变基因（序列表中序列2 所示）。
[0059] 突变型成纤维细胞是通过ZFN质粒导入野生型成纤维细胞得到的。
[0060] ZFN质粒为sigma公司的一对ZFN质粒，其特异靶位点序列为CCTTCCCAGGACcagga GAAGATGGGCTGGTA (对应序列表中序列3所示的MSTN基因5'末端第3770-3801位核苷酸）。
[0061] 具体步骤如下：
[0062] 一、ZFN质粒的设计与构建
[0063] 1、ZFN质粒的设计
[0064] 构建定点敲除梅山猪MSTN基因靶序列特异位点的锌指核酸酶（ZFN)质粒pZFN质 粒，ZFN由一个DNA结合域和DNA切割结构域组成，ZFN对特异识别结合多编码区内24bp碱 基，保证ZFN切割MSTN基因的高度精确与高效。
[0065]锌指核酸酶（ZFN)特异敲除靶位点序列位于MSTN基因的第二外显子，特异靶 位点序列为CCTTCCCAGGACcaggaGAAGATGGGCTGGTA (对应序列表中序列3所示的MSTN基 因5'末端第3770-3801位核苷酸），具体如图1所示，其中，两端序列（CCTTCCCAGGAC与 GAAGATGGGCTGGTA)是ZFN的特异结合位点，中间部分序列（cagga)是ZFN特异敲除的靶序 列位点。
[0066] 2、ZFN质粒的构建
[0067] ZFN质粒（pZFN)由sigma公司构建完成（为一对质粒），ZFN质粒的示意图如图2 所示，其中ZFN为含有靶位点结合序列的片段。
[0068] ZFN质粒特异敲除靶序列位点的原理如图3所示，在MSTN基因的核苷酸序列上设 计打靶效率最高的目的敲除位点，锌指核酸酶能够识别并结合指定的位点，双体FokI高效 且精确地切断靶DNA产生双链DNA的断裂，随后细胞通过"同源定向修复"或"非同源末端 连接"一DNA天然修复过程来治愈靶点的断裂，其中非同源末端连接会造成目的基因切口 处碱基片段的缺失、突变或插入部分碱基序列进而实现对基因的定点修饰，破坏其功能，最 终改变动物的特异性状。
[0069] 二、锌指核酸酶定点敲除MSTN基因
[0070] 1、猪胎儿成纤维原代细胞分离培养
[0071] (1)选取怀孕35天的纯种梅山妊娠母猪（太仓市种猪场）作为实验动物，通过手 术方式取出含有胚胎的子宫，置于无菌烧杯中，封口膜封口带入实验室；
[0072] (2)在无菌超净台内将胚胎周围的包膜剔除，将胚胎放于无菌的加有PBS的烧杯 中；
[0073] (3)将胚胎逐个转移至小的无菌培养皿中，用无菌的剪刀和镊子去除胚胎的头、尾 及四肢后，将组织剪成1_ 3大小的小块，并加入少许血清使组织湿润；
[0074] (4)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距约0. 2cm-0. 5cm，小块涂布好之后，轻轻 翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后向瓶内加入适量培养基，盖好瓶塞，放置于37°C培养箱中；
[0075] (5)培养约8小时，待小块贴壁后，将培养瓶缓慢翻转平放，待细胞覆盖培养皿 80%左右即可冻存或传代，得到离体纯种梅山猪原代成纤维细胞。
[0076] 2、核转染 pZFNs
[0077] 将ZFN质粒转染到梅山猪原代成纤维细胞，得到转染后细胞，具体使用Lonza公司 提供的电车专试齐丨J Amaxa Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fibroblasts 及核转染仪进行转染实验，具体操作：
[0078] (1)将离体纯种梅山猪原代成纤维细胞解冻复苏，培养至细胞融合率约为90%， 用于转染；
[0079] (2)将核转染溶液（Nucleofector Solution)与添加物（Supplement)(试剂盒中 含有）按体积比4. 5 :1的比例配制核转染溶液室温预热，单个样品转染可取82uL核转染溶 液加入18uL添加物配制成100uL核转染溶液；
[0080] (3)吸去培养基，加入10mL预热至37°C的DPBS冲洗一遍，吸除DPBS ;
[0081] (4)加入2mL预热至37°C的0? 1 %胰酶溶液，室温消化约3min ;
[0082] (5)加入2mL含10 % FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器反复吹打数次，至细 胞全部均匀重悬在培养基中；
[0083] (6)将细胞转移至15mL离心管中，取部分进行细胞计数，剩余细胞1000g离心 5min；
[0084] (7)弃上清液，用微量加样器去除残留培养基，加入提前室温预热的核转染溶液， 重悬细胞，使细胞密度在1 x 106/100uL ;
[0085] (8)向细胞悬液中加入步骤一的2中制备的pZFN质粒，使质粒浓度为5ug/100uL， 轻轻吹吸混匀后转移到电击杯中，注意样品必须能够覆盖电击杯底部且避免生成气泡；
