锌指核酸酶介导的猪mstn基因突变序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及锌指核酸酶介导的猪MSTN基因突变序列及 其应用。
【背景技术】
[0002] 锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN)是一种由锌指蛋白和FokI核酸内切酶 的剪切结构域重组形成的嵌合蛋白，其中锌指蛋白可特异性结合目的靶序列，FokI核酸内 切酶则负责对DNA序列进行特异性剪切。当两个ZFN分别结合到位于DNA的双链上间隔5 至7个碱基的目的靶序列后，可形成二聚体，进而激活FokI核酸内切酶的功能，使DNA在特 定位点产生双链断裂，再通过同源重组或非同源末端连接修复断裂双链。由于非同源末端 连接修复的可变性导致突变类型的不可预知性，因此通过筛选可以获得靶基因多种突变类 型的细胞克隆。
[0003]MSTN 又称生长分化因子-8 (Growth differentiation factor-8, GDF-8)，属于转 化生长因子-0 (Transforming growth factor- 0，TGF- 0 )超家族，是骨豁肌发育的主要 负调控因子。该基因在不同物种间高度保守，而且在牛、人、羊及狗等物种上都发现了由于 MSTN自然突变而导致肌肉肥大，俗称"双肌"的现象。但到目前为止，未见由于猪的MSTN自 然或人工突变导致"双肌"表型的报道。猪不仅是重要的肉食来源，而且由于其生理特性与 人类相似，又是非常好的疾病动物模型。因此，对猪的MSTN进行突变研究具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种DNA分子。
[0005] 本发明提供的DNA分子是如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0006] 1)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
[0007] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码相同蛋白质的 DNA分子；
[0008] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白质的DNA分 子。
[0009] 本发明的第二个目的是提供上述DNA分子的新用途。
[0010] 本发明提供了上述DNA分子在检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率中 的应用。
[0011] 本发明还提供了上述DNA分子在制备检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦 肉率的产品中的应用。
[0012] 本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉 率的方法。
[0013] 本发明提供的检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率的方法包括如下 步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子是否发生 缺失，以确定待测猪的基因型为野生型、双等位基因突变型还是单等位基因突变型，并根据 所述待测猪的基因型确定所述待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率：基因型为双等位基因突变 型的待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型为单等位基因突变型的待测 猪，基因型为单等位基因突变型的待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型 为野生型的待测猪；
[0014] 所述双等位基因突变型为两条同源染色体的MSTN基因均仅第3781-3791位核苷 酸分子发生缺失的基因型；
[0015] 所述单等位基因突变型为一条同源染色体的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分 子发生缺失，且另一条同源染色体的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子未发生缺失的基 因型；
[0016] 所述野生型为两条同源染色体的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子均未发生 缺失的基因型；
[0017] 所述MSTN基因的序列如序列表中序列3所示。
[0018] 上述方法中，所述检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3781-3791位核 苷酸分子是否发生缺失的方法为测序。
[0019] 本发明的第四个目的是提供一种培育高瘦肉率和/或高肌肉含量的猪的方法。
[0020] 本发明提供的培育高瘦肉率和/或高肌肉含量的猪的方法包括如下步骤：选择上 述双等位基因突变型或单等位基因突变型的猪进行育种。
[0021] 本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉 率的方法。
