专利名称：利用来源于藻类的生理活性物质的药物、食品或饮料的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于藻类的生理活性物质的用途，更具体的说涉及以该生理活性物质为有效成分的药物、抗氧化剂、保鲜剂、化妆品、含有该生理活性组合物的功能性食品或饮料，另外还涉及功能性表达用糖。
背景技术：
近年来，对于细胞组织的死亡，所谓细胞凋亡(也叫做细胞程序死亡(apoptosis)，自然枯萎或细胞自然死亡)的方式引起了人们的注意。
与病理上细胞死亡的坏死不同，这种细胞凋亡是最初就已编入细胞自身基因的死亡。也就是说，由某种外部或内部的因素引起编有细胞凋亡程序的基因活化，生物合成程序死亡蛋白质，另外有时也引起作为惰性型存在于细胞内的程序死亡蛋白质活化。通过这样生成的活化型程序死亡蛋白质引起细胞自身分解，导致死亡。
如果能够在所需的组织、细胞中使这种细胞凋亡进行表达，则有可能把不需要或有害的细胞以自然形式由生物体排除，这将具有极为深远的意义。
发明目的人们期待把来源于琼脂等藻类的低聚糖作为食品原料进行开发(食品化学，1988-2，40-44；增刊食品化学-4，1990年12月，127-131；特开平6-38691号)，但尚不清楚其诱发细胞凋亡作用等的生理功能。
本发明的目的在于开发来源于天然物、具有诱发细胞凋亡作用等生理功能、安全性高的物质，从而提供以该物质作为有效成分的细胞凋亡诱发剂等用于对该化合物具有敏感性疾病的药物、以该物质作为组成成分的功能性饮食品等。
发明概述如果简要的说明本发明，本发明的第1种实施方式是用于治疗或预防对下述化合物具有敏感性的疾病的药物组合物，它含有从选自式1所示的3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物的化合物，以及还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分。
式1 本发明的第2种实施方式是用于改善对下述化合物敏感的疾病症状的饮食品或用于预防该疾病的饮食品，它含有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物的化合物以及还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物构成的。
本发明的第3种实施方式是抗氧化剂，其特征在于，它含有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分。
本发明的第4种实施方式是饮食品，其特征在于，它含有本发明的第3种实施方式的抗氧化剂。
本发明的第5种实施方式是抗氧化用糖，它选自从式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中选择的化合物和含有该化合物的可溶性糖化合物。
本发明的第6种实施方式是保鲜剂，其特征在于，它含有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物和含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分。
本发明的第7种实施方式是化妆品，其特征在于，它以选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物作为有效成分。
本发明的第8种实施方式是酸性饮食品，其特征在于，它含有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物。
本发明的其他实施方式是从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种在制备药物组合物、饮食品、抗氧化剂、保鲜剂或化妆品中的用途。
以下，参照附图详细说明本发明。
图面的简单说明
图1表示用0.12N盐酸分解琼脂，将得到的产物用凝胶过滤的溶出图。
图2表示用1N盐酸分解琼脂，将得到的产物用凝胶过滤的溶出图。
图3表示琼脂的酸分解产物的尺寸排阻HPLC色谱图。
图4表示细胞凋亡诱发性及抗癌性物质的质谱图。
图5表示细胞凋亡诱发性及抗癌性物质(水合物)的1H-NMR谱图。
图6表示细胞凋亡诱发性及抗癌性物质(醛异构体)的1H-NMR谱图。
图7表示琼脂二糖、琼脂四糖及琼脂六糖的正相HPLC溶出图。
图8表示66.7分钟的峰的质谱图。
图9表示78.5分钟的峰的质谱图。
图10表示85.5分钟的峰的质谱图。
图11表示3，6-脱水-L-半乳糖的质谱图。
图12表示3，6-脱水-L-半乳糖(水合物)的1H-NMR谱图。
图13表示3，6-脱水-L-半乳糖(醛异构体)的1H-NMR谱图。
图14是表示添加最终浓度为250μM的低聚糖培养HL-60细胞时的培养时间和存活细胞数的图。
图15是表示添加最终浓度为125μM的低聚糖培养HL-60细胞时的培养时间和存活细胞数的图。
图16表示在0.5M磷酸中进行加热处理的琼脂的正相HPLC溶出图。
图17表示琼脂二糖的标准曲线图。
图18表示0.2％琼脂的0.1M HCl溶液的加热时间与琼脂二糖产量之间的关系图。
图19表示0.2％琼脂的0.1M枸橼酸溶液的加热时间与琼脂二糖产量之间的关系图。
图20是表示在500mM枸橼酸、80℃下，琼脂低聚糖生成的图。
图21是表示在500mM枸橼酸、95℃下，琼脂低聚糖生成的图。
图22是表示在1200mM乳酸、80℃下，琼脂低聚糖生成的图。
图23是表示在1200mM乳酸、95℃下，琼脂低聚糖生成的图。
图24是表示在1000mM苹果酸、80℃下，琼脂低聚糖生成的图。
图25是表示在1000mM苹果酸、95℃下，琼脂低聚糖生成的图。
图26是表示在1000mM苹果酸、70℃下，琼脂低聚糖生成的图。
图27表示κ-角叉菜胶酸分解产物的正相HPLC色谱图。
图28表示细胞凋亡诱发性及抗癌性物质的质谱图。
图29表示凋落诱导性及抗癌性物质的1H-NMR谱图。
图30是表示用cellulofine GCL-25进行凝胶过滤结果的图。
图31是表示用交联葡聚糖LH-20凝胶柱进行凝胶过滤结果的图。
图32表示β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖的质谱图。
图33表示β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖的1H-NMR谱图。
图34表示在ConA引起的淋巴细胞胚细胞样转变中，琼脂二糖浓度与3H-胸腺嘧啶核苷摄取量的关系图。
图35表示在混合淋巴细胞反应中，琼脂二糖浓度与3H-胸腺嘧啶核苷摄取量的关系图。
图36是表示添加琼脂二糖，在各种培养条件下培养时，培养基中NO2-浓度的图。
图37是表示添加新琼脂二糖，在各种培养条件下培养时，培养基中NO2-浓度的图。
图38是表示添加琼脂盐酸分解溶液、琼脂枸橼酸分解溶液进行培养时，培养基中NO2-浓度的图。
图39是表示添加3，6-脱水-D-半乳糖、半乳糖进行培养时，培养基中NO2-浓度的图。
图40是表示在各种培养条件下培养时，培养基中NO2-浓度的图。
图41是表示本发明低聚糖抗癌活性的图。
图42是表示本发明低聚糖抑制PCA反应的图。
发明的详细说明本发明中式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖(以下简称为3，6-脱水吡喃半乳糖)的醛异构体为式2所示化合物。 其水合物是式3所示化合物。 另外，3，6-脱水吡喃半乳糖的2-O-甲基化衍生物是式4表示的化合物。 此外，该甲基化衍生物的醛异构体为式5所示化合物。 其水合物为式6所示化合物。 本说明书中式1～6的结构也可以以其他表达形式表示，式1～6所表示的物质也包括这些，此外还包括它们可能的互变异构体。另外，式1～6的立体构型只要是能够得到所需活性，并没有特别的限定，可以是D-型、L-型或其混合物。
本发明的可溶性糖化合物并没有特别的限定，是含有选自3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物(以下将其总称为“式1～6的化合物”)的可溶性糖化合物，它可以通过在pH不到7的酸性条件下，将含有至少1种式1～6化合物的物质(以下简称为原料物质)酸分解和/或酶分解得到，另外，也可以通过化学合成方法制得。本发明的可溶性糖化合物只要是在用时不会固化或半固化(凝胶化)的化合物即可，并没有特别的限定。因此，含有用时溶胶化的选自式1～6化合物中的至少1种化合物的糖化合物包括在本发明的可溶性糖化合物中。另外，在本发明中优选使用的该可溶性糖化合物，例如，是其非还原末端为L-半乳糖-6-硫酸以外的糖的糖化合物，包括例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物。
为了得到该可溶性糖化合物所使用的原料物质没有特别的限定，例如琼脂糖、琼脂胶、海萝聚糖、金属卟啉、角叉菜胶、丹麦琼脂、hypnean等红藻的粘性多糖〔共立出版(株)发行，多糖生化学1-化学编-，第314页(1969)〕。
另外，含有这些多糖的物质也包含在原料物质中。例如作为琼脂糖、琼脂胶的原料，可以使用石花菜科的石花菜、鬼石花菜、Gelidiumpacificum、Gelidium subcostatum、Pterocladia tenuis、Acanthopeltisjaponica等，Gracilariaceae科的Gracilaria verrucosa、Gracilaria gigas等、Ceramiaceae科的Ceramium kondio、Campylaephora hypnaeoides等、其他红藻类，通常是数种藻类配合作为原料使用。原料藻类通常使用在太阳下干燥后的干燥物质，本发明中可以使用新鲜藻类及干燥后的藻类。另外也可以使用在干燥时边喷水边漂白的所谓漂白原藻。
用热水提取原料藻类后，通过冷却能够得到“石花菜凝胶”。将该“石花菜凝胶”通过冷冻脱水或挤压脱水除去水分，干燥得到琼脂。不管琼脂的原料藻类是哪种，可以使用棒状、带状、板状、丝状、粉末状等各种形态的物质。通常，琼脂含有约70％的琼脂糖和约30％的琼脂胶，进一步精制，可以制得含有更高纯度琼脂糖的物质。精制琼脂糖可以使用从低精制度到高精制度的各种琼脂糖含量的物质。
原料物质中包含上述琼脂的原料藻类、石花菜凝胶、琼脂、精制琼脂糖、精制琼脂胶、在其制备过程中得到的中间产物或副产物。
琼脂糖是以交替结合的D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖为主要结构骨架的多糖，D-半乳糖的1位和3，6-脱水-L-半乳糖的4位以β-糖甙键结合，另外3，6-脱水-L-半乳糖的1位和D-半乳糖的3位以α-糖甙键结合。α-1，3键通过稀酸能够进行温和的水解，以及通过α-琼脂糖酶〔Carbohydr.Res.、第66卷、第207页(1978)〕能够进行水解，另外，β-1，4键通过β-琼脂糖酶能够有选择的进行水解。
另外，角叉菜胶是杉海苔科、红翎菜科、Hypneaceae科等红藻类中含有的多糖，已知有κ-角叉菜胶、λ-角叉菜胶、η-角叉菜胶。
κ-角叉菜胶具有在D-半乳糖-4-硫酸的1位和3，6-脱水-D-半乳糖的4位以β-糖甙键结合，另外在3，6-脱水-L-半乳糖的1位和D-半乳糖-4-硫酸的3位以α-糖甙键结合而交替重复的基本结构骨架。λ-角叉菜胶是D-半乳糖的1位和D-半乳糖-2，6-二硫酸的4位以β-糖甙键结合，另外D-半乳糖-2，6-二硫酸的1位和D-半乳糖的3位以α-糖甙键结合，而具有交替重复的基本骨架。角叉菜胶可以用作食品的凝胶化剂。
用化学的、物理的和/或酶的方法将上述原料物质进行部分分解得到的物质也包括在本发明的原料物质中。
化学分解方法例如在酸性至中性下进行水解，物理分解方法例如用电磁波及超音波照射，酶分解方法例如采用水解酶(如琼脂糖酶、角叉菜胶酶等)进行水解。
原料物质在酸性至中性时的分解条件，只要是具有细胞凋亡诱发性、抗癌性、抑制活性氧产生活性、抑制一氧化氮(以下称为NO)产生作用等抗氧化活性或免疫调节活性的式1～6化合物；含有这些化合物中至少1种的可溶性糖化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖(以下简称为角叉菜二糖)及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物；以及其非还原末端为L-半乳糖-6-硫酸以外的糖，而在还原末端含有选自式1～6化合物的糖化合物的生成条件即可，没有特别的限定。
