专利名称：密码子优化的猪cd40l基因及表达其编码蛋白的重组杆状病毒的制备方法
技术领域：
本发明涉及密码子优化的猪CD40L基因及表达其编码蛋白的重组杆状病毒的制备方法，属于基因工程领域。
背景技术：
猪⑶40L分子是肿瘤坏死因子受体⑶40分子的配体，主要表达于活化的⑶4+T淋巴细胞表面。天然的CD40L分子以两种形式存在，即为可溶型和跨膜型，当前研究较深入的为跨膜型CD40L。猪⑶40L分子为一个II型跨膜糖蛋白，全长cDNA编码261个氨基酸残基(AA)，其中氨基未端22个AA组成CD40L分子的胞浆段，紧接的23个AA构成跨膜段，羧基端的216 个AA组成CD40L的胞外段。猪CD40L cDNA的编码蛋白约^kDa。猪CD40L与其受体CD40分子在机体免疫应答中起到至关重要的作用，对调节体液免疫和细胞免疫反应具有枢纽作用。CD40L与CD40相结合参与B淋巴细胞的发育分化以及免疫球蛋白的类型转换；促进T淋巴细胞的激发和定向活化；参与抗原递呈细胞的分化和功能调节。诸多资料表明，CD40L可作为一种新型的免疫增强剂调节动物机体免疫应答，因此建立一种猪的CD40L表达体系，为进一步实验研究奠定基础。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养操作简单，转化转导效率高，生长繁殖快周期短，抗污染能力强，成本低廉，可以快速大规模生产目的蛋白等优点，表达的外缘蛋白能够占到细菌总蛋白的30%。因此大肠杆菌表达系统在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。编码氨基酸的密码子具有简并性，而每种生物对同义密码子的选择都有自己的偏好性。目的基因的表达受到多方面因素的影响，如遗传密码的偏嗜性、目的蛋白的结构，表达系统选择的表达条件等，其中根据表达宿主的密码子偏好性对目的基因进行优化，能够大大提高表达宿主的表达效率，从而提高目的蛋白的表达量。
发明内容
本发明的目的是提供密码子优化的猪CD40L基因，符合昆虫细胞密码子偏嗜性， 适合在杆状病毒系统中进行表达。同时，还提供表达该基因编码蛋白的重组杆状病毒的制备方法。本分明提供一种密码子优化的猪⑶40L基因，包括SEQ ID N0:3所示的序列。所述密码子优化的猪CD40L基因，其序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4或SEQ ID N0:5所示。本发明提供表达上述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法(1)将所述基因与质粒pFast Dual相连，构建重组质粒；
(2)将所述重组质粒转化入DHlOBac，通过蓝白斑筛选获得卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性的重组DHlOBac ；(3)将所述重组DHlOBac转染Sf_9细胞获得重组杆状病毒。所述重组杆状病毒表达的猪⑶40L蛋白经SDS-PAGE电泳，图谱上出现分子量约为 ^kD的蛋白；Western-blot试验显示在^kD左右出现能够与兔抗猪CD40L多克隆抗体结合的特异性条带。本发明提供密码子优化的猪CD40L基因，符合昆虫细胞密码子偏嗜性，适合在杆状病毒系统中进行表达，表达出的猪CD40L分子生物活性高，能够增强机体的免疫应答能力。
图1是RT-PCR产物的电泳图其中，I-RT-PCR产物，2-分子量2000bp的标准Marker图2是载体pMD-P⑶40L的酶切鉴定电泳图其中，1-分子量2000bp的标准Marker，2_PMD_P⑶40L重组载体的酶切产物；图3是载体pET-P⑶40L的酶切鉴定电泳图其中，1-分子量2000bp的标准Marker，2-pET_PCD40L的酶切产物；图4是表达蛋白的SDS-PAGE电泳图其中，1-蛋白标准Marker，2 5_诱导时间分别为3、4、5、他时表达蛋白，6_诱导菌超声后上清，7-诱导菌超声后沉淀，8-纯化的重组蛋白；图5是不同浓度IPTG诱导后，表达蛋白的SDS-PAGE电泳图其中，1-蛋白标准Marker，2 