相应位置进行偶联而得到的核酸适配 体，其中，18位Base为腺嘌呤A，26位Base为胸腺嘧啶T。
[0023] D-/L-构型异核苷与天然核苷相比具有如下特点：a.碱基从糖环的1'位移到2' 位；b. L构型异核苷的糖环发生翻转，局部构象变化相比D构型核苷较大。导致在氨基酸序 列不变的前提下，采用D-/L-异核苷修饰的核酸适配体与天然的核酸适配体相比构象会发 生一定的变化。当这种修饰位点处于与靶标结合的区域时，则会起到调节与靶标结合的作 用。部分位点掺入异核苷，最终达到提高与靶标的结合力、增强生物活性的目的。2'-脱 氧肌苷的作用与异核苷的作用类似，但它主要通过调整碱基来达到调整局部空间构象的目 的。
[0024] 进一步的，本发明提供了一种制备所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰 的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10的方法，其特征在于，在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正 义链的15位、18位、21位、26位和32位其中一位或者多位上掺入异核苷和/或2' -脱氧 肌苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联；
[0025] 其中，所述的异核苷的结构式如化学式I或化学式II所示，化学式I所示的异核 苷为L-构型的异核苷，化学式II所示的异核苷为D-构型的异核苷，所述的2' -脱氧肌苷 的结构式如化学式III所示；Base为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C ;
[0026]
[0027] 修饰前的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0028] 在本发明所述的化学修饰方法中，优选的，在对核酸适配体进行化学修饰前，将化 学式I、化学式II所示的异核苷化合物和化学式III所示的2'-脱氧肌苷化合物分别制备 成化学式IV、化学式V所示的异核苷亚磷酰胺单体和化学式VI所示的2' -脱氧肌苷亚磷 酰单体，所述的异核苷亚磷酰胺单体和2' -脱氧肌苷亚磷酰胺单体及其合成方法可参见文 献（Hff Yu, LR Zhang, JC Zhuo, LT Ma, LH Zhang, Bioorg. Med. Chem.，1996, 40, 609-614) 〇
[0030]其中，Base为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C。
[0031] 在本发明具体的实施例中，使用固相合成技术，采用亚磷酰胺法合成核酸适配体 的寡核苷酸链，在DNA合成仪上，将一个或几个化学式IV和/或化学式V所示的异核苷亚 磷酰胺单体和化学式VI所示的2' -脱氧肌苷亚磷酰胺单体分别或同时掺入到所合成的腱 糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链序列中代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶 联，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：脱DMT、偶联、封闭、氧化。
[0032] 在本发明中，优选的，在用天然核苷亚磷酰胺单体进行偶联时，每个循环总偶联时 间为9分钟，180秒/次，偶联3次；在用异核苷亚磷酰胺单体或2' -脱氧肌苷亚磷酰胺单 体进行偶联时，每次进样后的偶联时间增加至300秒/次，偶联3次，每个循环总偶联时间 增加至15分钟。由于异核苷或2'-脱氧肌苷常规条件下的偶联收率较低，需增加异核苷亚 磷酰胺单体或2' -脱氧肌苷亚磷酰胺单体的进样次数和每次进样后的偶联时间以保证合 成的效率。
[0033] 以GBI-10-18AL为例，以上所述在SEQ ID No. 1所示GBI-10序列的18位掺入化 学式I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联是指GBI-10正义链：5' -CCC AGA GGG AAG ACT TTA GGT TCG GIT CAC GTC C-3'（SEQ ID No. 1 所示）核苷酸序列中 5' 端开 始第18个核苷酸（即"A"），的位置处掺入化学式I (L构型）所示的异核苷代替天然核苷 在相应位置进行偶联，其余以此类推。
[0034] 研究证明，本发明提供的异核苷修饰的GBI-10-18\具有理化性质稳定、合成效率 高等特点；此外GBI-10-18Ap GBI-10-18Ay26I；(同时在GBI-10的18和26位分别掺入化 学式I所示的异胸苷）、GBI-10-18Ay26I；/32IY(同时在GBI-10的18和26位分别掺入化 学式I所示的异胸苷以及在32位掺入化学式III所示的2' -脱氧肌苷）具有比天然的母 体序列更好的生物活性。
[0035] 在GBI-10的18位掺入化学式I所示的异胸苷、在21位掺入化学式II所示异胸 苷、同时在GBI-10的18和26位分别掺入化学式I所示的异胸苷以及在32位掺入化学式 III所示的2'-脱氧肌苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的修饰后的GBI-10能够 显著提高其与腱糖蛋白C的结合力。