例如，将原料物质溶解或悬浊于酸中，通过使之发生反应，则生成本发明使用的选自式1～6的化合物中的化合物、含有这些化合物中至少1种的可溶性糖化合物。另外，通过在反应时进行加热，可以缩短生成选自式1～6的化合物以及含有这些化合物中至少1种的可溶性糖化合物所必需的反应时间。
溶解或悬浊原料物质(例如琼脂糖或含有琼脂糖的物质)的酸的种类没有特别的限定，可以使用盐酸、硫酸、硝酸等无机酸，枸橼酸、甲酸、乙酸、乳酸、抗坏血酸等有机酸，以及阳离子交换树脂、阳离子交换纤维、阳离子交换膜等固体酸。
酸的浓度也没有特别的限定，可以使用0.0001～5N的浓度，优选0.001～1N的浓度。另外，反应温度也没有特别的限定，可以设定为0～200℃，优选20～130℃。另外，反应时间也没有特别的限定，可以设定为数秒～数日。酸的种类和浓度、反应温度以及反应时间可以根据作为原料的含有选自式1～6化合物中至少1种化合物的物质(例如琼脂糖、角叉菜胶等)的种类，以及作为目的产物的选自式1～6的化合物、含有这些化合物的糖化合物的产量，作为目的产物的在还原末端具有选自式1～6的化合物的可溶性糖化合物的聚合度适当选择。一般，选择强酸、高浓度酸、高温比选择弱酸、低浓度酸、低温可以加速酸分解反应的进行。
另外，使用固体酸的场合，一般使用强阳离子交换树脂比弱阳离子交换树脂的分解反应效率好。再者，当原料物质的使用量越多、作用温度越高，酸分解反应进行的越快。
例如，将琼脂悬浊在0.1N盐酸中达到10重量％，在100℃加热溶解13分钟，除去不溶物，得到本发明使用的糖化合物溶液，该糖化合物溶液即使冷却，在其冰点也不发生凝胶化。如果采用凝胶过滤HPLC、正相HPLC等方法对该溶液中含有的糖类进行分析，几乎见不到高分子糖类，大部分已分解到可溶性的10个糖以下的糖化合物。同样，固定酸的场合，将市售强阳离子交换树脂的Na型1重量份用1N盐酸调节成H型后，加入到79重量份的去离子水中，再加入琼脂10重量份悬浊，在95℃加热180分钟，得到本发明的糖化合物溶液，该糖化合物溶液即使冷却，在其冰点也不会发生凝胶化。如果采用凝胶过滤HPLC、正相HPLC等方法对该溶液中含有的糖类进行分析，几乎见不到高分子糖类，大部分已分解到可溶性的10个糖以下的糖化合物。
另外，在制备本发明所使用的在还原末端具有选自式1～6化合物的可溶性糖化合物时，使用枸橼酸、乳酸、苹果酸等有机酸，通过酸的浓度在数10mM～数M之间适当选择，加热温度在70～95℃之间适当选择，加热时间在10分钟～24小时之间适当选择，生成大量具有生理活性的低聚糖(例如抗氧化用低聚糖)。另外，水解后，维持酸性，不要调节为碱性条件下，生成的该生理活性低聚糖具有长时间的保存稳定性。
作为本发明使用的选自式1～6的化合物、含有这些化合物中至少1种化合物的可溶性糖化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物，可以直接使用原料物质的分解产物，也可以中和后使用，还可以进一步精制后使用。选自式1～6的化合物、在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等低聚糖，例如，可以以细胞凋亡诱发活性或抗癌活性作为指标进行精制。作为精制手段可以采用化学方法、物理方法等公知的精制手段，可以将凝胶过滤法、采用分子量分离膜的分离法、溶剂提取法、使用离子交换树脂等的各种色谱法等公知精制方法组合，对酸分解产物中生成的作为目的产物的细胞凋亡诱发性物质——选自式1～6的化合物、含有该化合物中至少1种化合物的可溶性糖化合物进行精制。
这样得到的化合物的结构可以采用质量分析法、核磁共振法、测定紫外吸收光谱、测定红外吸收光谱等公知方法进行解析。
作为本发明有效成分1例的琼脂二糖是D-半乳糖的1位和3，6-脱水-L-半乳糖的4位以β-糖甙键结合形成的2糖。由于3，6-脱水-L-半乳糖的1位是端基异构碳，因此存在α型和β型，两者均包括在本发明所使用的琼脂二糖中。
另外，在本发明中作为有效成分使用的还原末端具有选自式1～6化合物的糖化合物是在该选自式1～6的化合物1位以外的羟基上结合有糖的物质，只要具有细胞凋亡诱发活性、抗癌活性、抑制活性氧产生活性、抑制NO产生活性和/或免疫调节活性的物质即可，没有特别的限定。例如原料物质的分解产物，如琼脂糖的酸分解产物或α-琼脂糖酶分解产物的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、角叉菜二糖、β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等。另外，例如角叉菜胶的酸分解产物或角叉菜胶酶分解产物，如角叉菜二糖。选自葡萄糖、甘露糖、半乳糖等己糖，木糖、阿拉伯糖、核糖等戊糖，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸等糖醛酸，葡萄糖胺、半乳糖胺等氨基糖，N-乙酰基神经氨糖酸等酰基酸，岩藻糖等去氧糖、其酯、酰胺以及内酯中的1个或多个糖结合在选自式1～6的化合物1位以外的羟基上的物质也包括在本发明在还原末端具有选自式1～6化合物的糖化合物中，在还原末端具有选自这些式1～6的化合物的糖化合物，例如，在琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物上结合有丙酮酸和/或硫酸基的物质，以及该糖化合物的羟基甲基化得到的物质也包括在本发明的在还原末端具有选自式1～6化合物的糖化合物中。另外，如上所述，本发明中在还原末端具有选自式1～6化合物的糖化合物优选其非还原末端为L-半乳糖-6-硫酸以外的糖。
由于在还原末端具有3，6-脱水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物的糖化合物其还原末端的化合物1位为端基异构碳，因此在还原末端具有该化合物的糖化合物存在α型和β型，在本发明中两者均可以用作在还原末端具有3，6-脱水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物的糖化合物。
另外，只要具有细胞凋亡诱发活性、抗癌活性、抑制活性氧产生活性、抑制NO产生活性等抗氧化活性和/或免疫调节活性等生理活性，其分子量没有特别的限定。
本发明所使用的选自式1～6的化合物、在还原末端具有该化合物的糖化合物其还原末端的化合物当然也可以使用α型、β型、醛异构体、水合物型的混合物以及D-型、L-型的混合物等。
因此，本发明所使用的选自式1～6的化合物、在还原末端具有该化合物的糖化合物具有细胞凋亡诱发活性、抗癌活性、抑制活性氧产生活性、抑制过氧化脂质游离基产生活性、抑制NO产生活性等抗氧化活性、免疫调节活性、抗过敏活性，按照本发明首先可以提供含有从选自式1～6的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分用于治疗或预防对这些化合物中的至少1种具有敏感性疾病的药物组合物，例如这些疾病的治疗药或预防药。
对这些化合物具有敏感性的疾病包括需要诱发细胞凋亡的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧产生的疾病、需要抑制过氧化脂质游离基产生的疾病、需要抑制NO产生的疾病、或需要免疫调节的疾病，例如过敏性疾病等，本发明的治疗用或预防用药物组合物可以制成细胞凋亡诱发剂、抗癌剂、活性氧产生抑制剂、过氧化脂质游离基产生抑制剂、一氧化氮产生抑制剂等抗氧化剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗过敏剂等。
例如，本发明的细胞凋亡诱发剂对于排除自身免疫疾病患者的自身反应性淋巴细胞、癌细胞、病毒感染细胞等有效，可以使细胞凋亡在所需的组织、细胞中表达，使不需要或有害的细胞以自然的形式从生物体内排除。对本发明细胞凋亡诱发剂有效的疾病例如全身性红斑狼疮、免疫介在性肾小球肾炎、多发性硬化症、胶原病等自身免疫疾病、风湿等。
本发明的细胞凋亡诱发剂可以用于细胞凋亡诱发方法，该方法对于细胞凋亡诱发机理的阐明、细胞凋亡诱发剂、细胞凋亡诱发抑制剂的筛选等是有用的。
另外，本发明细胞凋亡诱发剂带来的细胞凋亡诱发作用可以被Caspase抑制剂抑制，例如IL-1β掩蔽酶抑制剂V〔Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-氟甲基酮，宝酒造社生产〕，因此认为是依赖于Caspase的细胞凋亡引起的细胞死亡。
由于该Caspase在各种细胞死亡时首先上升，其过剩表达引起细胞死亡，肽抑制剂或抑制蛋白质CrmA、p35导致对细胞凋亡的抑制、脱去Caspase-1、Caspase-3的小鼠正常可见的细胞凋亡的一部分得到抑制，因而说明该Caspase作为细胞凋亡重要的介质发挥作用〔生化学，第70卷，第14～21页(1998)〕。也就是说，在细胞凋亡的过程中半胱氨酸蛋白酶Caspase被活化，分解核或细胞质中的蛋白质。Caspase首先作为前体被合成，然后通过剪切变成活化型。控制该Caspase的活化可以决定细胞的生死。在哺乳类动物中存在10种以上的Caspase，通过上位的Caspase对下位的Caspase进行剪切使细胞内蛋白质分解活性呈雪崩式增加〔细胞工学，第17卷，第875～880页(1998)〕。相反，半胱氨酸蛋白酶Caspase的抑制剂如果抑制其剪切活性，则可以终止依赖于Caspase的细胞凋亡引起的细胞死亡。
另外，本发明使用的化合物可以有效抑制氧化物，例如活性氧的产生，所以该化合物作为有效成分的活性氧产生抑制剂等抗氧化剂可以有效治疗或预防由于活性氧的产生和/或过剩引起的疾病。
活性氧可以大致分为游离基和非游离基的活性氧。游离基类活性氧中包括羟游离基、羟基过氧游离基、过氧游离基、烷氧游离基、二氧化氮(NO2)、NO、thylradical、超氧化物。另一方面，非游离基类活性氧中包括单线态氧、过氧化氢、氢过氧化脂质、次氯酸、臭氧、过氧亚硝酸。均与多种病态有关，例如各种炎症性疾病、糖尿病、癌、动脉硬化、神经疾病、缺血再灌流障碍等。
在生物体内通过几条通路不断生产低浓度的活性氧。它们在生理上均不可避免是由线粒体等电子传递系统溢出的过氧化物、过氧化氢、铜或铁等过渡金属作为催化剂产生的羟游离基、中性粒细胞或单核细胞等生成的由于预防感染的次氯酸、精氨酸分解生成的NO等。相对于这些活性氧的生成，生物体具有作为活性氧消除系统的酶、低分子化合物，保持生成和消除的平衡。但是，当这些通路由于某种原因被活化，或相反消除系统被惰性化，则导致活性氧生成系统相对于消除系统占优势的场合，从而生物体遭到氧化的障碍。这种状态称为氧化应激反应。此外，不仅生物体内平衡偏移，而且大气或食品等生物体外的物质，也常常会使生物体遭受氧化应激反应，因此，在日常生活中氧化应激反应是不可避免的。
也就是说，氧化应激反应如上所述与各种疾病有关，生物体常常出现氧化应激反应引起的疾病或疾病恶化。因此，对于这种氧化应激反应引起的疾病的预防、治疗或防止恶化，本发明的抗氧化剂(例如活性氧产生抑制剂)也是有效的。
另外，氧化应激反应必然与脂质过氧化反应相连，一旦该反应生成过氧化脂质游离基，将进一步进行反应。这里产生的4-羟基-2-壬烯醛(HNE)是以谷胱甘肽或蛋白质作为特异性靶的毒性醛。该HNE与蛋白质的反应产物可以在各种病态组织中检测出，考虑是否是与氧化应激反应有关的疾病的诱发因子。因此，含有可以抑制过氧化脂质游离基生成的本发明使用的抗氧化物质的抗氧化剂可以有效预防或治疗氧化应激反应引起的老化疾病。
NO是来源于内皮细胞的血管平滑肌松弛因子(EDRF)的主体〔Nature，第327卷，第524～526页(1987)〕。按照本发明，可以提供必须抑制NO产生的疾病的治疗剂或预防剂。
在本发明中，必须抑制NO产生的疾病没有特别的限定，例如毒性休克或采用某种细胞因子治疗引起的全身性血压降低、血压应答降低、自身免疫疾病、炎症、关节炎、风湿性关节炎、糖尿病、炎症性肠疾病、血管机能障碍、病因性血管扩张、组织损伤、心脏血管系统贫血、痛感敏感、脑缺血、伴有血管形成的疾病、癌等，包括特表平9-504524号、特表平9-505288号、特表平8-501069号、特表平8-512318号、特表平6-508849号各公报中记载的疾病。