6-IPTG 诱导浓度分别为 0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. OmM ；图6是SCD40L基因的PCR产物电泳图其中，1、2-PCR产物，3-分子量2000bp的标准Marker图7表示重组穿梭载体的鉴定电泳图其中，1-阴性对照，2-分子量为15000的DNA标准Marker，3-Bac_PCD40L重组载体基因，4-Bac-LhCD40L重组载体基因，5-Bac_MI^sCD40L重组载体基因；图8表示重组杆状病毒PCR鉴定电泳图其中，I-DNA标准Marker, 2-Bac_PCD40L 重组杆状病毒，3-Bac-LZsCD40L 重组重组杆状病毒，4-BaC-MI^Sra40L重组杆状病毒，5-空载体重组杆状病毒；图9重组杆状病毒表达蛋白SDS-PAGE电泳图 其中，1-蛋白质标准Marker，2_PCD40L重组杆状病毒表达蛋白，3-Us⑶40L重组重组杆状病毒表达蛋白，4-MLZsCD40L重组杆状病毒表达蛋白，5-为空载体重组杆状病毒表达蛋白；图10表示重组杆状病毒表达蛋白WesternBlot鉴定其中，1-为蛋白质标准预染Marker，2_MI^Sra40L重组杆状病毒表达蛋白， 3-Lhra40L重组杆状病毒表达蛋白，4-p⑶40L重组杆状病毒表达蛋白。
具体实施例方式实施例1猪CD40L目的基因的克隆与密码子优化(1)猪⑶40L目的基因的克隆本发明构建的猪⑶40L表达体系，以NCBI核酸数据库收录、编号为AB040443的 ⑶40L为引物设计的模板进行引物设计P1、P2 Pl:actagtgcaccgccgcctggataaP2 :aagcttttacagcttcagcaggccgaagc分离获得健康猪外周血淋巴细胞，以含有白介素2(IL_2)、体积浓度为10%小牛血清的RPMI1640培养液培养3d后，以终浓度10ug/ml的ConA刺激培养IOh后提取总RNA。 通过RT-PCR方法扩增猪CD40L基因以P2为引物，以总RNA为模板，经反转录反应获得cDNA。反转录过程如下，将下列试剂加入无RNA酶的离心管中总RNA模板4 μ L、dNTPs (2. 5mM) 1 μ L、P2弓丨物1 μ L、 H2O 7111^，将上述离心管651加热5min后迅速置冰盒上冷却2min，低转速离心后加入 5 X buffer 4 μ L、RNA 酶抑制剂 QOIU/μ 1) 1 μ L、0. IM DDT 1 μ L、M-MLV 反转录酶 1 μ L，使总体积为20 μ L。将上述组分混合后，于37°C温浴50min后，72°C放置15min灭活M-MLV反转录酶，立即置冰上冷却，至此就获得了 cDNA，置于_20°C保存备用。猪⑶40L基因的获得PCR扩增反应体系如下cDNA(反转录反应的产物)5yL、 MgCl2(25mM)3y L,dNTPs(2. 5mM) 4 μ LUO XEx PCR buffer 5μ L.Ex Taq酶O. 5 μ L、P11 μ L、 Ρ21 μ L，用ddH2030. 5 μ L补加至总体积50 μ L。将上述反应体系混勻后进行PCR扩增，反应的参数为94°C预变性5min ;PCR循环为-MV lmin，51°C退火lmin，72°C lmin，共；35个循环；72°C延伸lOmin。全部反应结束后，取5μ L PCR产物，用1. O %琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增结果，如图1所示，猪⑶40L基因大小约为786bp。使用TaKaRa公司的连接试剂盒将纯化的PCR产物与pMD18T载体连接，具体操作依照试剂盒说明书，反应体系如下纯化的PCR产物4. 5 μ L、pMD18-T载体0. 5 μ L、 solution I 5. 0 μ L，总体积为10.0 μ L。瞬时离心混勻，置于16°C连接过夜(连接作用时间为1 左右)；连接产物直接用于转化大肠杆菌Dffia感受态细胞。挑取转化单菌落接种 LB培养液，37°C摇荡培养过夜。