一种异核苷或异核苷联合2’-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白c核酸适配体gbi-10及其制备方法 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸适配体（aptamer)及其制备方法和应用方法，特别涉及一种 异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10及其制备方法和 应用。本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] Aptamer，即核酸适配体，源于拉丁语"aptus"，是由20-60个碱基组成的单链寡 聚核苷酸（RNA)或单链寡聚脱氧核苷酸（DNA)。它能特异结合蛋白、小分子、离子和细胞等 多种靶分子。核酸适配体于1990年由诺贝尔医学奖获得者Szostak和Gold等人发明，其具 有很多抗体难以比拟的优势。核酸适配体是通过SELEX技术筛选得到的，利用该技术可以 从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶标高亲和力结合的核酸适配体（Aptamer)。自 Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4 DNA聚合酶和有机染料分子的特异 寡核苷酸配基后，经过二十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。
[0003] SELEX技术的基本原理是从一个化学合成的大容量寡核苷酸库（RNA/DNA)中，结 合PCR扩增，指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或数十轮筛选过程，获得 高亲和力、高特异性的寡核苷酸配基，即适配体。SELEX的筛选主要包括以下几个部分：（1) 建库：首先人工合成一个含1〇 14_1〇15个单链寡核苷酸序列的随机文库。随机文库可以是 RNA文库，也可以是单链DNA文库，一般随机RNA文库较为常用。单链寡核苷酸的序列两 端是带有限制性内切酶位点的固定序列，中间是20-40个碱基的随机序列。固定序列是为 增加文库的稳定性和为扩增做准备，此固定序列是PCR反应及其他酶学反应相关引物的结 合位点。随机序列不能太短，太短可能导致没有足够的二级结构同靶标分子结合，也不能 太长，太长可能由于全套文库单链寡核苷酸序列一定，导致降低了选择分离出来的配基概 率。（2)筛选：在特定的缓冲体系和选定温度下，将所构建的随机序列库与靶标共同孵育， 能与靶标进行结合的核酸会粘附在靶标上，与靶标无相互作用的核酸则会游离在缓冲体系 中。（3)分离：将孵育后与靶标结合的核酸通过物理的方法分离出来。先通过透析及电泳 等方法将与靶标结合及游离的核酸分离开，然后通过升温等手段将与靶标结合的核酸与靶 标分离开，得到初步能与靶标识别的核酸。（4)PCR扩增：将之前分离得到能与靶标结合的 核酸进行PCR扩增。由于之前分离得到的核酸数目较少，无法满足下一轮筛选的要求，因此 需要进行PCR扩增，增加所筛选得到的核酸的数量。以筛选得到的核酸为模板，在核酸聚合 酶的作用下以指数的形式增长，增加样品的数量，以满足下一轮的筛选。（5)再循环：通过 PCR扩增得到数目充足的能与靶标结合的核酸后，重复之前的筛选工作，通过数轮甚至十几 轮的筛选后，既可得到与靶标进行高特异性，高亲合力结合的核酸适配体。
[0004] 理论上，通过SELEX筛选可以得到针对任何靶标的核酸适配体。利用SELEX筛选 科学家筛选得到了一系列与人类疾病密切相关的核酸适配体，如针对HIV-1逆转录酶、血 管内皮生长因子（VEGF)、核仁素、腱糖蛋白C(TN-C)、凝血酶、hnRNPAl蛋白等的核酸适配 体。其中针对核仁素的核酸适配体AS1411已经完成二期临床实验，其对肾癌和非小细胞肺 癌都有明显的治疗作用，因此开展对核酸适配体的研究工作具有非常重要的意义。
[0005] 目前的核酸适配体绝大多数均是通过SELEX筛选得到。而SELEX过程中的四个重 要步骤：建库、筛选、分离、PCR扩增，对筛选是否成功都具有比较重要的影响。目前通过合 理的设计筛选库和优化分离方法能够大大提高SELEX筛选的成功率。在SELEX筛选中PCR 是比较重要的一个环节。在此环节中以筛选得到的核酸为模板，在DNA聚合酶的作用下进 行扩增。在DNA的合成过程中，由于DNA聚合酶有比较强的选择性，只能识别天然的A、G、 C、T四种核苷酸，所以筛选得到的核酸适配体一般只是A、G、C、T的组合。对于一些理化 性质更好的核苷类似物如UNA、LNA、2' -F-araN等，DNA聚合酶无法将其掺入到核酸适配体 中。这种局限性限制了SELEX的应用。在对目前已经筛选得到的核酸适配体进行UNA、LNA、 2' -F-araN、2' -〇-methyl修饰发现，这些经过修饰的核酸适配体在一定程度上可以优化通 过SELEX筛选到的核酸适配体的理化性质或提高核酸适配体的活性。
[0006] 为了进一步增加核酸适配体与靶标的特异性，优化核酸适配体的理化性质提高核 酸适配体的活性，有必要对核酸适配体进行进一步的优化。而传统的SELEX筛选已经无法 满足此要求。核酸适配体与靶标的识别是一个相互诱导契合的过程。因此在核酸适配体局 部进行一定的微调，能够在保持核酸总体二级结构的前提下增强与靶标的相互作用，提高 核酸适配体的特异性和生物活性。