由L-精氨酸和氧生成L-瓜氨酸和NO的NO合成酶(NOS)中包括经常表达的cNOS和诱导型的iNOS。在巨噬细胞中，iNOS通过细胞毒素或细胞因子(LPS、INF-γ等)的刺激被诱导，生成NO。iNOS自身对于维持生物体系是必需存在的。但是，另一方面，已知由于各种原因导致在必要以上过剩表达并产生过剩的NO，则会引起各种疾病。
本发明人通过采用蛋白质印迹测定的蛋白质水平、采用RT-PCR测定的信使RNA水平，来确认选自式1～6的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖可以抑制该iNOS的表达。也就是说，本发明所使用的化合物通过抑制由于各种因素引起过剩表达生成过剩的NO的iNOS表达，可有效治疗和预防必须抑制NO产生的疾病。
本发明的化合物可抑制巨噬细胞产生NO，因此能有效治疗、预防巨噬细胞产生NO引起的疾病、炎症、癌等。另外，本发明使用的糖化合物可抑制NO的产生，但对于诱发NO产生的物质LPS、INF-γ没有拮抗抑制。通过预先加入本发明使用的糖化合物，可见抑制NO产生的效果增强，本发明的化合物作为抑制抗氧化物质产生的预防剂是非常有效的。
本发明的NO产生抑制剂对于NO产生机理研究、NO作用机理研究是有用的，另外也可以用于筛选与NO产生机理有关的物质。
对于实体瘤的增大，血管的形成是必需的，血管内皮增殖因子/血管通透性亢进因子(VEGF)在该过程中发挥着重要作用。在各种癌细胞中通过NO诱导产生VEGF。本发明的NO产生抑制剂通过抑制产生NO，也可以抑制癌细胞中VEGF产生，结果抑制了癌组织周围的血管生成。如果把本发明的NO产生抑制剂投给癌细胞移植到皮下使之形成实体瘤的小鼠，则癌组织周围血管生成不充分，最终癌脱落。
亚硝基胺是在仲胺中带有亚硝基的一组化合物，已知有数百种，其大多数通过损伤DNA使动物发生癌变。亚硝基胺对于人的癌变也有很大的联系，通常在胃中通过亚硝酸盐与胺反应生成。NO即使在pH中性的生理条件下也与胺反应生成亚硝基胺。另外，在免疫学上与癌有很大关系的肝吸虫感染患者或肝硬化患者中NO的产生亢进。因此，投给本发明的NO产生抑制剂，通过防止NO产生亢进，特别是可以预防高危患者的癌变。如上所述，本发明的NO产生抑制剂具有2步抗癌作用，即抑制癌变和抑制癌组织中血管生成。
另外，NO可以诱发作为炎症性病变特征的浮肿，即诱发血管通透性亢进〔Madea等，Japanese Journal of Cancer Research，第85卷，第331～334页(1994)〕，还可以使炎症介质前列腺素类的生物合成亢进〔Salvemini等，Proceedngs of National Academy of Sciences USA，第90卷，第7240～7244页(1993)〕。另一方面，NO与过氧化物游离基迅速反应，生成过氧亚硝酸离子，认为过氧亚硝酸离子也引起炎症性细胞、组织障碍。
活化的免疫细胞进入脏器，释放出细胞因子时，诱导产生NO。胰岛素依赖型糖尿病是胰岛β细胞被特异性破坏引起的疾病，据说是由NO引起的破坏。另外，伴有慢性关节风湿、变形性关节风湿、痛风性关节炎、贝切特氏病的关节炎患者病变部位的关节液中比相同患者的正常关节或健康人关节的关节液中含有的NO浓度高。如果将本发明的NO产生抑制剂投给患者，可以抑制病变部位产生NO，使症状得到改善。
在脑缺血中以及再灌流后NO的产生增加，随之使脑组织受到损伤。本发明的NO产生抑制剂投给脑缺血时的患者，可减轻脑组织的损伤，改善预后。
本发明的免疫调节剂具有抑制淋巴细胞胚细胞样转变反应的作用、抑制混合淋巴细胞反应等的免疫调节作用，本发明的免疫调节剂作为这些免疫系统、免疫因子异常引起的疾病的治疗剂或预防剂是有效的。
这里，淋巴细胞胚细胞样转变反应是指促细胞分裂剂与淋巴细胞表面的受体结合，使淋巴细胞活化，促进其分裂、增殖的反应。混合淋巴细胞反应是指通过将由同种异类动物得到的淋巴细胞混合培养，由于主要组织适合抗原不一致诱发淋巴细胞活化，促进淋巴细胞分裂、增殖的反应。本发明的免疫调节剂可以抑制这些反应，特别有效的治疗或预防淋巴细胞异常亢进引起的自身免疫疾病，例如慢性肾炎、溃疡性大肠炎、I型糖尿病、慢性关节风湿等慢性疾病，另外也可以有效抑制移植片排斥反应。
用IgE抗体致敏的肥大细胞通过抗原的结合，诱导去粒，释放出化学介质。其I型，也就是即时型过敏反应在以哮喘、特应性皮炎为代表的过敏性疾病中发挥重要作用，抑制从肥大细胞释放化学介质的物质对于治疗和预防这些过敏性疾病是非常有效的。
作为I型过敏反应模型的大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)是从肥大细胞的去粒开始，然后释放颗粒中含有的组胺、5-羟色胺等化学介质，引起血管通透性亢进，最后在皮肤局部造成色素渗漏的反应。该模型目前作为体内抗过敏剂的评价模型使用最广泛。
选自式1～6化合物的化合物及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物具有抑制PAC的作用，按照本发明，还可以提供以从选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分的抗过敏药。
这种抗过敏反应药对于通过抑制I型过敏反应可以治疗的疾病，例如支气管哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、花粉病、荨麻疹、接触性皮炎、过敏性结膜炎等的治疗、预防非常有效。
上述本发明的治疗用或预防用药物组合物，例如细胞凋亡诱发剂，能够以从选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分，通过将其与公知的药用载体组合制成制剂而制造的。
一般，将这些化合物与可药用的液体或固体载体组合，而且必要时添加溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，能够制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊等固体剂型，常用溶液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂。另外，也可以制成在使用前通过添加适当载体成为液态的干燥制品。
本发明的细胞凋亡诱发剂能够采用口服制剂及注射剂、输液剂等非口服制剂中的任意一种方式给药。
药用载体可以根据上述给药方式及剂型进行选择，口服制剂的场合，可以使用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，当制备口服制剂时，也可以进一步加入粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂、香料等。
另一方面，非口服制剂的场合，可以按照常规方法，通过将本发明的有效成分——具有细胞凋亡诱发性的糖化合物溶解或悬浊在注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀释剂中，必要时加入灭菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等制备。
本发明的细胞凋亡诱发剂可以根据制剂形态采用适当给药途径给药。给药方法也没有特别的限定，可以内用、外用和注射。注射剂可以通过例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，外用制剂中也包括栓剂等。
本发明的细胞凋亡诱发剂的给药量根据其制剂形态、给药方法、使用目的以及其适用患者的年龄、体重、症状等适当设定，并不是一定的，但一般在制剂中含有有效成分的量是成人每天10μg～200mg/kg。当然，由于给药量随各种条件改变，所以有时以低于上述给药量的量给药，有时有必要超出上述范围。本发明的药物除直接口服给药外，也可以添加到任意的饮食品中，使之进行日常摄取。
本发明的抗癌剂，能够以从选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分，将其与公知的药用载体组合制成制剂而制造的。抗癌剂的制备可以按照上述细胞凋亡诱发剂的制备方法进行。
抗癌剂可以根据制剂形态采用适当的给药途径给药。给药方法也没有特别的限定，可以内用、外用及注射。注射剂可以通过例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，外用制剂中也包括栓剂等。
抗癌剂的给药量可以根据其制剂形态、给药方法、使用目的以及其适用患者的年龄、体重、症状等适当设定，并不是一定的，但一般在制剂中含有有效成分的量为成人1日10μg～200mg/kg。当然，由于给药量随各种条件改变，有时会以低于上述给药量的量给药，有时则有必要超出上述范围。本发明的药物除直接口服给药外，也可以添加到任意饮食品中，使之进行日常摄取。
另外，作为本发明的抗氧化剂、活性氧产生抑制剂、过氧化脂质游离基产生抑制剂、NO产生抑制剂、免疫调节剂或抗过敏剂可以按照上述细胞凋亡诱发剂的制备方法制备，用量、用法按照上述细胞凋亡诱发剂使用即可。
也就是说，抗氧化剂、活性氧产生抑制剂、过氧化脂质游离基产生抑制剂、NO产生抑制剂、免疫调节剂或抗过敏剂可以根据制剂形态采用适当给药途径给药。给药方法也没有特别的限定，可以内用、外用及注射。注射剂可以通过例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，外用制剂中也包括栓剂等。
抗氧化剂、活性氧产生抑制剂、过氧化脂质游离基产生抑制剂、NO产生抑制剂、免疫调节剂或抗过敏剂的给药量，根据其制剂形态、给药方法、使用目的以及其适用患者的年龄、体重、症状等适当设定，并不是一定的，但一般在制剂中含有有效成分的量是成人1日10μg～200mg/kg。当然，由于给药量随各种条件改变，有时以低于上述给药量的量给药，有时则有必要时超出上述范围。本发明的药物除直接口服给药外，也可以添加到任意饮食品，使之进行日常摄取。
其次，本发明的饮食品是含有、添加和/或稀释有从选自式1～6化合物的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物，例如选自原料物质在pH低于7的酸性条件下得到的酸分解产物和/或酶分解产物生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物中的至少1种化合物，从而形成的食品或饮料，通过其细胞凋亡诱发作用、抗癌作用、抗氧化作用、免疫调节作用等，对于从选自式1～6化合物的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种具有敏感性的疾病，例如需要诱发细胞凋亡的疾病、癌症、需要抑制活性氧产生的疾病、需要抑制NO产生的疾病、需要免疫调节的疾病、过敏性疾病等症状的改善、预防非常有效。
本发明的食品或饮料的制备方法并没有特别的限定，可以采用烹饪、加工及经常使用的食品或饮料的制备方法，制造的食品或饮料中含有从选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物，例如选自原料物质在PH不到7的酸性条件下通过酸分解和/或酶分解生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种化合物作为有效成分即可。
本发明的饮食品并没有特别的限定，例如可以是谷类制品(如小麦粉制品、淀粉制品、预混合制品、面条类、通心粉类、面包类、豆酱类、荞麦面类、小麦麸面包、大米面、明胶面、包装米饼等)、油脂制品(如可塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黄酱、调味品等)、大豆制品(如豆腐类、酱、纳豆等)、肉类制品(如火腿、腌肉、压缩火腿、香肠等)、水产制品(如冷冻鱼肉、鱼糕、鱼卷、鱼肉蒸饼、油炸鱼丸、汆鱼丸、寿司、鱼肉火腿、香肠、木松鱼、鱼卵制品、水产品罐头、用调料煮的鱼等)、乳制品(如原料乳、乳酪、酸乳、奶油、干酪、炼乳、奶粉、冰淇凌等)、蔬菜·水果制品(如膏类、果酱类、腌制类、果汁、蔬菜饮料、混合饮料等)、甜食类(如巧克力、饼干、甜的小面包、蛋糕、年糕点心、米制点心等)、醇饮料(如日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌酒、白酒、伏特加酒、白兰地酒、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清凉醇饮料、水果酒、利口酒等)、嗜好饮料(如绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)、调味品(如酱油、调味汁、醋、料酒等)、罐装·瓶装·袋装食品(如牛肉饭、猪肉饭、红豆饭、咖哩饭、其他各种烹饪好的食品)、半干燥或浓缩食品(如肝的糊状物、其他spread、荞麦·面条的汤、浓缩汤类)、干燥食品(如方便面、方便咖哩饭、速溶咖啡、果汁粉、汤粉、方便酱汤、烹饪好的食品、调制好的饮料、烹饪好的汤等)、冷冻食品(如素烧、茶碗蒸饭、烤鳝鱼、汉堡包、烧麦、饺子、各种面条、水果鸡尾酒等)、固体食品、液体食品(如汤等)、香辛料类等农业·林业制品、畜牧业制品、水产制品等。
