专利名称：一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPKe的克隆、重组及在提高转基因烟草产量方面的应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
随着世界人口的不断激增，人们对粮食的需求也在急剧增加。同时人类对资源环境的肆意开发，生态平衡逐渐遭到破坏，粮食生产也受到很大影响。在我国，经济水平的不断提高及城市化、工业化进程的不断加快，农业人口及可用耕地面积所占比例正逐年下降， 因此，如何提高粮食产量来满足人们日益增长的基本生活物质需求是人们当前亟待解决的问题。传统的提高粮食产量的方法有扩大种植面积、改善栽培管理技术、田间套种、选育优良品种等。由于人们对土地资源的不断开发，可耕地面积逐年下降，通过扩大种植面积提高作物产量已不再是行之有效的方法。而通过改善栽培管理技术提高作物产量往往收效甚微。目前提高作物产量的方法主要是选育优良品种，结合先进的栽培管理技术。传统的选育方法主要是将杂交选育与形态改良相结合，利用杂交优势来选育新品种。如三系杂交水稻的选育。然而由于种间不亲和性的限制，许多种间高产性状无法通过杂交选育的方式得以充分利用。另外，传统的选育方法具有育种周期长，工作量大，成本高等缺点。因此，应用传统育种方法来提高作物产量在一定程度上受到限制。随着近代分子生物学与基因工程技术的飞速发展，通过转基因技术与传统选育方法相结合来选育新品种已经成为一种行之有效的方法。转基因技术具有快速、高效等优点，一方面可以大大缩短选育新品种的周期，另一方面能克服种间的生殖隔离障碍，实现种间遗传物质交换，将种间优良基因充分挖掘和利用。此外，利用转基因育种技术可针对性的改良作物性状，以达到提高作物产量的目的。在我国，棉花是除粮食以外最为重要的经济作物。早在1995年，我国就通过转基因技术成功培育出Bt抗虫棉，其推广应用使得棉花产量大幅度提高，极大的推进了棉花产业的发展。但近年来，我国棉花的消费需求正呈持续快速增长趋势。相关资料表明，我国国内棉花资源已不能满足棉纺织业的需求，只能通过进口来达到供求平衡。因此加速提高棉花产量是十分必要的。通过基因工程技术的手段研究棉花中影响产量的基因的功能，对于棉花产量性状的遗传改良具有非常重要的现实意义。然而，目前关于棉花产量性状的研究多集中于产量相关性状的QTL定位及聚类分析方面，对于棉花产量相关基因的研究应用很少。MAPK级联途径是真核生物中进化极为保守的细胞信号转导途径。研究表明，植物中MAH(参与细胞分裂、生长发育、胁迫反应等过程，如Ma等Q009)通过对烟草BY-2细胞的研究发现，MAPK主要在细胞分裂中期，通过激活大量与细胞周期进程相关的底物来调节成膜体中细胞板的形成以影响细胞周期进程。而Jens等人O010)通过对模式植物拟南芥的研究进一步证实，MAI3K在细胞分裂过程中所具有的重要作用，并指出MAPK6在拟南芥早期根的生长发育阶段通过影响细胞分裂来影响根的发育。另外有研究表明，植物中一些MAPK能够参与生长素信号途径，从而调节植物生长发育过程。然而，目前关于棉花MAHi与产量关系方面的研究很少，国内外尚没有关于利用棉花MAPK提高作物产量的报道。本发明中，我们用常规方法在棉花(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉22)中克隆得到一个MAPK基因，构建真核表达载体后转入本生烟(Nicotiana benthamiana)，使之高效表达。研究发现，转基因烟草植株产量较非转基因烟草植株显著提高，表现为叶片面积增大、分蘖数增多、果荚数增加、结实率提高。因此，利用该基因在增加产量方面的特性，通过基因工程手段改善作物产量性状，提高作物产量具有重要的现实意义。这一策略的应用不仅能为植物产量性状的改良提供新的基因源，而且对于培育其它可提高产量的种质材料提供了理论基础。经检索，国内外文献和专利中尚没有关于该棉花产量相关基因GhMAPK6的报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种可提高棉花产量的相关基因GhMAPK6，同时提供一种该基因在提高转基因烟草产量方面的应用，并应用于生产其它可提高产量的转基因植物。本发明中提供的核苷酸序列来自棉花。本发明利用同源克隆和RACE技术获得了棉花产量相关基因GhMAPK6，其基因序列如SEQ. ID. NO. 1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。具体方法如下本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库(GenBank) 中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计一对简并性引物BPlchtaygghatbgtytgytgtgcBP2 gcaaccaacwgaccadatrtc进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与克隆载体(pMDIS-T)连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后筛选重组子，进行序列分析。