一种特异结合癌症标志物钙网蛋白的核酸适体及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种特异结合癌症标志物钙网蛋白，属于生物领域。
【背景技术】
[0002] f丐网蛋白（Calreticulin)发现至今已有十多年，其主要功能是藏f丐。人妈网蛋 白基因的编码序列有1251个核苷酸，核苷酸序列见GenBank No:匪004343,编码的钙网蛋 白由417个氨基酸组成。近年发现其N-端具有抗肿瘤的作用，已证明钙网蛋白的N-端第 1-180 位氨基酸[J Exp Med，1998; 188 (12) :2349-2356]或第 120-180 位氨基酸[Blood， 1999 ;94(7) :2461-2468]组成的蛋白质可通过抑制肿瘤的新生血管内皮细胞的生长而发 挥抗肿瘤作用。目前该基因可从生物技术公司（http://www.invivogen.com)获得。在肿 瘤发生时，分泌性的CRT在肝癌病人的血清以及膀胱癌患者的尿液中都有上升趋势，除此 之外，对妇科肿瘤如乳腺癌、宫颈癌的研宄也显示相比健康对照CRT的表达量有所增加；用 免疫组化染色研宄胃癌时发现CRT阳性的患者往往伴有远处淋巴结的转移、肿瘤微血管 聚集以及五年存活率低下的症状。然而，由于肿瘤发生发展的机制至今尚未阐明，因此肿 瘤的早期发现也变得越来越重要。
[0003] 在肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。肿瘤标志物 (Tumor Marker，TM)在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观 察等方面都具有较大的实用价值。随着单克隆抗体技术的不断成熟，出现了大量的抗肿瘤 标志物的单克隆抗体，并与特异敏感的免疫学检测技术（RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA 等）相结合，发展了众多的肿瘤标志物检测项目并不断地应用于临床，已成为肿瘤患者的一 个重要检查指标。现有技术中已经有选择CRT作为肿瘤标志物进行方法学的建立及临床试 验，发现肿瘤病人血清中的CRT水平明显高于正常对照。并且建立了针对于肿瘤诊断的CRT 抗体检测的ELISA试剂盒。但是制备相应的抗体比较复杂，成本也高，并不利于大规模的推 广应用。
[0004] 核酸适体（Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革E1标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技 术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)从人工合 成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核 酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子 识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有 很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速 的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种特异结合钙网蛋白的核酸适体及其试剂盒。
[0006] 本发明提供的核酸适体，是如下序列所示： 序列表的序列1-30所示的单链DNA。
[0007] GWDB-1 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCCTTTACTATCCGCCATCATCTTATCATAAGACTTT CTTCTGAACGTTCTCACGCA-3' ； GWDB-2 :5'-ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAACATTCCCGCCTTTACTATCCCCATCATCTGTATCACTTCT GAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-3 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTTCACTAACCCAATTGTTTAACCCACCACCACAAGAACTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-4 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCCAATTGTTTAACCCACCACCACAAGAATCAACAATCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-5 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTACCTGCCAATTACCCTTACCGACCTACACAATCTATCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-6 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATCATGCTCCATCTACTTAATTACCGCCCTCTTCAACTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-7 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTCACAGACAAATCTAACCTCCTAAGAACATTTAACACCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-8 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTCTCTCACTCCGCCTATCCACAATGTTTAATACAAATCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-9 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTATTATGTTATAACACATCACGACCATCTCATCATCTCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-10 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTAACTGTACATCTAACACTCTATCTCAGAACCTTTTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-11 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACCCTGCTCTAAACACTTTACACCTGTCCCAAATCCCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-12 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTACATGTTATTTCACTTTGTCCTCACCACTATACTTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-13 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACACACCTGTTTACCTCCAATTACCCGTTACCACCTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-14 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCATTATTAGACCACTTCCAAAATCTCGTCTCCCATATTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-15 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTACTCTCGTCTCAATCTACACCCCCGACCATCTACCACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-16 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCACTAGATACTTCCACCAAATCGTCAAAACCCATTCTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-17 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATTCCCTGAACAACTACAACCTGCTATAATCTTTATCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-18 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCTACTTCGCTATTACTTTTCTACCAACTCCTTGTTCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-19 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTAACCTTGTCCTCCCAACACACCATGTTTATAACCAACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-20 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACTAACTGTAATCCTCATTTCTCAGATTCCCAACTTCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-21 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTCCCAGTACTTACCACTAACCAATCAGCAATACATTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-22 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTCCCGTTCCTCTACTAATCAAACTGCTTACCCACCCTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-23 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACTACGAATATCTTTTATCTTAATACAGCTTACATTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-24 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCGCCCTCCACACCTCTCCCCTTACATTGTTATCCTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-25 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTCCGATCACTACCATTAACTCTAACACTTGTCCCCCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-26 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTCATTGTCCATATTCTCCTTCCCCATTAGAATCACACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-27 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATGTTCACAACAAATCTAACCTCCTAAAGACATTTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-28 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATACCGCATAAACTTAAATCTCAGACTCCTACAACACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-29 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTACTTACCCACTTTCTTGTTAATAAGACGATACCTCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-30 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCAAATCTCAGAAACCCATTCTCTACACACCTTGTACCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3, 〇
[0008] 所述核酸适体与钙网蛋白CRT具有较好的亲和能力。
[0009] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e) 将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后