本发明的饮食品中，含有、添加和/或稀释有从选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物，例如选自原料物质在pH低于7的酸性条件下通过酸分解和/或酶分解生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物中的至少1种以上的化合物，只要含有可以表达其生理功能的所必要量即可，对其形状没有特别限定，也包括片状、颗粒状、胶囊状等可以口服摄取的形状。
3，6-脱水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物以及在还原末端具有该化合物的糖化合物，其半缩醛环容易开环，在末端容易成为醛。这个醛与3，6-脱水吡喃半乳糖的醛异构体的醛容易与对于醛具有反应活性的化合物，例如氨基酸等亲核物质发生反应，发生反应了的式1～6化合物或糖化合物，例如低聚糖，最终成为没有还原末端的选自式1～6的化合物的状态。因而失去了选自式1～6的化合物以及在还原末端具有该化合物的低聚糖所具有的各种生理活性。也就是说，在饮料或食品中，为了保持选自式1～6的化合物以及选自在还原末端具有该化合物的糖化合物稳定，就必须使对这些醛具有反应活性的化合物的摩尔浓度保持比这些醛的摩尔浓度低。
因而，在制造本发明的食品或饮料时，通过控制以前不进行控制的对这些醛具有反应活性的化合物量，使得在实质上不减少从选自式1～6的化合物以及在还原末端具有该化合物的低聚糖中选择的化合物，从而可以提供这些化合物含量高的食品或饮料。
另外，发现选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的糖化合物在其还原末端的该选自式1～6的化合物在酸性条件下是稳定，因此在本发明的食品或饮料的制备方法中，其全部过程均在酸性条件下进行，通过将得到的食品或饮料制成酸性食品或酸性饮料，从而可以提供从选自式1～6的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物含量高的酸性食品或酸性饮料。
在制备本发明酸性食品或酸性饮料的过程中，对酸分解原料物质的酸的种类没有特别的限定，可以使用无机酸或有机酸，从得到的琼脂酸分解产物的风味考虑优选有机酸分解的产物，通过适当使用有机酸，可以得到具有新型风味的酸分解产物。作为有机酸，可以根据目的进行选择，可以单独使用，也可以同时使用2种以上。作为有机酸，优选例如乙酸、枸橼酸、苹果酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸等。分解条件并没有特别的限定，但作为有机酸，例如使用枸橼酸时，原料物质例如琼脂，通过在60～103℃，优选90～105℃下，进行酸分解3～300分钟，优选30～200分钟，可以改变有机酸的酸味，得到具有良好味觉平衡、缓和舌感、平缓酸味的组合物。有机酸的量为0.05～30重量％，优选0.2～10重量％，加热处理使从选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物的含量达到1～20重量％(优选5～15重量％)的产物是具有较好酸味的酸味料。得到的酸味料在清凉饮料、酸性调料、酸性食品等的制造中非常有用。
本发明的酸性食品或酸性饮料是大量含有具有生理活性的从选自式1～6化合物的化合物以及具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物，例如原料物质在pH低于7的酸性条件下通过酸分解和/或酶分解生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物，由于它们具有细胞凋亡诱发作用、抗癌作用等生理功能，通过对其进行摄取可以达到预防癌变、抑制癌症等效果的食品或饮料。也就是说，本发明的酸性食品或酸性饮料是对从选自式1～6的化合物以及具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物具有敏感性的疾病具有改善作用或预防作用的健康食品或饮料，特别是可有效保持胃肠健康的食品或饮料。
另外，本发明从选自式1～6的化合物以及具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物，例如原料物质在pH低于7的酸性条件下通过酸分解和/或酶分解生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物具有抑制活性氧产生作用、抑制过氧化脂质游离基产生作用等抗氧化活性，可以作为用于抗氧化用食品的抗氧化剂或用于抗氧化用饮料的抗氧化剂，如活性氧产生抑制剂、过氧化脂质游离基产生抑制剂、NO产生抑制剂等，用于制备抗氧化用食品或抗氧化用饮料。
也就是说，通过本发明提供含有从选自式1～6的化合物以及具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分的抗氧化剂，特别是饮食品用的抗氧化剂。
本发明抗氧化剂的剂型并没有特别的限定，可以根据作为添加对象的饮食品种类按照常规方法，制成粉末状、糊状、乳化物等适当剂型，含有选自本发明所使用的化合物以及糖化合物的化合物作为有效成分的抗氧化用饮食品，可以通过使用本发明的抗氧化剂简便制备。
另外，按照本发明可以提供从选自式1～6的化合物以及具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的抗氧化用糖。例如，该抗氧化用糖可以由原料物质在pH低于7的酸性条件下作为酸分解产物和/或酶分解产物得到。另外，可以使用其精制产品、部分精制产品。作为原料物质可以单独使用或同时使用2种以上，例如来源于红藻类的原料物质，如琼脂、琼脂糖、角叉菜胶等。并没有特别的限定，但是，作为具有代表性的抗氧化用糖，可例示的有，含有选自式1～6化合物的化合物的可溶性糖化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等抗氧化用糖。
本发明的抗氧化用糖可以有效除去生物体内的氧化物质(如活性氧)，或抑制其产生，该抗氧化用糖对于由于活性氧产生或过剩引起的疾病，可有效改善症状或预防。
如上所述，在生物体内活性氧产生系统相对于消除系统占有优势时，由于生物体遭到氧化引起的氧化应激反应与各种疾病有关，生物体常常由于氧化应激反应引起疾病或疾病恶化。因此，为了预防、治疗这类氧化应激反应引起的疾病，或防止恶化，希望每天摄取适量的抗氧化物质。为了每天摄取适当的量，希望从饮食品中摄取，含有、稀释和/或添加有本发明抗氧化用糖制成的饮食品作为抗氧化用食品或抗氧化用饮料，以及作为抗氧化应激反应食品或抗氧化应激反应饮料是非常有用的。
由本发明使用的化合物及糖化合物选择的化合物也具有保湿性，能够以其至少1种化合物作为有效成分，制备抗便秘药、抗便秘用食品、抗便秘用饮料。
另外，按照本发明还可以提供以在还原末端具有选自式1～6化合物的可溶性糖化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等低聚糖为有效成分的化妆品。该糖化合物例如能够由原料物质在pH低于7的酸性条件下作为酸分解产物和/或酶分解产物得到。另外，也可以使用其精制产品、部分精制产品。作为原料物质，可以单独使用或同时使用2种以上，例如来源于红藻类的原料物质，如琼脂、琼脂糖、角叉菜胶等。
作为化妆品，能够以上述化合物作为有效成分，制成面霜、乳液、洗液、洗面奶、粉包等基础化妆品，口红、粉底等化妆用化妆品，浴液、肥皂等。另外，对头发也有效，可以制成头发滋补剂、洗头液、固发乳液、吹发用制剂、发乳、发套等头发制品及洗发剂、染发剂、头发护理剂等头发用化妆用品等护发产品。化妆品中的含量可以根据其美白作用、保湿作用、抗氧化作用适当决定。化妆品中的其它成分可以使用普通化妆品中所添加的物质。另外，美白作用、保湿作用可以按照常规方法进行测定，例如可以根据特开平8-310937号公报记载的方法进行测定。
本发明的化妆品由于对皮肤具有美白作用、保湿作用、抗氧化作用、抑制活性氧产生作用、抗氧化应激反应作用，对头发具有保湿作用、抗氧化作用、抑制活性氧产生作用、抗氧化应激反应作用等而显示优良的性质。
另外，按照本发明还可以提供以从选自式1～6的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等低聚糖作为有效成分的保鲜剂。该化合物例如能够由原料物质在pH低于7的酸性条件下作为酸分解产物和/或酶分解产物得到。另外，也可以使用其精制产品、部分精制产品。原料物质可以单独使用或同时使用2种以上，例如来源于红藻类的含有选自式1～6化合物的物质，如琼脂、琼脂糖、角叉菜胶等。
从选自式1～6化合物的化合物以及在还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物具有抗氧化作用、保鲜作用、抑制酪氨酸酶活性的作用，能够以其作为有效成分按照公知的制剂方法，制备可以有效防止食品变色、腐败、氧化等的食品保鲜剂。本发明的保鲜剂对于保持各种食品、新鲜食品、加工食品等的味道及鲜度非常有效。
确认本发明中使用的从选自式1～6的化合物以及具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的化合物，即使以1g/kg的给药量给小鼠口服或腹腔给药，均没有急性毒性。
以下，结合实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。实施例1(1)将市售的琼脂粉末(和光纯药公司生产)400mg悬浮在1N盐酸20ml中，用微波炉加热溶解。冷却溶液，用氢氧化钠调节pH至4，添加384mg的枸橼酸，用氢氧化钠调节pH至3。向该水溶液中加入水至40ml，120℃下处理4小时。用氢氧化钠将该酸分解液调节为pH6.5，用0.2μm(Corning公司生产)滤器过滤。
采用含有56℃下处理30分钟的牛胎儿血清10％的RPMI1640培养基(Gibco公司生产)，在37℃下培养的人前骨髓性白血病细胞HL-60(ATCC CCL-240)，培养后将该细胞悬浊于相同的培养基中达到2500个/90μl。将该悬浊液分别以每孔90μl注入96孔板中，对于各个悬浊液，分别添加10μl的上述酸分解液、上述酸分解液的10倍稀释物和水，在37℃、5％二氧化碳存在下培养，培养开始后24小时及48小时用光学显微镜观察细胞的形态后，采用“细胞凋亡试验记录”〔秀润社，田沼靖一主编，第156页(1994)〕中的MTT法，加入5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑翁溴化物(Sigma公司生产)的磷酸缓冲食盐水溶液10μl，再继续培养4小时，加入含有0.04 N盐酸的2-丙醇100μl，充分搅拌，测定590nm处的吸光度，比较由测得的吸光度计算出的存活细胞数。
结果，添加上述酸分解液及其10倍稀释液的培养基中与添加水的相比存活细胞数显著减少。另外，死细胞中能够观察到细胞凋亡小体。
(2)将琼脂粉末400mg悬浮在1N的盐酸20ml中，用微波炉加热溶解，配制酸分解液。冷却溶液后，添加50mM的枸橼酸缓冲液(pH3)20ml，用氢氧化钠调节为pH6.5，用0.2μm滤器(Corning公司生产)过滤，得到酸分解液。
将该酸分解液及该酸分解液的10倍稀释液按照与上述实施例1-(1)相同的方法测定对HL-60细胞的增殖抑制活性及细胞凋亡诱发活性。结果，该酸分解液也具有与实施例1-(1)记载的酸分解液几乎相同的癌细胞增殖抑制活性及细胞凋亡诱发活性。
