-四氮唑溶 液；
[0070] 异核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下取0. 231mmol的 {5S- [3-0- (4, 4' -二甲氧基三苯基甲基）-甲基]-4R-0- [ (2-氰乙基-N，N' -二异丙基）-亚 磷酰胺基]-3S-(胸腺嘧啶基四氢呋喃（化学式V所示的异核苷化合物），加入 2. 5ml的无水乙腈，配成92mM溶液；氩气保护下取0. 244mmol的{5R-[3-0-(4, 4' -二甲氧 基三苯基甲基）-甲基]-4S-0- [ (2-氰乙基-N，N' -二异丙基）-亚磷酰胺基]-3R-(胸腺嘧 啶基-1-yl)}-四氢呋喃（化学式IV所示的异核苷化合物），加入2. 5ml的无水乙腈，配成 98mM溶液；
[0071] 2' -脱氧肌苷亚磷酰单体溶液的配制：
[0072] 2' -脱氧肌苷亚磷酰单体溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0. 12M 溶液；
[0073] 采用固相合成的方法合成了天然核苷修饰、异核苷修饰以及异核苷联合2' -脱氧 肌苷修饰的GBI-10序列。在DNA合成仪上，将一个或几个所述的异核苷亚磷酰胺单体或一 个或几个所述的2' -脱氧肌苷亚磷酰胺单体分别或同时掺入到所合成的序列中代替天然 核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个 反应：脱DMT、偶联、封闭、氧化。
[0074] 其中，腱糖蛋白C的核酸适配体序列（GBI-10)修饰前的序列如SEQ ID No. 1所示，
[0075]
[0076] 其中，Base选自腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C。
[0077] 以合成GBI-10-18AL为例，在SEQ ID No. 1所示GBI-10序列的18位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联，即在GBI-10正义链：5' -CCC AGA GGG AAG ACT TTA GGT TCG GIT CAC GTC C-3'（SEQ ID No. 1 所示）的核苷酸序列中 5'端开始 第18个核苷酸（即"A"）的位置处掺入化学式I(L构型，其中Base选自胸腺嘧啶T)所示 的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联，其余以此类推。
[0078] 合成步骤：每次称量约33mgCPG-dC/CPG-dG装入合成柱中，按照ABi394核酸合成 仪的标准步骤，每次合成共84步。正常核苷单体偶联3次，每次180秒，异核苷单体偶联3 次，每次300秒，共计偶联时间15分钟。
[0079] DNA的切割、脱保护：合成结束后，取下CPG，等体积加入质量分数为30 %浓氨水以 及质量分数为25%甲胺水溶液，恒温60°C，摇床振荡反应60分钟，将寡核苷酸从CPG上切 割下来并脱除部分保护基，离心干燥。然后加入适量纯净水溶解，于1万4千转/分钟的离 心机上离心10分钟，将上清取出，离心干燥，将产物放置-80°C下保存。
[0080] DNA的分离纯化：混合物以纯水溶解，HPLC (S印hedax G-25, 50 %乙腈的水溶液） 脱盐，离心干燥。而后HPLC方式纯化，采用如下条件：Dionex-DNA Pac-PA200阴离子交换柱 梯度洗脱，0_40min，10% -30% A 液（B 液：0.02M tris-HClOg^冲液，pH 为 8.0,含有 10% (指体积分数）MeCN ;A液：0. 4mol/L NaC104in B液），流速1. 2ml/min。冷冻干燥所得产物， DEPC水复溶，HPLC(S印hedax G-25)脱盐，冷冻干燥，得到目标单链DNA，-80°C保存。
[0081] 实施例2修饰后的GBI-10序列的基本性质研究
[0082] 1.样品名称：GBI-10序列的18位、21位、26位或32位掺入化学式I或化学式II 所示的异核苷或化学式III所示的2' -脱氧肌苷（其中Base选自胸腺嘧啶T)，代替天然 核苷在相应位置进行偶联得到的修饰后的GBI-10序列，按照实施例1方法制备。
[0083] GBI-10-18A^在GBI-10正义链的18位掺入化学式I所示的异核苷代替天然腺嘌 呤核苷；
[0084] GBI-10-21TD:GBI-10正义链的21位掺入化学式II所示的异核苷代替胸腺嘧啶核 苷；
[0085] GBI-10-32dI :GBI-10正义链的32位掺入化学式III所示的2'-脱氧肌苷代替胸 腺嘧啶核苷；
[0086] GBI-10-18Ay26I；:同时GBI-10正义链的18位和26位掺入化学式I所示的异核 苷代替天然核苷，其中，18位Base为腺嘌呤A，26位Base为胸腺嘧啶T;