根据获得的序列设计特异性引物3‘ outside :ctcgctcgtgtcacctctg3‘ inside :cgtccacctgaactgttgc5‘ outside :gatccatgtgacgaagcag5' inside :agagttctcttcgcatcaatc通过3'和 5'末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术分别获得和端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的和端序列设计一对特异性引物WLP1 gtaagaatggaaggcggagWLP2 :tagaatggctattggaattgagatat以棉花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列，将该cDNA命名为 GhMAPK6。该基因的cDNA全长为1564bp，其中开放阅读框部分为1197bp。由此推得，该基因可编码399个氨基酸。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已发表的AtMAPK6 (拟南芥，NM_129941)、GmMAPK2 (大豆，AAQ14867)、LeMAPK2 (番茄，AAP20420)、NtNTF4 (烟草，Q40532)、0sMAPK6(水稻，ACD76439)、ZmMAPK6 (玉米，ACG37232)相比，氨基酸同源性分别为 87. 47%,90. 23%,89. 97%,89. 97%,81. 95%,82. 75%。由此表明，经过上述同源克隆步骤得到了编码棉花促丝裂原活化蛋白激酶的基因GhMAPK6。该基因序列如下序列表(l)SEQ. ID. NO. 1 的信息(a)序列特征长度1564bp类型核酸链型双链拓扑结构线性(b)分析类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源棉花(f)序列描述:SEQ. ID. NO. 1cacagatcta ttaaccaata aaatcctacg catccttcca gtacacccac tcaccctaat 60ttctttttagattcttttttccaggaattaaggtaaga jat g[' gaaggcgga ggaccaccac120
aggcggcggacaccgagatggcagaagcagcccagcaacagccacaacaccaccagcaac180
gtccgcctcaggtggccgctggcctggaaaatattccggccactctaagccacggcggta240
ggtttattcagtataacatctttggtaacattttcgaggtcactgctaaatataaaccac300
ctattatgcctatcggtaaaggcgcttacggcatcgtttgttccgcattgaattccgaga360
caaatgaacacgttgcgttaaagaagatagcgaacgcatttgataacaagattgatgcga420
agagaactcttcgtgagatcaagctgcttcgtcacatggatcatgaaaacgttgttgcaa480
tcagggatataattccaccacctcaaagggaatgctttaatgatgtttatattgcgtacg540
agctgatggacactgacctgcatcagataatccgttctaatcaagctttatctgaagagc600
attgtcagtatttcccctatcagatcttacgtgggctgaagtatatacactctgcaaatg660
ttctacacagggacttgaaacctagcaaccttctcctgaatgctaattgtgacttgaaaa720
tatgtgattttggactcgctcgtgtcacctctgaaagtgattttatgactgaatatgttg780
ttacaagatggtaccgtccacctgaactgttgctaaactcttcagactatactgcagcca840
ttgatgtatggtcagtgggttgcatttttatggaattgatggatcgaaagccattatttc900
ctggaagagatcatgtgcatcagcttcgattacttatggaactgattggcaccccatcag960
aggctgagttggagtttttaaatgagaatgctaagagatatattcgacaacttcctcttt1020
atcgtcgacaatctttcactgaaaagtttccaaatgtcccccctttagctattgatcttg1080
ttgaaaagatgttaacatttgatcccagacaaaggattactgtcgaggacgcacttgctc1140
atccctatctaacgtcactgcatgacataagtgatgaacctgtatgcatgacccccttta1200
gcttcgacttcgagcagcatgcattaaccgaggagcagatgaaggagctgatatatcggg1260
aggcacttgcattcaaccca gaatatctgc agcagjtgajtcagtccatatg ccattgattt1320
attgatgagcttttgtcagtgttggtgatcgttttcttca tgtatatata catacatatg1380
tatgtatgta tgtatgtatt tatgtatgtatgtatgtacg tatgtatgttccaatcccag1440
gatagaatgg ctattggaat tgagatatttaattatgggc aaaatgcagg aaactaaaac1500