(3)将琼脂粉末400mg悬浮在1N的盐酸40ml中，在沸水浴上溶解，得到溶液。将该溶液分成八等分，分别在沸水浴上保持0、30、60、90、120、180、210分钟后，冷却，用2N氢氧化钠调节为pH6.5。
将各处理液按照与上述实施例1-(1)相同的方法测定对HL-60细胞的抑制增殖活性及细胞凋亡诱发活性。结果，0分钟及30分钟的处理液显示与实施例1-(1)记载的酸分解液相同的活性，而60分钟以上的处理液则不具有这两种活性。
(4)分别将300mg的琼脂粉末悬浮在30ml的1、0.5、0.25、0.13、0.063、0.031、0.016、0.0078N的盐酸中，在沸水浴上保持10分钟，制成溶液。冷却该溶液后，用2N氢氧化钠调节为pH6.5。
将各处理液按照与上述实施例1-(1)相同的方法测定对HL-60细胞的抑制增殖活性及细胞凋亡诱发活性。结果，由1N(pH0.05)至0.063N(pH1.3)的盐酸处理液显示与实施例1-(1)记载的酸分解液相同的活性。在盐酸浓度低于0.063N时，随着盐酸浓度降低活性减小，但即使在0.0078N的盐酸处理液中也能够检测出这两种活性。
(5)分别将400mg的琼脂粉末添加到40ml的1N盐酸及0.12N盐酸中，在沸水浴上保持10分钟，制成溶液。用2N氢氧化钠将该溶液中和至pH6.5后，使用具有含10％乙醇的0.2M NaCl的CellulofineGCL-25作为洗脱液进行凝胶过滤。接着对各洗脱液，按照与上述实施例1-(1)相同的方法测定其对于HL-60细胞的抑制增殖活性及细胞凋亡诱发活性。另外增殖抑制活性作为相对活性如下所述进行测定。
添加各洗脱液，将HL-60细胞培养3天，按照实施例1-(1)记载的MTT法求得590nm处的吸光度(Abs T)。
添加用于凝胶过滤的洗脱液代替洗脱液，培养HL-60细胞，按照实施例1-(1)记载的MTT法求得590nm处的吸光度(Abs C)。
相对活性AbsC-AbsT图1表示琼脂0.12N盐酸分解产物的凝胶过滤洗脱图。图中纵轴表示用苯酚硫酸法测定的洗脱液中的糖含量(吸光度480nm白色圆圈)或相对活性(黑色圆圈)，横轴表示流份号(每1流份12ml)。
图2表示琼脂1N盐酸分解产物的凝胶过滤洗脱图。图中纵轴表示用苯酚硫酸法测定的洗脱液中的糖含量(吸光度480nm白色圆圈)或相对活性(黑色圆圈)，横轴表示流份号(每1流份12ml)。
如图1、图2所示，琼脂的酸分解产物具有抑制癌细胞增殖的活性，另外在死细胞中能够观察到细胞凋亡小体。
分别合并图1中流份号为51～64的洗脱液、及流份号为65～84的洗脱液，配制用于诱发细胞凋亡和/或用于抗癌的糖化合物。
分别合并图2中流份号为60～78的洗脱液、及流份号为79～95的洗脱液，制成用于诱发细胞凋亡和/或用于抗癌的糖化合物。实施例2(1)将市售的琼脂(Agar Noble，Difo公司生产)1g悬浮于0.1N盐酸100ml中，用微波炉加热直到沸腾使之溶解。冷却到室温，调节为pH6后，用Cosmonice滤器(Nacalai Tesque公司生产)过滤，将其滤液2ml采用以下逆相HPLC分离。
柱TSK-gel ODS 80Ts(20mm×250mm，Toso(東ソ)公司生产)TSK guard column ODS-80Ts(20mm×50mm，Toso公司生产)移动相0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液流速9ml/分检测215nm处的吸光度分别在各洗脱峰收集，在减压下干固后，溶解于300μl水中。将各流分过滤灭菌，向96孔微孔板中每孔加入10μl。向其中加入含有5000个HL-60细胞(ATCC CCL-240)的含10％牛胎儿血清(Gibco公司生产)的RPMI 1640培养基(Nissui公司生产)90μl，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养48小时。用光学显微镜观察细胞形态后，加入5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑翁溴化物磷酸缓冲食盐水溶液10μl，再继续培养4小时，加入含有0.04N盐酸的2-丙醇100μl，充分搅拌，在590nm处测定吸光度，以其作为细胞增殖度。
结果在添加了8.26分钟的峰处收集的流分的组中，可以观察到细胞凋亡小体，与添加水的对照组相比，在590nm处的吸光度低，抑制了细胞增殖。
(2)将实施例2-(1)记载的在8.26分钟的峰处收集的流份100μl采用下述尺寸排阻HPLC色谱法进行分离。
柱TSK-gelα-2500(7.8mm×300mm，Toso公司生产)TSK guard columnα(6mm×40mm，Toso公司生产)移动相0.01％TFA水溶液流速0.8ml/分检测示差折射计采用尺寸排阻HPLC色谱法的分离图如图3所示。也就是说，图3是琼脂酸分解产物的尺寸排阻HPLC色谱图，横轴表示洗脱时间(分)，纵轴表示示差折射计的输出量。
分别收集分离得到的各峰，在减压条件下干固。将各流份溶解于水使之达到10mg/ml，过滤灭菌后，按照上述实施例2-(1)的方法测定细胞凋亡诱发活性和抑制癌细胞增殖的活性。结果，在洗脱时间为8.87分钟和9.40分钟的峰具有这两种活性。
将洗脱时间为8.87分钟的物质与洗脱时间为9.40分钟的物质溶解于磷酸缓冲食盐水，在37℃下放置1小时后，同样用尺寸排阻HPLC进行分析。结果，任何一种试样均可见洗脱时间8.87分钟和9.40分钟的峰，且峰面积的比几乎相同。因此，确认在磷酸缓冲水溶液状态下，洗脱时间为8.87分钟与9.40分钟的物质处于平衡状态。
将在洗脱时间8.87分钟和9.40分钟的峰处收集的流份合并，在减压条件下干固，得到具有细胞凋亡诱发性和抗癌性的物质。
(3)采用DX302质量分析计(日本电子公司生产)对实施例2-(2)记载的具有细胞凋亡诱发性和抗癌性的物质进行质量分析。使用甘油作为基质，用阴离子方式进行测定。FAB-MSm/z 323[M-H]-415[M+甘油-H]-507[M+2甘油-H]-其结果如图4所示。也就是说，图4是具有细胞凋亡诱发性和抗癌性的物质的质谱图，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。
测定由实施例2-(2)得到的细胞凋亡诱发性和抗癌性物质的核磁共振光谱。核磁共振装置采用JNM-A500(日本电子公司生产)。1H-NMRδ3.36(1H，dd，J＝8.0，10.0Hz)、3.51(1H，dd，J＝3.0，10.0Hz)、3.56(1H，m)、3.58(1H，m)、3.63(1H，m)、3.67(1H，m)、3.70(1H，dd，J＝3.0，10.0Hz)、3.77(1H，d，J＝3.0Hz)、3.83(1H，dd，J＝4.5，10.0Hz)、3.93(1H，dd，J＝5.0，3.5Hz)、4.23(1H，m)、4.25(1H，m)、4.41(1H，d，J＝8.0Hz)、4.85(1H，d，J＝6.0Hz)将试样溶解于重水，HOD的化学位移值为4.65ppm。13C-NMRδ61.9、69.4、71.5、73.37、73.42、73.8、76.0、76.1、83.7、86.5、90.7、103.3将试样溶解于重水，二氧六环的化学位移值为67.4ppm。
图5表示细胞凋亡诱发性和抗癌性物质的1H-NMR光谱图。在图5中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。
另外，将试样溶解于重二甲基亚砜，并测定1H-NMR光谱。
1H-NMRδ9.60(1H，醛的H)图6表示细胞凋亡诱发性和抗癌性物质在重二甲基亚砜溶剂中的1H-NMR光谱。在图6中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。
根据这些质量分析、1H-NMR、13C-NMR的解析结果，鉴定实施例2-(2)记载的细胞凋亡诱发性和抗癌性物质为琼脂二糖。另外，通过在重二甲基亚砜溶剂中的1H-NMR表明琼脂二糖还原末端的3，6-脱水半乳糖在非水溶剂中主要以开环后的醛异构体存在。另外，通过重水溶剂中的1H-NMR表明在水溶液中作为醛异构体的水合物存在。
以上结果表明实施例2-(2)得到的细胞凋亡诱发性和抗癌性物质为琼脂二糖。
(4)将实施例2-(2)得到的细胞凋亡诱发性和抗癌性物质，即琼脂二糖溶解于水中，使之达到0.78mg/ml，在96孔微孔板的每孔中加入10μl，按照上述实施例2-(1)记载的方法测定细胞凋亡诱发活性和抑制癌细胞增殖的活性。结果，在光学显微镜中可见细胞凋亡小体，与添加水的对照组相比，添加琼脂二糖的组抑制细胞增殖约86％。也就是说，琼脂二糖在78μg/ml的浓度下对HL-60细胞可以诱发细胞凋亡，抑制细胞增殖。实施例3(1)将市售的琼脂(Agar Noble)2.5g悬浮于0.1N HCl 50ml中，在100℃下加热13分钟使之溶解。冷却至室温，用NaOH中和到pH中性附近后，用Cosmonice滤器(Nacalai Tesque公司生产)过滤，用以下正相HPLC进行分离。
柱TSK-gel Amide-80(21.5mm×300mm，Toso公司生产)溶剂A90％乙腈水溶液溶剂B50％乙腈水溶液流速5ml/分洗脱由溶剂A到溶剂B的直线浓度梯度(80分钟)→溶剂B(20分钟)检测195nm处的吸光度试样处理量2ml分别收集保留时间为66.7分钟、78.5分钟和85.5分钟的峰，进行质量分析，确认这些物质分别为琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂六糖。采用上述HPLC反复分离8次，在减压条件下干固，得到122mg琼脂二糖、111mg琼脂四糖和55mg琼脂六糖。
其结果如图7～图10所示。也就是说，图7表示琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂六糖的正相HPLC洗脱图，横轴表示保留时间(分钟)，纵轴表示195nm处的吸光度。图8表示66.7分钟的峰的质谱图，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。图9是78.5分钟的峰的质谱图，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。图10是85.5分钟的峰的质谱图，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。
(2)在实施例3-(1)所得琼脂二糖的100mM水溶液450μl中加入10倍浓度的磷酸缓冲食盐水(宝酒造公司生产，T900)50μl和10单位/μl的β-半乳糖甙酶(Sigma公司生产，G5635)磷酸缓冲食盐水溶液50μl混合，在37℃使之反应1小时。
在该反应液中加入5ml的1-丁醇∶乙醇＝1∶1混合溶液后，通过离心除去不溶物。采用柱色谱法用硅胶BW-300SP(3×50cm，富士Silysia化学公司生产)处理该液体，以1-丁醇∶乙醇∶水＝5∶5∶1作为洗脱液，用压缩机加压至0.3kg/cm2，进行分离。以1流份7ml进行分流，取各流份的一部分，用薄层色谱法进行分析，确认14号至17号的流份中含有高纯度的3，6-脱水-L-半乳糖。合并这些流份，在加压下干燥固化，得到3，6-脱水-L-半乳糖3.8mg。通过质量分析法和核磁共振法确认该物质的结构。
结果如图11～图13所示。也就是说，图11是3，6-脱水-L-半乳糖的质谱图，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。图12是326-脱水-L-半乳糖在重水溶剂中的1H-NMR光谱图，图13是其在重二甲基亚砜溶剂中的1H-NMR光谱图，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号的强度。
对于3，6-脱水-L-半乳糖，在重二甲基亚砜溶剂中的1H-NMR光谱显示在9.60ppm处有醛的氢的信号，表明在非水溶剂中作为开环的醛异构体存在，另外从重水中1H-NMR光谱表明在水溶液中是作为其醛异构体的水合物存在。实施例4(1)将实施例3所得3，6-脱水-L-半乳糖的20mM水溶液用无菌水稀释2倍、4倍和8倍，按照实施例2-(1)记载的方法测定细胞凋亡诱发活性和抑制癌细胞增殖的活性。结果，添加3，6-脱水-L-半乳糖的2倍稀释液的组(终浓度为1mM)可以观察到细胞凋亡小体，在590nm处的吸光度达到添加水的对照组的2分之1以下。