[0086] (9)打开核转染仪，选择进入已优化好的程序（T-016)，将电击杯放入电击槽中， 按enter键开始电击；
[0087] (10)程序结束后取出电击杯，沿电击杯内壁缓缓加入500uL预热的培养基，迅速 将样品转移到加有20% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，得到转 染后细胞。
[0088] 3、有限稀释法制备单细胞克隆及基因型鉴定
[0089] (1)将上述步骤2得到的转染后细胞培养至融合率达80 % -90 %时，用37 °C的 0. 1 %胰酶消化，10% FBS的DMEM培养基终止消化后离心收集细胞。
[0090] (2)20% FBS的DMEM培养基重悬细胞，取部分细胞进行计数，将细胞稀释至100个 /mL，向20个已添加9mL 20% FBS的DMEM培养基的100mm培养皿中各加入lmL细胞悬浮 液，37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养。
[0091] (3)待培养皿中的细胞克隆生长至直径达2mm以上时，去除培养基，DPBS冲洗后， 用牛津杯罩在克隆团上，向其中滴加约20 yL 37°C的0. 1 %胰酶，消化约3分钟后，滴加 20% FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻吹打后将其转移至48孔板中扩大培养。
[0092] (4)48孔板中细胞融合率达90%时，消化后取一半细胞用于细胞克隆基因型鉴 定，剩余一半继续在孔板中培养。
[0093] (5)用于鉴定的细胞经过1000g离心5min后，弃上清，依据细胞沉淀量加入 10-20 y L细胞裂解液。
[0094] (6)吸取3 y L细胞裂解液为模板进行PCR鉴定，以表1中的引物进行PCR扩增。
[0095] PCR 反应体系：10 y L 5XBuffer、l y L 10mMdNTP、l y L 25 yM 正向引物、1 y L 25 yM反向引物、0.5 yL Roche Expand High FidelityPLUS Polymerase、200ng基因组DNA， 加超纯水至50 yL。
[0096] PCR 扩增程序：95°C 5min ;94°C 20s，退火温度 58°C，72°C 30s，循环 30 次，最后 72°C 延伸 5min。
[0097] PCR扩增产物送测序公司测序。
[0098]表1、扩增MSTN-基因组DNA目的片段的引物
[0099]
[0100] (7)DNA测序结果经Bioedit软件与NCBI中梅山猪的MSTN序列进行比对，发生突 变的序列对应的细胞克隆确定为阳性细胞，对该细胞进行冻存。另外，测序结果中出现套 峰的序列，需要将其PCR产物进行回收（使用QIAGEN琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒），使用 TakaRa D101A试剂盒，将其连接pMDR18-T载体上，转化DH5 a感受态细胞后，每条序列挑取 约20个单菌落进行测序，以鉴定套峰是由于单等位基因突变还是不同类型的双等位基因 突变造成的。
[0101] 测序结果表明：阳性细胞中单等位基因突变的MSTN基因为将一条染色体中野生 型MSTN基因的第3781-3791位核苷酸敲除得到的DNA分子（序列表中序列2所示），将该 阳性细胞命名为突变型成纤维细胞。
[0102] 野生型成纤维细胞基因组中的MSTN基因为野生型MSTN基因（序列表中序列3所 示）；
[0103] 突变型成纤维细胞基因组中的MSTN突变基因（序列表中序列2所示）为将野生 型MSTN基因的第3781-3791位核苷酸敲除得到的DNA分子。
[0104] 可以看出，突变型成纤维细胞和野生型成纤维细胞的不同仅在于MSTN基因上是 否存在序列3中第3781-3791位核苷酸的缺失，将序列3中第3781-3791位核苷酸命名为 缺失片段（llbp)，该缺失片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0105] 下面的实验研究野生型MSTN基因的第3781-3791位核苷酸敲除会对猪的表型带 来的影响。
[0106] 实施例2、MSTN突变基因的应用
[0107] 一、利用TALEN敲除MSTN基因制备突变型成纤维细胞
[0108] 野生型成纤维细胞为离体纯种梅山猪原代成纤维细胞，其基因组中的MSTN基因 为野生型MSTN基因（序列表中序列3所示）；
[0109] 突变型成纤维细胞为将离体纯种梅山猪原代成纤维细胞基因组中MSTN基因的第 3781-3791位核苷酸敲除，得到的成纤维细胞，该细胞中为MSTN突变基因（序列表中序列2 所示）。
[0110] 突变型成纤维细胞是通过将TALEN mRNA对和Donor DNA导入野生型成纤维细胞 得到的。
[0111] TALEN mRNA对是根据唯尚立德Ta