>[0206] 对MSTN 7个体、MSTN +/个体和MSTN +/+个体的背肌中MSTN基因RNA水平的表达情 况进行了相对定量PCR检测。具体步骤如下：
[0207] 1)使用 Trizol (Invitrogen)法提取 F2 代 8 月龄 MSTN 7 个体、MSTN +/ 个体和 MSTN+/+个体组织的总RNA，并使用第一链cDNA合成试剂盒（Fermentas)将mRNA反转录获 得 cDNA。
[0208] 2)分别以MSTN 7个体、MSTN +/个体和MSTN +/+个体的cDNA为模板，采用表5中 MSTN-qPCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0209] 相对定量PCR检测结果如图6所示：和MSTN+/+个体相比，MSTN+/个体没有MSTN基 因的完整转录产物，而MSTN /个体没有MSTN基因转录产物。
[0210] 表5、MSTN基因RNA水平检测引物
[0211]
[0212] 3、Western-blot检测
[0213] 对MSTN 7个体、MSTN +/个体和MSTN +/+个体的组织蛋白样品进行了Western-blot 检测，具体步骤如下：
[0214] 1)取50mg背肌样品在液氮条件下研磨成粉末后转移至装有300 y L蛋白提取液 (Thermo)的离心管中，4°C放置约30min, 12000rpm离心10min，上清即为蛋白溶液。
[0215] 2)使用BCA蛋白分析试剂盒（Thermo)检测所提取的蛋白溶液的浓度，以确定不同 个体的上样体积。
[0216] 3)从MSTN+/+、MSTN+/和MSTN /个体的蛋白样品中分别取20 y g上样于12 %的 SDS-PAGE，70V :30min ;100V :90min 进行电泳。
[0217] 4)电泳完成后，将PAGE胶上的蛋白转移到PVDF膜上，湿转100mA约2h。置于5% 的脱脂牛奶中封闭过夜。
[0218] 5)室温条件下分别孵育一抗（abeam，Cat No. ab55106,1:1000, 2h)和二抗（CST， #7076,1:2000, lh)。孵育抗体后均用TBST洗膜4次，5min/次。
[0219] 6)显色：膜冲洗完成后，将其有蛋白一面浸入事先按1:1比例配好的显色液中 (Thermo#34080)，室温静置约3min。显色完毕后进行底片的曝光及显影定影。
[0220] 检测结果如图7所示：在MSTN /个体中未检测到MSTN成熟肽蛋白，而MSTN +/+和 MSTN+/均检测出大小为26KDa的MSTN成熟肽蛋白。
[0221] 4、ELISA 检测
[0222] 使用猪肌肉生长抑制素酶联免疫分析（ELISA)试剂盒对三种基因型个体 (MSTN +/+、MSTN+/和MSTN 7)血清中的MSTN蛋白进行了定量检测。
[0223] 具体步骤如下：
[0224] 1)试剂、样品和标准品的准备：将试剂盒从4度冰箱取出后放置到室温平衡 15-30min。-80度冰箱中将血清取出放置到冰上彻底融化。将标准品放置在4度冰箱备用。
[0225] 2)加样：将标准品和样品分别依次加入事先包埋好的标准孔中，每个样品3次重 复，37度孵育30min。（标准品的浓度梯度为3、2、1、0. 5和0. 25ng/mL，利用样品稀释液将 血清稀释5倍加样）。
[0226] 3)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如 此重复5次，拍干。每孔加入50 y L酶标试剂37度孵育30min后再按照上述步骤再洗涤。
[0227] 4)显色：每孔先加入显色剂A 50 yL，再加入显色剂B 50 yL，轻轻震荡混匀，37°C 避光显色15分钟，加入终止液终止显色。
[0228] 5)测定：加入终止液15min内测定0D值，并根据测定的0D值做出标准品的标准 曲线，同时，计算样品的浓度。
[0229] 检测结果如图8所示：和MSTN+/+个体与MSTN +/个体相比，MSTN /个体血清中未检 测到MSTN的存在。MSTN+/个体的MSTN蛋白浓度明显低于MSTN +/+个体。
[0230] 经过上述试验证明：MSTN /个体和MSTN +/个体的MSTN基因破坏后机体无法形成 MSTN功能蛋白。
[0231] 四、MSTN突变梅山猪的表型
[0232] 对三种不同基因型（MSTN /、MSTN+/+和MSTN +/ )的梅山猪的表型进行观察。
[0233] 结果如图9所示：与MSTN+/+和MSTN +/梅山猪相比，MSTN /梅山猪表现出明显的 "双肌"现象，其背部更宽，臀部更加丰满。
[0234] 为了检测其"双肌"体型是否由于肌肉量增加导致，对F2代8月龄三种基因型个 体进行了解剖分析，并对每个个体的左边胴体的肌肉进行了剥离称重和统计，并对多个肌 肉块（背最长肌、半膜肌、肱三头肌、腓肠肌和半腱肌）进行单独称重和统计。
[0235] 结果如图10和11所示：MSTN 7猪和MSTN +/猪的瘦肉率显著高于MSTN +/+， MSTN 7猪和MSTN +/猪的各个肌肉块重量均显著高于MSTN +/+，且MSTN 7猪的瘦肉率和各个 肌肉块重量均显著高于MSTN+/猪和MSTN +/+猪。
[0236] 以上结果可以看出：缺失llbp片段或突变后的DNA分子可以用来检测待测猪的肌 肉性状和瘦肉率。
