n。加入4%多聚甲醛100yL，室温下固定15~20min。加入预冷的PBS 清洗后再加入Hoechst 33342 100 y L进行细胞核染色30min ;用预冷的PBS漂洗3次，每 次持续至少lmin，加入150 y L预冷的PBS后进行激光共聚焦实验。
[0115] 3?实验结果
[0116] 单位点、双位点异核苷修饰GBI-10与高表达腱糖蛋白C的细胞系U251和阴性对 照细胞系3T3的共聚焦成像实验结果见图3。结果说明同时在GBI-10的18和26位掺入由 化学式I制备的异核苷亚磷酰胺单体IV代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联 的GBI-10能够显著提高其对肿瘤细胞的特异靶向能力。
[0117] 实施例5流式分析定量测定异核苷修饰及异核苷联合脱氧肌苷修饰的GBI-10序 列对高表达腱糖蛋白C的肿瘤细胞系的特异靶向能力
[0118] 1?样品名称：GBI-10-15TD和GBI-10-18Al/26I；，按照实施例1方法制备
[0119] 2.方法
[0120] 分别将GBI-10和异核苷修饰的GBI-10用无血清培养液稀释一定倍数，使适配体 终浓度为120ng/mL，备用。
[0121] 分别向U251和3T3细胞中加入0. 25%胰蛋白酶消化4min，再加入含血清培养液 终止消化，lOOOrpm离心5min后除倒去上清液，加入一定量含血清的培养液使细胞密度为 2 X 106个/ml。吸取2ml加入到6孔板中，待细胞长满孔板底面积的70~80%时，吸尽培养 液，分别加入2ml稀释好的GBI-10和异核苷修饰的GBI-10,于37°C下孵育45min。用预冷 的PBS洗去未被细胞摄入的GBI-10和异核苷修饰的GBI-10,每次清洗时间持续5~lOmin。 用0. 25%胰酶消化细胞后，加入含血清培养液终止反应，lOOOrpm下离心5min后除去上清 液。加入lml预冷的PBS重悬细胞，lOOOrpm离心5min，重复该步骤3次。最后以400 yL PBS重悬细胞，过细胞筛后收集至流式管中，进行流式细胞术实验。
[0122] 3.实验结果
[0123] 单位点、双位点异核苷修饰GBI-10与高表达腱糖蛋白C的细胞系U251和阴性对 照细胞系3T3的流式细胞定量分析实验结果见图4。结果说明同时在GBI-10的18和26位 掺入由化学式I制备的异核苷亚磷酰胺单体IV代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进 行偶联的GBI-10能够显著提高其对肿瘤细胞的特异靶向能力。
[0124] 本文显示并详细记载描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选 实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对 本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外 的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指"一个和唯一"，而 是指"一个或更多"。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加 实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的 权利要求所涵盖。
[0125] 此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包 括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步 骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来 说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形 式、试剂盒合成细节上做出各种改变和修饰。
【主权项】
1. 一种异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10,其 特征在于，是通过在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-IO正义链的15位、18位、21位、26位和32 位其中一位或者多位上掺入异核苷和/或2' -脱氧肌苷，代替天然核苷在相应位置进行偶 联而得到的； 其中，所述的异核苷的结构式如化学式I或化学式II所示，化学式I所示的异核苷为 L-构型的异核苷，化学式II所示的异核苷为D-构型的异核苷，所述的2' -脱氧肌苷的结 构式如化学式III所示；Base为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C ;修饰前的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸 适配体GBI-10,其特征在于，所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C 核酸适配体GBI-10选自以下核酸适配体所组成群组中的一种： 1) 在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18位掺入化学式I所示的异核苷代替天 然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为腺嘌呤A ; 2) 在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的15位掺入化学式II所示的异核苷代替 天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为胸腺嘧啶T ; 3) 在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的21位掺入化学式II所示的异核苷代替 天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为胸腺嘧啶T ; 4) 在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的32位掺入化学式III所示的2' -脱氧 肌苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，Base为胸腺嘧啶T ; 5) 同时在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18位和26位掺入化学式I所示的 异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中，18位Base为腺嘌呤 A，26位Base为胸腺嘧啶T ; 6) 同时在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18位和26位掺入化学式I所示的 异核苷以及在32位掺入化学式III所示的2' -脱氧肌苷代替天然核苷在相应位置进行偶 联而得到的核酸适配体，其中，18位Base为腺嘌呤A，26位和32位Base为胸腺嘧啶T。