单倍型PCR目的片段扩增及单倍型测序的引物对。4. 一种用于检测AB0血型A变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点的引物对，其 特征在于，所述的引物对用于检测权利要求1所述的SNP位点。5. 如权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述的引物对的序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。6. -种用于检测权利要求1所述的SNP位点的制品，其特征在于，所述的制品包含有权 利要求4所述的引物对。7. 如权利要求6所述的制品，其特征在于，所述的引物对的序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2〇8. 如权利要求6所述的制品，其特征在于，所述的引物对的序列为SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4〇
【文档编号】C12N15/11GK106048059SQ201610648656
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610648656.3, CN 106048059 A, CN 106048059A, CN 201610648656, CN-A-106048059, CN106048059 A, CN106048059A, CN201610648656, CN201610648656.3
【发明人】王海燕, 冯智慧, 李延年, 孙波
【申请人】青岛大学附属医院