按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取上述转化后的大肠杆菌Dffia中的质粒，用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，酶切反应体系为30ul，具体组分如下重组质粒 5yL、dd H2O 20 μ L、10XK Buffer 3 μ L、BamH I 1 μ L、Hind III 1 μ L，总体系为 30 μ L。瞬时离心混勻后37°C酶切反应4h，取10 μ L酶切产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的重组质粒命名为PMD-CD40L。鉴定正确的阳性菌落送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测得的基因序列如SEQ ID Ν0:1所示，此序列即为猪CD40L基因序列。(2)猪CD40L基因的优化密码子优化的猪CD40L基因根据大肠杆菌和昆虫细胞密码子使用偏好性，使用 Mac Vector 7. 2软件分析猪⑶40L基因(SEQ ID NO :1)，找出其使用密码子偏好与大肠杆菌及昆虫细胞密码子使用偏好不同的密码子位点。在不改变氨基酸序列的前提下，选择大肠杆菌和昆虫细胞使用频率均较高的密码子。利用TakaRa MutanBEST Kit进行多次定点突变操作，操作步骤依照试剂盒说明书进行，得到密码子优化后的猪CD40L基因命名为PCD40L。将POT40L基因与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌Dffia中，酶切结果如图2所示，DNA序列大小约为786bp，测得的序列如SEQ ID NO 2所示，获得的载体质粒命名为 pMD-pCD40L。实施例1中所用到的试剂分别购自ExTaq DNA聚合酶、dNIPs、T4DNA连接酶、DNA Marker、DNA纯化试剂盒、限制性核酸内切酶BamH I和Hind III购自大连宝生物公司；淋巴细胞分离液、饱和平衡酚(PH8. 0)，购自上海生物工程有限公司；酵母提取物、蛋白胨购自 OXOID公司；RPMI1640培养液购自普飞生物公司；Trizol试剂购自hvitrigen公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。实施例2兔抗猪CD40L多克隆抗体的制备(一)猪⑶40L目的基因原核表达1. pET-PCD40L表达载体的构建以质粒小量提取试剂盒分别提取PMD-P⑶40L载体质粒、pET32a表达载体质粒， 用限制性内切酶BamH I，Hind III对PMD-P⑶40L质粒和空的pET3h(+)载体分别进行双酶切，酶切反应体系为30ul，具体组分如下质粒5yL、ddH20 20 μ LUOXK Buffer 3 μ L、 BamH I 1 μ L, Hind IIIlyL0酶切后进行琼脂糖电泳分离目的基因片段。胶回收试剂盒分别回收PCD40L目的片段、pET32a质粒片段，DNA T4连接酶连接反应，构建pET_PCD40L重组载体。连接产物转入宿主菌大肠杆菌BL21 取连接产物IOul转化感受态BL21100ul，轻轻混勻内容物，冰浴30min ；42°C热休克90s ；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37°C振荡45min，用无菌玻璃涂布器均勻涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37°C倒置培养10-14h。2. pET-PCD40L重组表达载体的鉴定纯化挑取步骤1培养后的白色单菌落接种于^ilLB液体培养液中，37°C振荡14h。质粒小量提取试剂盒提取质粒PET-PCD40L，进行双酶切鉴定(酶切体系同上)并进行琼脂糖电泳。电泳图如图3所示，证明pET-P⑶40L表达载体构建成功。获得的菌命名为⑶40L/ BL21。3.猪⑶40L分子的诱导表达将新鲜CD40L/BL21菌液接种于LB培养液(含氨苄青霉素lOOug/ml)，摇菌至OD 值约0. 