agctgtattg gtgtttttat gtacggctgtcttgatttct ttctttcaaa-&￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l1560
SlSlSlSl1564
其中透明方框内为起始密码子，灰色方框内为终止密码子。
(3) SEQ. ID. NO. 2 的信息
(a)序列特征
长度399个氨基·
类型氨基酸
链型单链
拓扑结构线性
(b)分析类型:蛋白质
(C)序列描述:SEQ.ID.NO. 2
MetGluGlyGlyGlyProProGlnAlaAlaAspThrGluMetAlaGlu
151015
AlaAlaGlnGlnGlnProGlnHisHisGlnGlnArgProProGlnVal
202530
AlaAlaGlyLeuGluAsnlieProAlaThrLeuSerHisGlyGlyArg
354045
PheIleGlnTyrAsnliePheGlyAsnliePheGluValThrAlaLys
505560
TyrLysProProlieMetProlieGlyLysGlyAlaTyrGlylieVal
65707580
CysSerAlaLeuAsnSerGluThrAsnGluHisValAlaLeuLysLys
859095
IleAlaAsnAlaPheAspAsnLyslieAspAlaLysArgThrLeuArg
100105110
GluIleLysLeuLeuArgHisMetAspHisGluAsnValValAlalie
115120125
ArgAsplielieProProProGlnArgGluCysPheAsnAspValTyr
130135140
IleAlaTyrGluLeuMetAspThrAspLeuHisGlnlielieArgSer
145150155160
AsnGlnAlaLeuSerGluGluHisCysGlnTyrPheProTyrGlnlie
165170175
LeuArgGlyLeuLysTyrlieHisSerAlaAsnValLeuHisArgAsp
180185190
LeuLysProSerAsnLeuLeuLeuAsnAlaAsnCysAspLeuLyslie
1952002050099]CysAspPheGlyLeuAlaArgValThrSerGluSerAspPheMetThr0100]2102152200101]GluTyrValValThrArgTrpTyrArgProProGluLeuLeuLeuAsn0102]2252302352400103]SerSerAspTyrThrAlaAlalieAspValTrpSerValGlyCyslie0104]2452502550105]PheMetGluLeuMetAspArgLysProLeuPheProGlyArgAspHis0106]2602652700107]ValHisGlnLeuArgLeuLeuMetGluLeulieGlyThrProSerGlu0108]2752802850109]AlaGluLeuGluPheLeuAsnGluAsnAlaLysArgTyrlieArgGln0110]2902953000111]LeuProLeuTyrArgArgGlnSerPheThrGluLysPheProAsnVal0112]3053103153200113]ProProLeuAlalieAspLeuValGluLysMetLeuThrPheAspPro0114]3253303350115]ArgGlnArglieThrValGluAspAlaLeuAlaHisProTyrLeuThr0116]3403453500117]SerLeuHisAsplieSerAspGluProValCysMetThrProPheSer0118]3553603650119]PheAspPheGluGlnHisAlaLeuThrGluGluGlnMetLysGluLeu0120]3703753800121]IleTyrArgGluAlaLeuAlaPheAsnProGluTyrLeuGlnGln0122]3853903950123]本发明还提供了编码促丝裂原活化蛋白;敫酶基因GhMAPK6在其它农作物
的方法，可提高转基因作物的产量。步骤为(a)利用棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，将cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体。(b)采用本领域熟知的方法，如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。本发明从棉花中分离出一种编码促丝裂原活化蛋白激酶基因(GhMAPK6)，将该 cDNA序列构建在由组成型CaMV 35S强启动子控制的真核表达载体pBI121上，构建了 GhMAPK6的正义表达载体，采用农杆菌介导的方法转化本生烟。对获得的转基因烟草进行功能分析表明，转基因烟草中GhMAPK6的过量表达能提高其产量。相比于非转基因烟草，转基因烟草叶片面积增加约1. 7倍，果荚数增加约2. 4倍，种子数量增加约1. 5倍。该基因可转化棉花、玉米、小麦等农作物，能提高其产量，具有重大的经济价值和社会价值。本发明涉及一种植物表达载体，包含有如SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列，用于提高植物产量。