【主权项】
1. 一种DNA分子，是如下1)或2)或3)的DNA分子： 1) 核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码相同蛋白质的DNA分 子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白质的DNA分子。2. 权利要求1所述的DNA分子在检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率中的 应用。3. 权利要求1所述的DNA分子在制备检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率 的产品中的应用。4. 一种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率的方法，包括如下步骤：是检 测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子是否发生缺失，以确 定待测猪的基因型为野生型、双等位基因突变型还是单等位基因突变型，并根据所述待测 猪的基因型确定所述待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率：基因型为双等位基因突变型的待测 猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型为单等位基因突变型的待测猪，基因型 为单等位基因突变型的待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型为野生型 的待测猪； 所述双等位基因突变型为两条同源染色体上的MSTN基因均仅第3781-3791位核苷酸 分子发生缺失的基因型； 所述单等位基因突变型为一条同源染色体上的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子 发生缺失，且另一条同源染色体上的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子未发生缺失的基 因型； 所述野生型为两条同源染色体上的MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子均未发生缺 失的基因型； 所述MSTN基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测猪的两条同源染色体上的 MSTN基因第3781-3791位核苷酸分子是否发生缺失的方法为测序。6. -种培育高瘦肉率和/或高肌肉含量的猪的方法，包括如下步骤：选择权利要求5 所述的双等位基因突变型或单等位基因突变型的猪进行育种。7. -种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率的方法，包括如下步骤：是检 测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因为双等位基因突变型、单等位基因突变型还是 野生型； 所述野生型为两条同源染色体上的MSTN基因均为野生型MSTN基因； 所述双等位基因突变型为两条同源染色体上的MSTN基因均为突变型MSTN基因； 所述单等位基因突变型为一条同源染色体上的MSTN基因为突变型MSTN基因，且另一 条同源染色体上的MSTN基因为野生型MSTN基因； 所述突变型MSTN基因的序列如序列表中序列2所示； 所述野生型MSTN基因的序列如序列表中序列3所示。8. -种制备高瘦肉率和/或高肌肉含量的猪的方法，包括如下步骤：将猪的MSTN基因 的第3781-3791位核苷酸缺失，得到瘦肉率和/或肌肉含量提高的猪； 所述MSTN基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。9. 将猪的MSTN基因的第3781-3791位核苷酸缺失的方法或产品在制备肉率和/或肌 肉含量提尚的猪中的应用； 所述MSTN基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。10. 将猪的MSTN基因的第3781-3791位核苷酸缺失的产品，包括TALEN mRNA对和 Donor DNA ； 所述MSTN基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
【专利摘要】本发明公开了锌指核酸酶介导的猪MSTN基因突变序列及其应用。本发明利用锌指核酸酶技术介导猪的肌肉生成抑制素MSTN基因发生碱基缺失，造成移码突变，导致翻译提前终止无法形成MSTN功能蛋白，并获得了MSTN基因第3781-3791位核苷酸缺失的突变序列。通过试验证明：MSTN基因第3781-3791位核苷酸缺失的猪表现明显的双肌表型，肌肉量和瘦肉率都显著增加。
【IPC分类】C12Q1/68, A01K67/027, C12N15/877, C12N15/12
【公开号】CN105063057
【申请号】CN201510441242
【发明人】崔文涛, 钱丽丽, 汤茂学, 李奎
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月24日