[0036] 因此，更进一步的，本发明提出了所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰 的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10在制备抗肿瘤药物中的应用；以及
[0037] 所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10 在制备肿瘤早期检测试剂中的应用。
[0038] 在本发明中，优选的，所述的异核苷或异核苷联合2'-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C 核酸适配体GBI-10是通过提高其与腱糖蛋白C的亲和力和特异靶向能力而达到抗肿瘤的 目的。
[0039] 相较于现有技术，本发明的优点在于：
[0040] 1.本发明提供的异核苷修饰/异核苷联合2'-脱氧肌苷修饰的GBI-10,具有理化 性质稳定、合成效率高等特点；产物自身具有比天然核酸适体更好的生物活性。
[0041] 2.通过全面考察异核苷/异核苷联合2' -脱氧肌苷在不同位点掺入的核酸适配 体，改善了核酸适配体的血清稳定性增强了核酸适配体与靶标的结合力、提高了核酸适配 体的体外活性。此外，动物实验结果也表明异核苷/异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的核酸 适配体可以提高在动物水平对癌组织的抑制作用，为异核苷修饰的核酸适配体的临床应用 提供了重要的指导意义。
[0042] 3.本发明提供的异核苷和2'-脱氧肌苷化合物能够显著地提高经过其修饰的 GBI-10序列与靶标的特异结合能力，通过靶蛋白亲和力评价实验以及细胞水平的实验发现 GBI-10-18A L、GBI-10-21TD和 GBI-10-18AL/21TD/32dI 够明显提高对腱糖蛋白 C 亲和力，这 为异核苷和2'-脱氧肌苷修饰的GBI-10在以后的临床应用提供了进一步的理论支持。
【附图说明】
[0043] 图1为单位点、双位点异核苷及异核苷联合2'-脱氧肌苷组合修饰的GBI-10对腱 糖蛋白C的亲和力评价结果图；
[0044] 图2为天然的及异核苷、2' -脱氧肌苷修饰的GBI-10的⑶光谱实验结果图；
[0045] 图3为单位点、双位点异核苷及异核苷联合2'-脱氧肌苷组合修饰的GBI-10对高 表达腱糖蛋白C的肿瘤细胞系U251和阴性对照细胞系3T3的共聚焦成像图；
[0046] 图4为单位点、双位点异核苷及异核苷联合2'-脱氧肌苷组合修饰的GBI-10对高 表达腱糖蛋白C的肿瘤细胞系U251和阴性对照细胞系3T3的流式定量分析图。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0048] 本发明中所出现的缩略语的说明：
[0049] AIBN偶氮二异丁腈
[0050] Bu3SnH三正丁基锡氢
[0051] Bz- 苯甲酰基
[0052] DBU 1，8_二氮杂双环（5.4.0) ^-7-烯
[0053]DMAP 4-二甲氨基吡啶
[0054]DMTr 二甲氧基三苯甲基
[0055] DMF N-甲酰二甲胺
[0056] Py 吡啶
[0057] TFA 三氟乙酸
[0058] TMS- 2, 4, 6-三甲基苯磺酰基
[0059] Ts- 对甲苯磺酰基
[0060] 9-BBN 9-硼二环[3. 3. 1]壬烷
[0061] 实施例1异核苷或异核苷联合2'-脱氧肌苷掺入的GBI-10固相合成
[0062] DNA 的合成米用 Appllied Biosystems model 394DNA 固相合成仪。
[0063] 正常的脱氧核苷亚磷酰化单体（dT，dGAc，dABz，dCAc)从上海吉玛制药技术有限 公司购买；CPG(CPG-dG)，CAP-A和CAP-B，氧化12液，Cl 3CC00H从北京奥科生物科技公司购 买；0. 25M的5-乙巯基1H-四氮唑溶液从上海智研科技有限公司（上海）购买。
[0064]按照文献（HWYu,LRZhang,JCZhuo,LTMa，LHZhang, Bioorg. Med. Chem.，1996, 40, 609-614)的方法，将化学式1/化学式II所示的异核苷化合物分别制备成 化学式IV/化学式V所示的异核苷亚磷酰胺单体。即：将单体化合物I/II真空干燥，加3. 5 倍当量的四氮唑，真空干燥过夜，加入5ml无水吡啶，冰浴条件下，加入3. 5当量的的亚磷试 剂，反应完成后蒸干溶剂，于无水无氧条件下采用硅胶柱分离，最终得到白色固体IV/V。采 取同样的方法将化学式III所示的2'-脱氧肌苷化合物制备成化学式VI所示的2'-脱氧 肌苷亚磷酰单体。
[0066] 其中，Base选自腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C。
[0067] 合成规模：~1. 0 y mol
[0068] 核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.12M溶液；
[0069] 1H-四氮唑溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0. 5M 1H