本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，获得可提高产量的转基因植物。导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于农杆菌介导的转化法、基因枪法、电击法、显微注射法、脂质体转化法、PEG介导的转化法、花粉管导入法等。本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。在本发明中GhMAPK6基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它转基因植物，包括转基因植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。
图1.棉花中GhMAPK6氨基酸序列与几种其它植物的MAPK氨基酸序列的比较结果。其中相同的氨基酸残基用黑底表示。它们在GenBank中的物种来源及其注册号分别为AtMAPK6 (拟南芥，NM_129941)、GmMAPK2 (大豆，AAQ14867)、LeMAPK2 (番茄，AAP20420)、 NtNTF4 (烟草，Q40532)、0sMAPK6 (水稻，ACD76439)、ZmMAPK6 (玉米，ACG37232)。图2. GhMAPK6正义表达载体的构建程序。图3.部分转基因植株的PCR鉴定结果。1-9 转基因烟草植株；CK+ :pBI121质粒作为阳性对照；CK-非转基因对照；M :marker DL2000。图4.过量表达GhMAPK6的转基因烟草与非转基因烟草在苗期的生长状况比较。A 非转基因烟草；B 转基因烟草。图5.过量表达GhMAPK6的转基因烟草与非转基因烟草在产量方面的状况比较。A 非转基因烟草；B 转基因烟草。
具体实施例方式基于本生烟生长速度快、生活周期短、离体培养再生能力强、遗传转化效率高等优点，在下述实施例中以本生烟为例对本发明进行了详细的说明。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施方式(一)一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的克隆方法1. RNA的提取利用TRIZOL试剂盒提取棉花总RNA2. cDNA第一链的合成(采用Transgen公司cDNA第一链合成试剂盒法)在0. 25ml离心管中加入下列试剂mRNA5μ 1Oligod(T)1 μ 12 X Buffer10 μ 1EasyScript Reverse Transcriptase 1 μ 1RNAase free water3 μ 1吸打混勻后42°C水浴30min，85°C水浴5min，冰上冷却5min，轻离心后，保存备用。3. cDNA的5'加尾反应(a)反应体系cDNA20 μ 15 X TdT Buffer10 μ 10.1% BSA5μ 1
IOOmMdCTP1 μ 1TdT1 μ 1ddH20Upto50 μ 1(b)37°C保温 3Omin。(c)加 100 μ 1 无水乙醇，_20°C沉淀 30min。(d)12，000rpm，室温离心5min。弃上清，干燥后加适量ddH20回溶。4. cDNA全长序列的获得4. 1用简并引物进行PCR反应获得GhMAPK6中间片段引物序列如下BPlchtaygghatbgtytgytgtgcBP2 gcaaccaacwgaccadatrtc
0163]体系如下
0164]IOXEasyTaq buffer 2. 5 μ 1
0165]dNTP mixture (IOmM) 1 μ 1
0166]BPl (10 μ Μ)1 μ 1
0167]ΒΡ2(10μΜ)1 μ 1
0168]cDNA1 μ 1
0169]TaqE0. 25 μ 1
0170]ddH20 Up to25 μ 1
0171]反应程序为
0172]94°C 5min
0173]
权利要求
1.一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，其特征在于其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
2.根据权利要求1所述的一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的应用，其特征在于该基因在本生烟草中过量表达，能提高转基因烟草产量。
全文摘要
本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明采用同源克隆和RACE技术获得一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，将该基因的cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体，转化本生烟，使该基因在烟草中过量表达。实验证实，转基因烟草植株产量较非转基因烟草植株显著提高，表现为叶片面积增大、分蘖数增多、果荚数增加、结实率提高。因此，利用该基因在增加产量方面的特性，通过基因工程手段改善作物产量性状，提高作物产量具有重要的现实意义。
文档编号C12N15/54GK102154337SQ20101059083
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者吴长艾, 张伟, 张良, 李玉真, 郭兴启 申请人:山东农业大学