6，加入终浓度为Im mol的IPTG诱导，于诱导后2、3、4、5、Mi分别取出Iml菌液检测目的蛋白表达水平。结果如图4所示，在诱导后他表达量最高。将新鲜⑶40L/BL21菌液接种于LB培养液摇菌至OD值约0. 6，分别加入终浓度为 0. lmM、0. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、l. OmM的IPTG，诱导后Mi收获菌液检测目的蛋白表达水平。结果如图5所示，不同IPTG诱导浓度表达量相差不大，故选用0. ImM的IPTG诱导。将新鲜⑶40L/BL21菌液接种于500ml的LB培养液，菌体浓度达OD值0. 6后，以终浓度为0. ImM的IPTG诱导表达Mi收获菌液。12，OOOrpm低温离心收获菌体，以Binding buffer重悬，反复冻融3次后超声破碎。高速离心，收获上清液及沉淀，分别取少量做 SDS-PAGE，结果细胞超声裂解后的上清液中无目的蛋白，而沉淀即包涵体中有目的蛋白存在，见图4。将沉淀洗涤三次后溶于8M尿素中。经镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白，见图 4。
( 二 )免疫获得兔抗猪CD40L多克隆抗体选择体重为2. 5-3. Okg的家兔两只，采用本实施例中步骤(一)纯化获得的目的蛋白为免疫原，每次按200mg纯化的目的蛋白/只，免疫家兔。免疫前耳静脉采血取阴性血清。基础免疫无菌注射器吸入4mL (含400mg目的蛋白)免疫原及等量体积(細1)的完全弗氏佐剂于IOml离心管中，抽吸处理使之形成粘稠乳剂。4°C过夜乳化液不分层即符合免疫要求。家兔足垫部皮下免疫。4周后200mg免疫原/只(目的蛋白与不完全弗氏佐剂的体积比为1 1)乳化液进行加强免疫，6周后同等剂量再次免疫。最后一次免疫两周后心脏采血，制备兔抗猪CD40L血清(即阳性血清)，其中含有兔抗猪CD40L多克隆抗体。通过间接ELISA方法证明家兔产生高水平兔抗猪⑶40L多克隆抗体，抗体水平达到1 10000 以上，见表1所示。表1间接ELISA法检测兔免疫血清抗体效价结果
权利要求
1.一种密码子优化的猪⑶40L基因，其特征在于包括SEQ ID NO :3所示的序列。
2.根据权利要求1所述密码子优化的猪CD40L基因，其特征在于其序列如SEQID NO 2所示。
3.根据权利要求1所述密码子优化的猪CD40L基因，其特征在于其序列如SEQID NO 4所示。
4.根据权利要求1所述密码子优化的猪CD40L基因，其特征在于其序列如SEQID NO 5所示。
5.一种表达权利要求2或3或4所述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法(1)将所述基因与质粒pFastDual相连，构建重组质粒；(2)将所述重组质粒转化入DHlOBac，通过蓝白斑筛选获得卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性的重组DHlOBac ；(3)将所述重组DHlOBac转染sf_9细胞获得重组杆状病毒。
6.根据权利要求5所述的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于所述重组杆状病毒表达的猪CD40L蛋白经SDS-PAGE电泳，图谱上出现分子量约为^kD的蛋白jS^festern-blot 试验，显示在^kD左右出现能够与兔抗猪CD40L多克隆抗体结合的特异性条带。
全文摘要
本发明涉及密码子优化的猪CD40L基因，该基因符合昆虫细胞密码子偏嗜性，适合在杆状病毒系统中进行表达，表达出的猪CD40L分子生物活性高，能够增强机体的免疫应答能力。本发明还提供所述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法。
文档编号C12N15/12GK102154306SQ20111002928
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者侯继波, 薛刚, 郑其升 申请人:国家兽用生物制品工程技术研究中心