一种密码子植物化改造的pmi基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种密码子植物化改造的PMI(phosphomannose?isomerase，磷酸甘露糖异构酶)基因，本发明利用水稻优化密码子设计合成了PMI基因。并且本发明提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在遗传转化方面的应用。本发明利用改造的PMI基因构建植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，将外源基因导入水稻细胞中。本发明实现了水稻的高效遗传转化，这是因为经过密码子植物化改造的plant?PMI的转化效率显著提高。
【专利说明】一种密码子植物化改造的PMI基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种密码 子经过植物化改造的PMI基因，及其作为筛选标记，在植物遗传转化方面的应用。
【背景技术】
[0002] 转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该 技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子 检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良 效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓 了新空间。
[0003] 但现有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记，该类基因可能随食 物进入肠道，存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医 用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性 基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要 么筛选效率和成本不适于规模化应用。
[0004] 而PMI是一种糖代谢基因，广泛存在于藻类和一些豆科植物中。水稻等高等植物 细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏PMI，不能进一步将6-磷酸 甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用，因此PMI可以作为筛选标记基 因。与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达PMI基因，可以 利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率高。同时，甘露糖是广泛存在于海藻、蕨类等植物 中的己糖，且PMI的催化产物为6-磷酸果糖，是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好 的天然物质。
[0005] 但现在使用的PMI是从原核生物大肠杆菌中分离出来的，而原核生物和真核生物 存在不同的密码子偏好和碱基组成。例如以水稻为代表的单子叶植物，其GC含量高，较细 菌及双子叶植物等物种，密码子偏好性强。因此直接使用未经人工优化设计的PMI，会影响 其在真核细胞中的表达效率，并影响其作为筛选标记的使用效果。此外，由于PMI来自于大 肠杆菌，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明希望对PMI进行密码子植物化改造。本发明旨在将PMI基 因对密码子经过植物化改造，并作为筛选标记，应用于植物遗传转化。
[0007] 具体而言，在第一个方面，本发明提供一种密码子植物化改造的PMI基因，命名为 plant PMI，该基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，该序列是以模式作物水稻密码子 偏好进行优化，即在维持编码氨基酸序列不变的前提下，用水稻偏好密码子替换原有密码 子，得到植物化改造的plant PMI序列，再经过化学合成而来。
[0008] 在第二个方面，本发明提供一种含有所述plant PMI基因的植物表达载体。构建 方法是利用Xho I酶切位点，用Xho I酶切pCAMBIA1381载体并回收，由于合成的plant PMI 序列两端加有Xho I酶切位点，可以利用T4连接酶将plant PMI连接到pCAMBIA1381载体， 得到植物表达载体pCAMBIA1381-plant PMI。
[0009] 另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的PMI基 因。
[0010] 另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应 用包括利用所述密码子植物化改造的PMI基因作为筛选标记，获得转基因植物或植物部 分。
[0011] 优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。
[0012] 优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、 胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。
[0013] 在另一个方面，本发明提供一种利用pCAMBIA1381-plant PMI表达载体（其含有所 述密码子植物化改造的PMI基因），将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：
[0014] (1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次 级愈伤组织；
[0015] (2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
[0016] (3)将步骤（2)中获得的愈伤组织与携带plant PMI筛选标记基因的农杆菌接触 15分钟；
[0017] (4)将步骤（3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸（加入2. 5-3. 5mL农杆菌 悬浮培养基）的培养皿中，21-23°C培养48小时；
[0018] (5)将步骤（4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
[0019] (6)将步骤（5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
[0020] (7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
[0021] (8)将步骤（7)的苗转移到生根培养基中生根。
[0022] 其中所述步骤（1)中的种子是成熟种子；所述步骤（1)、（2)中的诱导培养基是说 明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤（3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述 农杆菌悬浮液中；所述步骤（4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基； 所述步骤（5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤￠)中的 筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤（7)中的分化再生培养基是说明 书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤（8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生 根培养基。
[0023] 在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。
[0024] 表1培养基的示例性配方
[0025]
【权利要求】
1. 一种密码子植物化改造的PMI基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的PMI基因。
3. -种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的PMI基因或权利要 求2所述的表达盒。
4. 一种权利要求1-3所述的基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利 用所述密码子植物化改造的PMI基因作为筛选标记，获得转基因植物或植物部分。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉 作物、能源作物。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞 组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种 子。
7. -种利用含有权利要求1中所述的密码子植物化改造的PMI基因的表达载体 pCAMBIA1381-plant PMI，将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤： (1) 将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈 伤组织； (2) 将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组 织； (3) 将步骤（2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所 述表达载体，所述表达载体中携带所述密码子植物化改造的PMI基因； (4) 将步骤（3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23°C培养 48小时； (5) 将步骤（4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天； (6) 将步骤（5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织； (7) 将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和 (8) 将步骤（7)中所获得的苗转移到生根培养基中生根。
【文档编号】A01H5/00GK104046636SQ201410276408
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】李莉, 杨剑波, 魏鹏程, 宋丰顺, 李 浩, 杨亚春, 倪大虎, 汪秀峰, 马卉, 秦瑞英, 陆徐忠, 倪金龙 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所