(2)将实施例3-(1)所得琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂六糖的50mM水溶液过滤灭菌，用无菌水稀释到2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍。按照实施例2-(1)记载的方法测定这些稀释液对于各种细胞抑制其增殖的活性。所用的细胞和培养基示于表1和表2中。
表1细胞培养基人前骨髓性白血病细胞 含有10％牛胎儿血清(Gibco公司HL-60(ATCC CCL 240) 生产)的RPMI1640培养基(Nissui公司生产)人末梢淋巴细胞 同上RPMI1778(ATCC CCL 156)小鼠单核细胞 含有10％牛胎儿血清的DMEM培养RAW264.7(ATCC TIB 71)基(Nissui公司生产)人胃癌细胞 含有10％牛胎儿血清的RPMI1640MKN45(理研gen bank， 培养基RCB1001)人肝癌细胞含有10％牛胎儿血清的DMEM培养HepG2(ATCC HB 8065) 基人结肠腺癌细胞含有10％牛胎儿血清的McCOY′SHT-29(ATCC HTB38) 培养基(Bio Whittaker公司生产)人结肠腺癌细胞同上HCT116(ATCC CCL-247)纤维肉瘤 含有10％牛胎儿血清的D-MEN培HT-1080(ATCC CCL-121) 养基(Bio Whittaker公司生产)表2细胞培养基成神经胶质细胞 含有10％牛胎儿血清的D-MEN培A-172(ATCC CRL1620) 养基人乳癌细胞 含有10％牛胎儿血清的DMEM培养MCF7(ATCC HTB-22) 基人乳癌细胞 含有10％牛胎儿血清的RPMI1640T-47D(ATCC HTB-133) 培养基人膀胱癌细胞含有10％牛胎儿血清的McCOY’ST24(ATCC HTB-4) 培养基人子宫颈部癌细胞含有10％牛胎儿血清的DMEM培养HeLa S3(ATCC CCL-22)基人肺癌细胞 同上A549(ATCC CCL-185)人结肠腺癌细胞 含有10％牛胎儿血清的RPMI1640WiDr(ATCC CCL-218) 培养基该结果表明琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂六糖对于这些细胞具有抑制增殖的活性。其结果如表3所示。另外，表3中的数字表示590nm处的吸光度与对照组相比达到2分之1以下的组中所添加的稀释液的稀释倍率，1倍稀释相当于细胞培养液中的浓度5mM。其次，对于琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂六糖，以590nm处的吸光度变化为基础，计算出显示50％增殖抑制率的浓度(IC50)，如表4所示。表3细 胞 琼脂二糖 琼脂四糖 琼脂六糖HL-60 32 64 64RPMI178864 128128RAW264.716 32 32MKN45 8 16 16HepG2 8 8 16HT-29 8 16 32HCT116 16 32 32HT-1080 8 16 16A-172 16 16 16MCF716 16 16T-47D 16 16 16T24 8 8 8HeLa S3 8 8 16A5498 8 16WiDr8 8 16表4IC50(μM)细胞琼脂二糖琼脂四糖琼脂六糖HL-60 170 97 78RPMI1788 44 28 22RAW264.7 179 133 109MKN45 344 196 166HepG2 652 413 430HT-29 622 208 144HCT116244 158 136HT-1080 317 216 185A-172 289 185 151MCF7 274 276 238T-47D 210 183 158T24 352 399 365HeLa S3 353 400 334A549 570 494 279WiDr 405 399 334实施例5将市售的琼脂5g悬浮于0.1N HCl 50ml中，在100℃下加热13分钟使之溶解。将冷却到室温后，用NaOH中和到pH中性附近的本发明的加热处理液2ml供给到填充有用水洗涤后的活性炭(60-150目，Nacalai Tesque公司生产，079-21)的柱子(10×255mm)中处理该加热处理液。用200ml水洗涤后，依次用2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％、30％、35％、40％、45％和50％的乙醇水溶液各200ml洗脱。
将各洗脱流份在加压条件下浓缩10倍，于硅胶板60F254(Merck公司生产)上点样，用1-丁醇∶乙醇∶水＝5∶5∶1展开后，用苔黑酚试剂〔将400mg苔黑素一水合物(Nacalai Tesque公司生产)溶解于22.8ml硫酸，加水至200ml得到的物质〕喷雾，观察斑点。
结果，在5％和7.5％乙醇水溶液洗脱流份中含有琼脂二糖的纯度较高，在15％和17.5％乙醇水溶液洗脱流份中含有琼脂四糖的纯度较高，在22.5％和25％乙醇水溶液洗脱流份中含有琼脂六糖纯度较高，在27.5％和30％乙醇水溶液洗脱流份中含有琼脂八糖纯度较高。实施例6实施例5得到的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖和琼脂八糖(以下有时将这些低聚糖称为琼脂低聚糖)溶解于水中使之达到2.5mM和1.25mM，过滤灭菌。将HL-60细胞悬浮于含有10％牛胎儿血清的RPMI1640培养基中使之达到2.5×105个/4.5ml，添加上述各低聚糖水溶液0.5ml，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养24小时和48小时。取一部分细胞培养液，加入锥虫蓝，用显微镜观察，测定存活细胞数。结果，各组与添加水的组(对照组)相比存活细胞数均减少，可以观察到细胞凋亡小体。
其结果如图14、图15所示。也就是说，图14是表示添加最终浓度为250μM的低聚糖培养HL-60细胞时的培养时的培养时间和存活细胞数的图，图15是表示添加最终浓度为125μM的低聚糖培养HL-60细胞时的培养时间和存活细胞数的图。在图14和图15中，横轴表示培养时间(小时)，纵轴表示存活细胞数(×105/5ml)，黑圆圈(●)表示添加水(对照)，菱形(◇)表示添加琼脂二糖，白圆圈(○)表示添加琼脂四糖，三角形(△)表示添加琼脂六糖，正方形(□)表示添加琼脂八糖。实施例7(1)将κ-角叉菜胶(Sigma公司生产，C-1263)或λ-角叉菜胶(和光纯药公司生产，038-14252)0.2g悬浊于0.1N HCl 20ml中，在95℃加热10分钟。用1NNaOH中和后，用水稀释1.5倍、2.25倍、3.38倍和5.06倍，按照实施例2-(1)的方法测定对HL-60细胞的细胞增殖抑制活性。结果，添加了κ-角叉菜胶加热物1.5倍、2.25倍和3.38倍稀释液的组以及添加了λ-角叉菜胶加热物1.5倍和2.25倍稀释液的组，其590nm处的吸光度达到添加水的对照组的2分之1以下，另外可见细胞凋亡小体。
(2)将市售琼脂(Agar Noble)、琼脂糖L03(宝酒造公司生产)以及市售的棒状琼脂分别悬浊于0.1N HCl中使之达到1％，在100℃加热15分钟。将该加热液冷却后，用1N NaOH中和，之后用水稀释2倍、4倍、8倍和16倍，按照实施例2-(1)的方法测定对于HL-60细胞的细胞增殖抑制活性。结果，添加了琼脂和琼脂糖酸分解产物2～8倍稀释液的组和添加了棒状琼脂酸分解产物2倍、4倍稀释液的组，其590nm处的吸光度达到添加水的对照组的2分之1以下，另外可见细胞凋亡小体。
采用正相HPLC对上述酸分解产物分别进行分析时，各分解产物均可以检测出以琼脂二糖为主的琼脂低聚糖。实施例8(1)将市售琼脂悬浮于下述酸的水溶液中，使其浓度达到1％。0.5M、1M或2M枸橼酸；0.1M、0.5M、1M或2M硝酸；0.1M或0.5M硫酸；0.1M、0.5M或1M磷酸；0.1M盐酸。
用微波炉将这些琼脂悬浊液加热到溶解后，用NaOH中和，用蒸馏水稀释到2、4、8、16或32倍，按照实施例2-(1)记载的方法测定对于HL-60细胞的细胞凋亡诱发活性和抑制癌细胞增殖的活性。
结果，进行了上述各种酸加热处理的琼脂对于HL-60细胞可以诱发细胞凋亡，抑制细胞增殖。其结果如表5所示。另外，表5中的数字表示590nm处的吸光度与添加水的对照组相比达到2分之1以下的稀释液的稀释倍率。另外，括号中的数字表示不加琼脂本实施例中使用的最大浓度的酸用NaOH中和后，用蒸馏水稀释之后添加时，590nm处的吸光度与添加水的对照组相比达到2分之1以下的稀释液的稀释倍率。表50.1M0.5M 1M 2M枸橼酸 4 8 16(8)硝酸8 1616(2)硫酸8 16(2)磷酸4 8 16(1)盐酸16(2)采用以下正相HPLC对实施例8-(1)得到的琼脂酸加热处理产物进行分析。
柱PALPAK type S(4.6×250mm，宝酒造公司生产，CA8300)溶剂A90％乙腈水溶液溶剂B50％乙腈水溶液流速1ml/分洗脱溶剂A(10分钟)→由溶剂A至溶剂B的直线浓度梯度(40分钟)→溶剂B(10分钟)检测195nm处的吸光度柱温度40℃结果在0.5M、1M、2M枸橼酸；0.1M、0.5M、1M、2M硝酸；0.1M、0.5M硫酸；0.1M、0.5M、1M磷酸；0.1M盐酸中进行加热处理的试样中含有以琼脂二糖为主的琼脂低聚糖。
其代表性的结果如图16所示。也就是说，图16是在0.5M磷酸中进行加热处理后的琼脂的正相HPLC洗脱图，横轴表示保留时间(分钟)，纵轴表示195nm处的吸光度。实施例9将市售的琼脂(伊那琼脂型S-7，伊那食品工业公司生产)5g悬浊于20、50或100mM枸橼酸45ml中，在95℃下加热，在加热下述时间后取一部分样。
20mM枸橼酸处理产物310分钟、350分钟、380分钟、440分钟和530分钟；50mM枸橼酸处理产物100分钟、120分钟、140分钟、160分钟、180分钟、200分钟、220分钟、240分钟、260分钟、290分钟和320分钟；100mM枸橼酸处理产物60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、120分钟、140分钟、160分钟、180分钟、200分钟、220分钟和240分钟。
将各试样的10倍稀释液1μl在硅胶60板F254(Merck公司生产)上点样，用1-丁醇∶乙醇∶水＝5∶5∶1展开，用苔黑酚-硫酸法检测。
其结果，各试样中均含有琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖等的琼脂低聚糖。
20mM枸橼酸处理产物中琼脂低聚糖的含量增加到加热350分钟，之后几乎达到恒量。
50mM枸橼酸处理产物中琼脂低聚糖的含量增加到加热200分钟，之后几乎达到恒量。
100mM枸橼酸处理产物中琼脂低聚糖的含量增加到加热160分钟，之后几乎达到恒量。
用越高浓度的枸橼酸处理的试样其最终的琼脂低聚糖含量越高。
采用与实施例8-(2)同样的正相HPLC对各试样进行分析时，得到与薄层色谱同样的结果。但是，100mM枸橼酸处理产物中含有的杂质比50mM枸橼酸处理产物中含有的杂质多，随加热时间的增加杂质也增加。实施例10(1)将实施例3-(1)制得的琼脂二糖溶解至0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM。将各试样1μl在硅胶60板F254上点样，用氯仿∶甲醇∶乙酸＝7∶2∶2的溶剂展开3次，用苔黑酚-硫酸法显色。显色后的板通过FOTODYNE FOTO/Analyst ArchiverEcripse(中心科学贸易公司出售)取得图像数据，采用图像解析软件1-D Basic(Advanced American Biotechnology公司生产)对该图像数据进行图像处理，使各种浓度琼脂二糖的斑点强度数值化，制成标准曲线。
标准曲线如图17所示。也就是说，图17是琼脂二糖的标准曲线，将斑点强度相对于各种浓度的琼脂二糖作图，横轴表示琼脂二糖的浓度(mM)，纵轴表示斑点强度。另外，图17中的计算公式表示斑点强度(y)与琼脂二糖的浓度(x)之间的关系，对于琼脂二糖浓度未知的试样，可以通过得到的斑点强度由计算公式计算出琼脂二糖的浓度。