3. 根据权利要求2所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸 适配体GBI-10,其特征在于，是通过同时在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链的18位 26位掺入化学式I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体， 其中，18位Base为腺嘌呤A，26位Base为胸腺嘧啶T。4. 一种制备权利要求1-3任一项所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱 糖蛋白C核酸适配体GBI-10的方法，其特征在于，在腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10正义链 的15位、18位、21位、26位和32位其中一位或者多位上掺入异核苷和/或2'-脱氧肌苷， 代替天然核苷在相应位置进行偶联； 其中，所述的异核苷的结构式如化学式I或化学式II所示，化学式I所示的异核苷为 L-构型的异核苷，化学式II所示的异核苷为D-构型的异核苷，所述的2' -脱氧肌苷的结 构式如化学式III所示；Base为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C ;修饰前的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-IO正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在对腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10进行 化学修饰前，将化学式I、化学式II所示的异核苷和化学式III所示的2' -脱氧肌苷分别 制备成化学式IV、化学式V所示的异核苷亚磷酰胺单体和化学式VI所示的2' -脱氧肌苷 亚磷酰单体； 其中，Base为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用固相合成技术，采用亚磷酰胺法合成 核酸适配体的寡核苷酸链，在DNA合成仪上，将一个或几个权利要求5所述的异核苷亚磷 酰胺单体、2' -脱氧肌苷亚磷酰胺单体分别或同时掺入到所合成的腱糖蛋白C核酸适配体 GBI-10正义链序列中代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联，每偶联一个核苷为 一个循环，每个循环包括四个反应：脱DMT、偶联、封闭、氧化。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在用天然核苷亚磷酰胺单体进行偶联时， 每个循环总偶联时间为9分钟，180秒/次，偶联3次；在用异核苷亚磷酰胺单体或2' -脱 氧肌苷亚磷酰胺单体进行偶联时，每次进样后的偶联时间增加至300秒/次，偶联3次，每 个循环总偶联时间增加至15分钟。8. 权利要求1-3任一项所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C 核酸适配体GBI-10在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌 苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10是通过提高其与腱糖蛋白C的亲和力和特异靶向 能力而达到抗肿瘤的目的。10. 权利要求1-3任一项所述的异核苷或异核苷联合2' -脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C 核酸适配体GBI-10在制备肿瘤早期检测试剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种异核苷或异核苷联合2’-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10及其制备方法和应用，属于生物医药领域。本发明采用异核苷或异核苷联合2’-脱氧肌苷对腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10的不同位置的核苷酸进行替换，改变核酸适配体的局部空间构象，优化其空间结构，从而得到一种异核苷或异核苷联合2’-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10。实验证明经过该方法修饰后的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10与靶蛋白有更强的亲和能力和更特异性的靶向识别作用，且有更高的生物活性。因此，有希望将异核苷或异核苷联合2’-脱氧肌苷修饰的腱糖蛋白C核酸适配体GBI-10制备成高效，高选择性，低毒副作用的抗肿瘤药物，也可将其应用于肿瘤早期检测试剂中。
【IPC分类】A61K31/7115, C12N15/115, C07H19/173, C07H19/20, G01N33/574, A61P35/00, C07H1/00
【公开号】CN105063055
【申请号】CN201510490310
【发明人】杨振军, 李昆峰, 邓家荔
【申请人】北京大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月11日