[0022] 本发明提供的检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率的方法包括如下 步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因为双等位基因突变型、单等位基因突 变型还是野生型；
[0023] 所述野生型为两条同源染色体上的MSTN基因均为野生型MSTN基因；
[0024] 所述双等位基因突变型为两条同源染色体上的MSTN基因均为突变型MSTN基因；
[0025] 所述单等位基因突变型为一条同源染色体上的MSTN基因为突变型MSTN基因，且 另一条同源染色体上的MSTN基因为野生型MSTN基因；
[0026] 所述突变型MSTN基因的序列如序列表中序列2所示；
[0027] 所述野生型MSTN基因的序列如序列表中序列3所示。
[0028] 本发明的第六个目的是提供一种制备高瘦肉率和/或高肌肉含量的猪的方法。
[0029] 本发明提供的制备高瘦肉率和/或高肌肉含量的猪的方法包括如下步骤：将猪的 MSTN基因的第3781-3791位核苷酸缺失，得到瘦肉率和/或肌肉含量提高的猪。
[0030] 上述方法中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列3所示。
[0031] 本发明的第七个目的是提供将猪的MSTN基因的第3781-3791位核苷酸缺失的方 法或产品的新用途。
[0032] 本发明提供了将猪的MSTN基因的第3781-3791位核苷酸缺失的方法或产品在制 备肉率和/或肌肉含量提高的猪中的应用。
[0033] 上述应用中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列3所示。
[0034] 本发明的最后一个目的是提供将猪的MSTN基因的第3781-3791位核苷酸缺失的 产品。
[0035] 本发明提供的将猪的MSTN基因的第3781-3791位核苷酸缺失的产品包括TALEN mRNA 对和 Donor DNA。
[0036] 上述产品中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列3所示。
[0037] 上述产品中，所述Donor DNA的序列如序列表中序列6所示；所述TALEN mRNA对 是根据唯尚立德Talen试剂盒制备得到的一对TALEN mRNA。
[0038] 上述产品中，所述TALEN mRNA对是将Talen左臂和Talen右臂混合得到的，Talen 左臂和Talen右臂主要使用唯尚立德Talen试剂盒中的以下模块制备得到的：从产品盒A 和产品盒B中选取以下模块：GC1、T2、GT3、AA4、CC5、TT6、CC7、CA8和GG9制备Talen左臂； 从产品盒A和产品盒B中选取以下模块：CA1、G2、TA3、AA4、CT5、CT6、TA7、CC8和AG9制备 Talen右臂。上述产品盒A和产品盒B均为唯尚立德Talen试剂盒中的产品。
[0039] 本发明利用锌指核酸酶技术介导猪的肌肉生成抑制素（Myostatin，MSTN)基因 发生碱基缺失，造成移码突变，导致翻译提前终止无法形成MSTN功能蛋白，并获得了 MSTN 基因的3781-3791位核苷酸缺失的MSTN基因突变序列。通过试验证明：MSTN基因的第 3781-3791位核苷酸缺失的猪表现明显的双肌表型，肌肉量和瘦肉率都显著增加。
【附图说明】
[0040] 图1为ZFN的特异结合位点和特异敲除靶位点序列。
[0041] 图2为ZFN定点敲除MSTN基因载体图。
[0042] 图3为ZFN定点敲除MSTN特异位点原理图。
[0043] 图4为MSTN基因突变序列与野生型序列比对图。
[0044] 图5为MSTN基因缺失突变后该基因的DNA、cDNA及氨基酸序列变化示意图。
[0045] 图6为MSTN基因在三种基因型（MSTN+/+、MSTN+/、MSTN 7)梅山猪中的相对定量PCR 结果图。
[0046] 图7为MSTN+/+、MSTN7梅山猪中MSTN蛋白的Western Blot检测结果。
[0047] 图8为MSTN+/+、MSTN+/、MSTN 7梅山猪血清中MSTN蛋白的ELISA检测结果。
[0048] 图9为三种基因型（MSTN+/+、MSTN+/、MSTN 7)梅山猪的代表图。
[0049] 图10为三种基因型（MSTN+/+、MSTN+/、MSTN / )梅山猪的瘦肉率检测结果。
[0050] 图11为三种基因型（MSTN+/+、MSTN+/、MSTN /)梅山猪不同肌肉块重量检测结果。
[0051] 图12为Talen载体示意图。
[0052] 图13为重组PCR示意图。
[0053] 图14为pBR322-TK骨架载体示意图。
【具体实施方式】
[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0056] 实施例1、锌指核酸酶定点敲除MSTN基因
[0057] 野生型成纤维细胞为离体纯种梅山猪原代成纤维细胞，其基因组中的MSTN基因 为野生型MSTN基因（序列表中序列3所示）；
[0058] 突变型成纤维细胞为将离体纯种梅山猪原代成纤维细胞基因组中MSTN基因的第 3781-3791位核苷酸敲除，得到的成纤维细胞，该细胞中为MSTN突