[0007] 异核苷是指一类碱基由糖基的1'位移至其它位置的核苷。类似于天然核糖，根据 糖基构型的不同，异核苷又可分为D-和L-两种，其中D-构型与天然核苷类型相同，L-构 型则相反。由于异核苷的碱基发生移位，导致异核苷掺入的核酸适配体的局部构象发生改 变。当异核苷掺入的位点为核酸适配体与靶标的作用位点时，碱基空间构象的变化会导致 与靶标的空间距离发生改变，当用两种构型相反的异核苷分别掺入到核酸与靶标的结合位 点时，就会导致一种与靶标的作用距离增加，活性降低，另一种构型异核苷掺入的核酸适配 体与靶标的作用距离缩短，活性增加。因此将异核苷引入到核酸适配体中，通过调整核酸适 配体局部空间构象，可以达到增强与靶标的作用力，进一步提高核酸适配体生物活性的目 的。异核苷的这种修饰策略与SELEX有所不同，SELEX筛选是从众多无序的核酸序列中寻 找到某一条特定的能与靶标特异性结合的核酸，而异核苷修饰策略作用的对象则是对现有 核酸适配体的优化。但它们的目标一致，即通过各种方法得到能与靶标高特异性结合的核 酸适配体。SELEX是一种初期的筛选，异核苷修饰策略是一种后期的优化，异核苷修饰策略 和SELEX筛选方法彼此相互补充和完善了筛选核酸适配体的方法。
[0008] 本发明利用异核苷和2' -脱氧肌苷的组合修饰策略对腱糖蛋白C的核酸适配体 GBI-10进行修饰，都寻找到了能进一步提高与祀标亲合力的核酸适配体。通过体外实验证 明这种异核苷修饰策略优化后的核酸适配体能够明显提高对靶标的生物活性。将这种修饰 策略进行进一步的推广，将有望对各种不同的核酸适配体进行优化，从而得到与靶标特异 性更强，活性更好的核酸适配体，进而推进优化核酸适配体序列在制备治疗癌症或癌症的 早期检测方面的药物或试剂中的应用，实现适配体技术向临床等的应用转化。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种异核苷或异核苷联合2'-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C 核酸适配体GBI-10及其制备方法和应用。本发明通过采用异核苷或异核苷联合2' -脱氧 肌苷对腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10进行组合化学修饰，改变了核酸适配体与靶标结合部 分碱基的空间构象，从而增强了核酸适配体与靶标的相互作用，以达到提高核酸适配体的 稳定性、增强核酸适配体对靶标的特异性以及提高核酸适配体生物活性的目的。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0011] -种异核苷或异核苷联合2'-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10,其 特征在于，是通过在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的15位、18位、21位、26位和32 位其中一位或者多位上掺入异核苷和/或2' -脱氧肌苷，代替天然核苷在相应位置进行偶 联而得到的；
[0012] 其中，所述的异核苷的结构式如化学式I或化学式II所示，化学式I所示的异核 苷为L-构型的异核苷，化学式II所示的异核苷为D-构型的异核苷，所述的2' -脱氧肌苷 的结构式如化学式III所示；Base为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C ;
[0013]
[0014] 修饰前的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0015] 在本发明中，优选的，所述的异核苷或异核苷联合2'-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C 核酸适配体GBI-10选自以下核酸适配体所组成群组中的一种：
[0016] 1)在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18位掺入化学式I所示的异核苷代 替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为腺嘌呤A;
[0017] 2)在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的15位掺入化学式II所示的异核苷 代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为胸腺嘧啶T;
[0018] 3)在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的21位掺入化学式II所示的异核苷 代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为胸腺嘧啶T;
[0019] 4)在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的32位掺入化学式III所示的2'-脱 氧肌苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为胸腺嘧啶T;
[0020] 5)同时在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18位和26位掺入化学式I所 示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，18位Base为腺 嘌呤A，26位Base为胸腺嘧啶T;
[0021] 6)同时在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18位和26位掺入化学式I所 示的异核苷以及在32位掺入化学式III所示的2'-脱氧肌苷代替天然核苷在相应位置进 行偶联而得到的核酸适配体，其中，18位Base为腺嘌呤A，26位和32位Base为胸腺嘧啶 T〇
[0022] 在本发明中，更优选的，是通过同时在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18 位26位掺入化学式I所示的异核苷代替天然核苷在