另外，同样的制作实施例5得到的琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖的标准曲线。
(2)将市售的琼脂(Agar Noble)0.2g悬浊于水90ml中，采用微波炉加热溶解，冷却到室温附近。向其中加入1M HCl或1M枸橼酸10ml，分别配制0.2％琼脂0.1M HCl溶液和0.2％琼脂0.1M枸橼酸溶液。将该溶液在90℃加热，在5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、21小时各时刻取样。将各试样按照实施例10-(1)记载的方法进行薄层色谱分析，求出斑点强度，计算出琼脂二糖的浓度。另外，在琼脂二糖浓度为0.05mM至1mM的范围将各试样适当稀释。
图18、图19表示对于0.2％琼脂0.1M HCl溶液和0.2琼脂0.1M枸橼酸溶液其加热时间和琼脂二糖产量之间的关系。也就是说，图18表示对于0.2％琼脂0.1M HCl溶液其加热时间和琼脂二糖产量之间的关系，图19表示对于0.2％琼脂0.1M枸橼酸溶液其加热时间和琼脂二糖产量之间的关系。图18、图19中，横轴表示加热时间(小时)，纵轴表示琼脂二糖的浓度(mM)。
如图18所示，确认在0.2％琼脂0.1M HCl溶液中，1小时后琼脂二糖的浓度达到最高，之后减少。另外，如图19所示，确认在0.2％琼脂0.1M枸橼酸溶液中，琼脂二糖的浓度缓慢增加到8小时，第21小时减少。另外，0.2％琼脂0.1M HCl溶液的5分钟加热试样以及0.2％琼脂0.1M枸橼酸溶液的5、10、20分钟加热试样中琼脂二糖的浓度为检测限以下。
(3)将Agar Noble悬浊于5、50、500mM枸橼酸中使之达到10％，在65、80、95℃加热，在加热后30分钟、1、2、4、8、24小时取样，按照实施例10-(1)记载的方法测定琼脂低聚糖的产量。
结果，将琼脂溶解于5 mM枸橼酸的场合，80℃下生成一些琼脂低聚糖，65℃下几乎不生成琼脂低聚糖。95℃下，琼脂二糖在8～24小时显示高值，琼脂四糖也在8～24小时显示高值。将琼脂溶解于50mM枸橼酸的场合，65℃下几乎不生成琼脂低聚糖。80℃下琼脂二糖在24小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖在4～8小时显示高值。95℃下，琼脂二糖在24小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖在4～8小时显示高值。将琼脂溶解于500mM枸橼酸的场合，65℃下在4～24小时生成了一些琼脂低聚糖。80℃下琼脂二糖在2～24小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖在1～6小时显示高值。琼脂八糖在1～2小时显示高值。95℃下琼脂二糖在1～24小时显示高值，琼脂四糖在1～2小时显示高值。琼脂六糖、琼脂八糖在30分钟～1小时显示高值。
采用500mM枸橼酸水解的例子如图20和图21所示。也就是说，图20是表示500mM枸橼酸、80℃下琼脂低聚糖生成的图，图中纵轴表示琼脂低聚糖的产量(圆圈琼脂二糖；三角形琼脂四糖；正方形琼脂六糖；×形琼脂八糖)，横轴表示时间。另外，图21是表示500 mM枸橼酸、95℃下琼脂低聚糖生成的图，图中纵轴表示琼脂低聚糖的产量(圆圈琼脂二糖；三角形琼脂四糖；正方形琼脂六糖；×形琼脂八糖)，横轴表示时间。
(4)使用50、500、1000mM的醋酸，采用与实施例10-(3)相同的方法，测定琼脂低聚糖的生成。
其结果，将琼脂溶解于50mM醋酸时，80℃下生成一些琼脂低聚糖，65℃下几乎不生成琼脂低聚糖。将琼脂溶解于500mM醋酸时，65℃下几乎不生成琼脂低聚糖。80℃和95℃下生成一些琼脂低聚糖。将琼脂溶解于1000mM醋酸时，65℃下几乎不生成琼脂低聚糖。80℃下在24小时琼脂二糖显示高值，在8小时生成一些琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖。95℃下琼脂二糖在8小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖也在8小时显示高值。
(5)使用60、600、1200mM的乳酸，按照与实施例10-(3)相同的方法测定琼脂低聚糖的生成。
该结果，将琼脂溶解于60mM乳酸中时，95℃下生成一些琼脂低聚糖，65、80℃下几乎不生成琼脂低聚糖。将琼脂溶解于600mM乳酸中时，80℃下琼脂二糖在8～24小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖在4～8小时显示高值。琼脂八糖在4小时显示高值。95℃下琼脂二糖在4～8小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖在2～6小时显示高值。将琼脂溶解于1200mM乳酸中时，80℃下琼脂二糖在4～24小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖在2～6小时显示高值。琼脂八糖在2小时显示高值。95℃下琼脂二糖在2～8小时显示高值，琼脂四糖、琼脂六糖在1～2小时显示高值。
采用1200mM乳酸水解的例子如图22和图23所示。也就是说，图22是表示1200mM乳酸、80℃下琼脂低聚糖生成的图，图中纵轴表示琼脂低聚糖产量(圆圈琼脂二糖；三角形琼脂四糖；正方形琼脂六糖；×形琼脂八糖)，横轴表示时间。另外，图23是表示1200mM乳酸、95℃下琼脂低聚糖生成的图，图中纵轴表示琼脂低聚糖产量(圆圈琼脂二糖；三角形琼脂四糖；正方形琼脂六糖；×形琼脂八糖)，横轴表示时间。
(6)使用20、200、1000mM的苹果酸，按照与实施例10-(3)相同的方法测定琼脂低聚糖的生成。
其结果，将琼脂溶解于20mM苹果酸中时，95℃下生成一些琼脂低聚糖，65、80℃下几乎不生成琼脂低聚糖。将琼脂溶解于200mM苹果酸中时，65℃下在24小时生成一些琼脂低聚糖。80℃下琼脂二糖在8～24小时显示高值，琼脂四糖在4～8小时显示高值。琼脂六糖在4小时显示高值。琼脂八糖在4小时显示高值。95℃下琼脂二糖在4～8小时显示高值，琼脂四糖在4小时显示高值。将琼脂溶解于1000mM苹果酸中时，65℃下在24小时生成一些琼脂低聚糖。80℃下琼脂二糖在2～24小时显示高值，琼脂四糖在2～6小时显示高值。琼脂六糖、琼脂八糖在2小时显示高值。95℃下琼脂二糖在1～8小时显示高值，琼脂四糖在1～2小时显示高值。琼脂六糖、琼脂八糖在1小时显示高值。
采用1000mM苹果酸水解琼脂的例子如图24和图25所示。也就是说，图24是表示1000mM苹果酸、80℃下琼脂低聚糖生成的图，图中纵轴表示琼脂低聚糖产量(圆圈琼脂二糖；三角形琼脂四糖；正方形琼脂六糖；×形琼脂八糖)，横轴表示时间。另外，图25是表示1000mM苹果酸、95℃下琼脂低聚糖生成的图，图中纵轴表示琼脂低聚糖产量(圆圈琼脂二糖；三角形琼脂四糖；正方形琼脂六糖；×形琼脂八糖)，横轴表示时间。
(7)将Agar Noble悬浊于100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mM的苹果酸中使之达到10％，在70、80、90℃加热。加热后在30分钟、1、2、3、4、8、24小时取样，按照与实施例10-(3)相同的方法测定琼脂低聚糖的生成。
在300mM以上的苹果酸浓度下，即使在70℃，8小时以上也可生成较多的琼脂低聚糖。1000mM、70℃下水解的例子如图26所示。也就是说，图26是表示1000mM苹果酸、70℃下琼脂低聚糖生成的图，图中纵轴表示琼脂低聚糖产量(圆圈琼脂二糖；三角形琼脂四糖；正方形琼脂六糖；×形琼脂八糖)，横轴表示时间。
根据上述实施例10-(3)～(7)的结果，用于制备琼脂低聚糖的酸优选枸橼酸、乳酸、苹果酸，酸的浓度优选数十mM至数M，加热温度优选70～95℃，加热时间优选数十分钟至24小时。
(8)采用下述方法对琼脂二糖进行定量，使用F-试剂盒乳糖/半乳糖(Boehringer Mannheim公司生产，编号176303)，使β-半乳糖甙酶作用于琼脂二糖，测定生产的半乳糖浓度。
按照试剂盒的使用方法进行定量，但β-半乳糖甙酶的反应改变为37℃、1小时。使用乳糖制作标准曲线，计算出按乳糖换算的摩尔浓度(mM)后，转换成琼脂二糖的浓度(mg/ml)。
使用上述实施例制得的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖，采用上述方法尝试进行定量。其结果，琼脂二糖的计算值与实测值一致。另一方面，采用上述方法实质上没有检测出琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖。即说明采用上述检测方法实质上检测不出琼脂二糖以外的琼脂低聚糖，也说明采用上述方法可以测定琼脂低聚糖中的琼脂二糖浓度。
(9)将市售的琼脂(伊那琼脂型S-7伊那食品工业公司生产)100 g和H型强阳离子交换树脂(Diaion SK104H三菱化成生产)10g在95℃的去离子水900g中混合，在95℃下搅拌的同时进行琼脂酸分解180分钟。然后，冷却到室温，用活性炭1％W/W以及硅藻土545(Celite公司生产)0.5％W/W Body feed过滤，得到滤液。
采用与实施例8-(2)相同的正相HPLC对制得的滤液进行分析，确认生成了以琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖为主要成分的琼脂低聚糖。
该滤液pH为2.4，酸度为1.7，白利糖度为9.4％，使用上述实施例10-(8)记载的F-试剂盒乳糖/半乳糖测得的琼脂二糖量为7.4％。
(10)在100g去离子水中加入H型强阳离子交换树脂(DiaionSK104H)18.5g，在95℃下搅拌。以后每隔10分钟添加1次琼脂(伊那琼脂型S-7)，每次10g添加5次，之后每次15g添加2次，再每次20g添加3次，最后添加30g。添加的琼脂总量达到185g后，在95℃下搅拌150分钟，然后冷却到室温。采用倾泻法分离树脂和液体后，用活性炭3％W/W以及硅藻土545(Celite公司生产)0.5％W/W Bodyfeed过滤分离液，得到滤液。
采用与实施例8-(2)相同的正相HPLC对制得的滤液进行分析，确认生成了以琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖为主要成分的琼脂低聚糖。
该滤液pH为1.2，酸度为11.9，白利糖度为64％，使用上述实施例10-(8)记载的F-试剂盒乳糖/半乳糖测得的琼脂二糖量为24.4％。
(11)使用市售的琼脂(伊那琼脂型S-7)100g，加入各种磷酸浓度的去离子水使之达到1升，在95℃下搅拌的同时使琼脂液化。
另外，使用加入枸橼酸浓度为1％W/V的去离子水1升的物质，与磷酸同样进行琼脂液化。液化是指即使在其冰点也不变成凝胶的状态，测定达到该状态的时间(液化时间)。另外，使用上述实施例10-(8)记载的F-试剂盒乳糖/半乳糖测定液化时以及之后的琼脂二糖产量。
其结果如表6、表7所示。表6磷酸浓度 液化时间95℃琼脂二糖(％W/V) (分)保留时间 (g/升)(分)0.2150150 2.57180 3.80300 7.970.3120120 4.88180 7.04300 13.900.5110110 6.09180 8.48300 21.401.090 907.58120 18.80表7枸橼酸浓度液化时间95℃ 琼脂二糖(％W/V) (分)保留时间 (g/升)(分)1.0 9090 0.951203.401504.093005.7036014.80实施例11(1)在市售的琼脂(伊那琼脂型S-7，伊那食品工业公司生产)150g、食品添加剂枸橼酸(酐)(三荣源F·F·I公司生产)15g中加入去离子水使之达到1.5升，温度上升到92℃后，搅拌条件下在92～95℃保持130分钟。然后冷却到室温，用硅藻土545(Celite公司生产)0.5％Body feed过滤，得到滤液(琼脂分解低聚糖溶液)。采用与实施例8-(2)相同的正相HPLC对制得的滤液进行分析，确认生成了以琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖为主要成分的琼脂低聚糖。
该滤液pH为2.6，酸度为0.92，白利糖度为9.2％，采用上述实施例10-(8)记载的方法测得的琼脂二糖产量为43.1mM。