[0087] GBI-10-18Ay26I；/32dI :同时在GBI-10正义链的18位和26位掺入化学式I所示 的异核苷以及在32位掺入化学式III所示的2' -脱氧肌苷代替天然核苷在相应位置进行 偶联而得到的核酸适配体，其中，18位Base为腺嘌呤A，26位和32位Base为胸腺嘧啶T。
[0088] 2?方法
[0089] (1) CD光谱分析
[0090] 用PBS溶解GBI-10序列测试样品，所有样品在95°C变性5min后，缓慢降至室温， 待测。⑶扫描范围从200-400nm，温度恒定为25°C，扫描间隔0? 2nm，扫描速度100nm/min， 每个样品重复3次扫描，采用仪器自带软件进行平滑处理。实验结果见图1，CD光谱的紫外 特征吸收峰位于280nm处，波谷位于300nm处。
[0091] 实施例3ELISA测定异核苷修饰及异核苷联合脱氧肌苷修饰的GBI-10序列与腱糖 蛋白C的亲和力
[0092] 1?样品名称：GBI-10-18AL、GBI-10-21TD、GBI-10-32dI、GBI-10-18A L/26TL以及 GBI-10-18Ay26I；/32dI，按照实施例1方法制备。
[0093] 2?方法
[0094] (1)去50pmol TN-C蛋白释至100 y L，溶于pH9. 6的溶液中并加入到96孔板上， 4°C孵育过夜，使蛋白与板充分结合。注意：将样品稀释于加样槽中，排枪加入各孔，保证同 一样品的3个复孔平行。
[0095] (2)吸出蛋白溶液，封闭液洗一次，然后各孔加满封闭液，封闭一小时。封闭液： 1% BSA 的 PBST 溶液。
[0096] (3)样品准备：ssDNA Aptamer干粉（InM) 3. 6万转离心10min，PBS稀释至 250 y L(每孔最终加样量为200pM，故50 y L每孔，3个平行孔共150 y L，为保证最终充 足，可取170ul或加样时每孔加入48yL)取150yL至PCR管中，盖严管盖，PCR仪退火 (95°C 5min后自然冷却至4°C )，取出。微型离心机离心离下管壁上的水蒸气。
[0097] (4)每孔 48ul 加样，37°C孵育 lh。
[0098] (5)PBST 洗一次
[0099] (6)加入（1 :8000)二抗，每孔 80ul，PBS 稀释。37°C孵育 lh。
[0100] (7)PBST 充分洗净。（4_6 次，XSmin，摇床）
[0101] (8)加入TMB (A+B)，现用现配（可在最后一次洗板时配制），每孔100 y L。室温孵 育5-10min，颜色处于深蓝到浅蓝之间即可（最终吸光值1左右为好）
[0102] (9)加入2M H2S04终止反应颜色由蓝色变黄色（2M H2S04:108 . 7mL*H2S04加水至 1L)，注意：操作中每一步吸液过程采用真空吸液栗，保证每孔吸干净。加液过程采用排枪， 保证同一组的样品平行度好。
[0103] 3?实验结果
[0104]单位点异核苷修饰的GBI-10与腱糖蛋白C的亲合力实验结果见表1。双位点异 核苷修饰GBI-10及异核苷/2' -脱氧肌苷组合修饰GBI-10与腱糖蛋白C的亲合力实验结 果见表2。结果说明在GBI-10正义链的18位掺入由化学式I所示化合物制备的异核苷亚 磷酰胺单体IV、在21位掺入由化学式II所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体V、同时在 GBI-10正义链的18和26位掺入由化学式I制备的异核苷亚磷酰胺单体IV以及在32位掺 入由化学式III所制备的异核苷亚磷酰胺单体VI代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置 进行偶联的GBI-10能够显著提高其与腱糖蛋白C的结合力。
[0105] 表1天然及单位点D-/L-异核苷、2' -脱氧肌苷修饰的GBI-10靶标亲合力
[0106]
[0107] 表2双位点D-/L-异核苷组合修饰及其联合2' -脱氧肌苷修饰的GBI-10靶标亲 合力
[0108]
[0109] 实施例4共聚焦成像测定异核苷修饰及异核苷联合脱氧肌苷修饰的GBI-10序列 对高表达腱糖蛋白C的肿瘤细胞系的特异靶向能力
[0110] 1.样品名称：GBI-10-15TD和GBI-10-18Ay26IY，按照实施例1方法制备。
[0111] GBI-10-15TD:GBI-10正义链的15位掺入化学式II所示的异核苷代替胸腺嘧啶核 苷。
[0112] 2.方法
[0113] 分别将适配体GBI-10和异核苷修饰的GBI-10用无血清培养液稀释一定倍数，使 其终浓度为70 y mol/L，备用。
[0114] 分别向1]251和3了3细胞中加入0.25%胰蛋白酶，消化41^11，再加入含血清培养 液终止消化，lOOOrpm离心5min后除去上清液，加入一定量含血清的培养液使细胞密度为 2X 106个/mL。吸取150 y 1加入到激光共聚焦的小皿中，待细胞长至与小皿50%贴合时， 吸尽培养液，分别加入150 y 1上述稀释好的GBI-10和异核苷修饰的GBI-10,于37°C下孵 育45min。用预冷的PBS洗去未被细胞摄入的GBI-10和异核苷修饰的GBI-10,每次清洗时 间持续5~lOmi