(2)将实施例11-(1)制得的滤液(琼脂分解低聚糖溶液)稀释20倍，添加酸味剂、甜味剂、调味香料，制备琼脂二糖2.25mM的清凉饮料。
其配方如表8和表9所示。也就是说，表8是菩提子味清凉饮料的配方，表9是紫苏味清凉饮料的配方。
将各表所示的原料加入到水中溶解，配制清凉饮料，分装到200ml的罐中。将表5所示配方的清凉饮料用二氧化碳饱和，制得气压达到0.8kg/cm2(20℃)的碳酸饮料。
各饮料的分析值如表8、表9的下栏所示。
表8琼脂分解低聚糖溶液50ml1/7菩提子 20g维生素C 0.2g枸橼酸0.2g甘露醇1.25g菩提子调味香料1g去离子水 余量合计 1000mlpH3.2酸度*0.23白利糖度 2.2酸度*0.1N NaOH ml/10ml(以下相同)表9琼脂分解低聚糖溶液50ml紫苏提取物20g维生素C 0.2g枸橼酸0.2g紫苏调味香料 0.5g去离子水 余量合计1000mlpH2.9酸度*0.10白利糖度 0.6由10名评审员对各种本发明的碳酸饮料进行口感评价，评价分为5段(5良好，1差)。用酸度相同的枸橼酸液代替琼脂分解低聚糖溶液作为对照。
菩提子味的口感评价平均值如表10所示，紫苏味的口感评价平均值如表11所示。
表10本发明产品 对照味觉温和度 4.6 3.1爽滑度 4.8 3.0滋味的平衡 4.5 2.9综合评定 4.6 3.1表11本发明产品对照味觉温和度4.52.5爽滑度4.32.4滋味的平衡 4.22.5综合评定4.32.4将本发明产品分别与对照组相比，调节了饮料滋味的平衡，味觉更温和、爽滑，是具有新味觉的饮料。另外，用二氧化碳饱和前的清凉饮料也分别与上述相同，是具有新味觉的本发明产品的饮料。
(3)在上述表8、表9记载的清凉饮料中加入乙醇进行配制，使乙醇达到6％V/V或8％V/V，分装到200ml的罐中。然后，将该醇饮料用二氧化碳饱和，制备气压达到0.8kg/cm2(20℃)的本发明的清凉碳酸醇饮料。
本发明的清凉碳酸醇饮料与不含有琼脂分解低聚糖溶液的对照组相比，调节了饮料滋味的平衡，味觉更温和、爽滑，是具有新味觉的清凉碳酸醇饮料。实施例12(1)如下所述配制含有琼脂枸橼酸分解产物的饮料。其配方如表12所示。也就是说，表12的本发明产品1使用实施例11-(1)制得的滤液(琼脂低聚糖溶液)0.1％W/V、琼脂(超琼脂AX-30伊那食品工业公司生产)0.25％W/V和枸橼酸0.07W/V。本发明产品2不添加琼脂低聚糖溶液，使用琼脂0.25％W/V、枸橼酸0.08％W/V。本发明产品1和2是分别将琼脂溶解于温水后，与其它材料混合，在酸性条件下93℃加热10秒，在低于93℃～80℃加热20分钟，再在低于80℃～75℃加热15分钟，制得含有琼脂枸橼酸分解产物的饮料。另一方面，对照组的配方与本发明产品2相同，但在93℃下加热10秒。
对于含有枸橼酸分解产物的各种粘稠饮料(本发明产品1和2)，由10名评审员进行口感评价，评价分为5段(5良好，1差)。口感评价的平均值如表13所示。表12本发明产品1 本发明产品2琼脂(g) 2.5 2.5琼脂低聚糖溶液(ml) 1.0 01/7菩提子果汁(g)1.5 1.5砂糖(g) 66.0 66.0枸橼酸(g) 0.7 0.8枸橼酸钠(g) 0.5 0.5香料2.0 2.0去离子水余量 余量合计 1000ml 1000mlpH 3.68 3.67酸度*1.53 1.57白利糖度 7.5 7.4琼脂二糖(mM)**0.06 0.02琼脂二糖(mM)**按照实施例10-(8)记载的方法测定表13本发明产品1 本发明产品2对照味觉温和度4.4 4.13.6爽滑度4.5 4.33.8滋味的平衡 4.4 4.23.6综合评定4.5 4.33.7本发明产品1和本发明产品2与对照相比，调节了饮料滋味的平衡，粘度适当，味觉更温和、爽滑，是具有新味觉的饮料。另外，确认通过在枸橼酸存在下进行热处理，在本发明产品1和2中产生了抗氧化用的低聚糖、琼脂二糖，提供了一种含有抗氧化用低聚糖的新型饮料。
另外，分别用在75℃下加热1日、85℃下加热5分钟、103℃下加热5分钟、122℃下加热45秒代替在低于80℃～75℃下加热15分钟的加热条件，按照实施例10-(8)记载的方法测定琼脂二糖的产量，分别为0.03mM、0.02mM、0.04mM和0.05mM，确认通过加热处理生成了琼脂二糖，另外加热条件越强，琼脂二糖产量越高。
(2)在实施例12-(1)记载的本发明产品1、本发明产品2和对照的饮料中加入乙醇，使乙醇达到2％V/V或4％V/V，减少相当于该量的多余的去离子水，配制醇饮料。
本发明产品1和本发明产品2与对照相比，调节了饮料滋味的平衡，粘度适当，味觉更温和、爽滑，是具有新味觉的饮料。
另外，上述本发明的醇饮料的冻结产物具有果汁冰糕样的良好口感。实施例13(1)将市售琼脂(Agar Noble)悬浊于0.1N盐酸中，使浓度达到1％，在37℃处理5小时、16小时或48小时。用蒸馏水将该处理液稀释10倍，采用实施例9记载的薄层色谱法进行分析，确认处理5小时仅生成了一点琼脂低聚糖，处理16小时的产量比处理5小时多，处理48小时产量进一步增加。
(2)将市售的琼脂(Agar Noble)悬浊于磷酸缓冲食盐水或蒸馏水中，使浓度达到1％，在121℃加热4小时。用蒸馏水将该加热处理物稀释10倍，采用实施例9记载的薄层色谱法进行分析，确认在磷酸缓冲食盐水中进行加热处理的试样产生了痕量的琼脂低聚糖，而在蒸馏水中进行加热处理的试样则产生了明显多的琼脂低聚糖。另外，前者加热处理后的pH约为7，后者的pH约为5，如果冷却到室温，前者变成凝胶，而后者却不会变成凝胶。实施例14(1)将琼脂(Agar Noble)悬浊于0.1N HCl使浓度达到10％，在100℃加热19分钟。采用经水平衡后的TOYOPEARL HW40C(TOSO公司生产)柱(4.4cm×85cm)处理10ml上述试样，以水作为移动相，以每分钟1.4ml的流速进行凝胶过滤色谱分析。用示差折射计检测洗脱出的物质，收集每7ml作为1流份。
确认在洗脱时间406分钟、435分钟、471分钟和524分钟出现峰，采用实施例9记载的薄层色谱法对各峰所对应的流份进行分析，它们依次是琼脂八糖、琼脂六糖、琼脂四糖和琼脂二糖。将这些流份冷冻干燥，得到30mg琼脂八糖、100mg琼脂六糖、150mg琼脂四糖和140mg琼脂二糖。
(2)分别在实施例14-(1)所得琼脂二糖、琼脂四糖的100mM水溶液25μl中加入100ml L-半胱氨酸水溶液50μl，加入磷酸缓冲食盐水925μl，在37℃下使之反应1小时或16小时。用同浓度的L-赖氨酸水溶液代替L-半胱氨酸水溶液进行同样的反应。
用各反应试样1μl在硅胶板60F254上点样，用1-丁醇∶乙醇∶水＝5∶5∶1展开，用苔黑酚硫酸法检测。
其结果，在L-半胱氨酸的1小时反应试样中，琼脂二糖、琼脂四糖的斑点消失。另外，L-半胱氨酸、L-赖氨酸的16小时反应试样中，琼脂二糖、琼脂四糖的斑点均消失。
采用与实施例8-(2)同样的正相HPLC对各试样进行分析，得到与薄层色谱分析相同的结果。
(3)将实施例14-(2)制得的各反应试样10μl加入到96孔微孔板的孔中，按照实施例2-(1)记载的方法测定对HL-60的癌细胞增殖抑制活性。
其结果，琼脂二糖、琼脂四糖斑点消失的试样其活性也消失。也就是说，琼脂二糖、琼脂四糖和L-半胱氨酸的1小时反应试样以及琼脂二糖、琼脂四糖与L-半胱氨酸、L-赖氨酸的16小时反应试样，与同浓度的琼脂二糖、琼脂四糖相比，细胞增殖抑制活性达到约1/10。实施例15(1)将κ-角叉菜胶(Sigma公司生产，C-1263)2.5g悬浮于0.1NHCl 50ml中，在100℃下加热16分钟使之溶解。冷却至室温，用NaOH中和到pH中性附近后，用Cosmonice滤器过滤，用以下正相HPLC进行分离。
柱PALPAK type S(4.6mm×250mm，宝酒造公司生产，CA8300)溶剂A90％乙腈水溶液溶剂B50％乙腈水溶液流速1 ml/分洗脱溶剂A(10分钟)→由溶剂A到溶剂B的直线浓度梯度(40分钟)→溶剂B(10分钟)检测215nm处的吸光度柱温度40℃试样处理量50μl正相HPLC得到的分离图如图27所示。也就是说，图27是κ-角叉菜胶酸分解产物的正相HPLC色谱图，横轴表示保留时间(分钟)，纵轴表示215nm处的吸光度。
分别收集各洗脱峰，在加压下干固后，溶解于100μl水。将各流份过滤灭菌，按照实施例2-(1)记载的方法测定对HL-60细胞的细胞增殖抑制活性。其结果，在添加了27.797分钟、33.905～34.784分钟、36.226～36.654分钟的各峰处收集的流份的组中，可以观察到细胞凋亡小体，与添加水的对照组相比，在590nm处的吸光度低，抑制了细胞增殖。
将洗脱时间27.797分钟的峰处收集的流份在上述HPLC条件下分离12次，合并，加压下干固，得到具有细胞凋亡诱发活性和抗癌活性的物质。
(2)采用DK302质量分析计(日本电子公司生产)对实施例15-(1)记载的具有细胞凋亡诱发性和抗癌活性的物质进行质量分析。使用甘油作为基质，用阴离子方式进行测定。FAB-MSm/z 403[M-H]-495[M+甘油-H]-其结果如图28所示。也就是说，图28是具有细胞凋亡诱发性和抗癌活性的物质的质谱图，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。
测定由实施例15-(1)得到的细胞凋亡诱发性和抗癌活性物质的核磁共振光谱。核磁共振装置采用JNM-A500(日本电子公司生产)。
图29表示细胞凋亡诱发性和抗癌活性物质的1H-NMR光谱图。在图29中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。
根据这些质量分析、1H-NMR的解析结果，鉴定实施例15-(1)记载的细胞凋亡诱发性和抗癌活性物质为κ-角叉菜二糖〔β-D-吡喃半乳糖-4-硫酸酯-(1→4)-3，6-脱水-D-半乳糖〕。
以上结果表明实施例15-(1)得到的细胞凋亡诱发性和抗癌活性物质为κ-角叉菜二糖。
(3)将实施例15-(1)得到的κ-角叉菜二糖溶解于水使之达到1.56mM，在96孔微孔板的孔中加入10μl，按照实施例2-(1)记载的方法测定细胞凋亡诱发活性和癌细胞增殖抑制活性。结果，用光学显微镜观察到细胞凋亡小体，与添加水的对照组相比，添加κ-角叉菜二糖的组抑制细胞增殖约70％。因此，κ-角叉菜二糖在156μM下对HL-60细胞可诱发细胞凋亡，抑制细胞增殖。实施例16(1)将市售琼脂粉末(和光纯药公司生产)4.5g悬浊于0.1N盐酸150ml中，用微波炉加热溶解，将溶液在沸水浴上保持10分钟。进行加热处理后，将该加热处理琼脂溶液放冷至室温，离心分离除去不溶物。然后，回收离心上层清液，用1N氢氧化钠调节为pH6.8。在该离心上层清液150ml中加入等量的乙酸乙酯后，剧烈搅拌，分成乙酸乙酯相和水相。将分离得到的水相用蒸发器干固后，再度溶解于150ml水，通过离心分离除去溶解时的不溶物，得到上层清液。另外，乙酸乙酯相用蒸发器干固，溶解于100ml离子交换水，用1N氢氧化钠调节为pH6.5。
将乙酸乙酯相、水相用孔径0.2μm的滤器(Corning公司生产)过滤灭菌后，用水稀释10、20、30倍，按照与实施例2-(1)相同的方法测定对HL-60细胞的增殖抑制活性。其结果，确认水相具有增殖抑制活性，乙酸乙酯相没有增殖抑制活性。
将制得的水相溶液50ml用Cellulofine GCL-25柱(41×905mm)凝胶过滤。洗脱液使用含有10％乙醇的0.2M NaCl。洗脱图如图30所示。也就是说，图30是表示采用Cellulofine GCL-25进行凝胶过滤结果的图，图中纵轴表示采用苯酚硫酸法测得的洗脱液中的糖含量(吸光度490nm黑圆圈)，横轴表示流份号(1流份10ml)。
用各洗脱流份1μl分别在硅胶板60F254(Merck公司生产)上点样，用1-丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶2展开后，用苔黑酚试剂〔将400mg的苔黑素一水合物(和光纯药公司生产)溶解于22.8ml硫酸，加水至200ml得到的物质〕喷雾，用150℃下加热后的电热板加热，观察斑点。
将采用上述TLC分析对斑点进行确认的40号至120号流份中的每5流份合并，过滤灭菌，测定对HL-60细胞的增殖抑制活性。其结果，86号至90号流份具有最强的增殖抑制活性。
(2)回收86至88号流份，用蒸发器干固，得到0.94g粉末。将得到的粉末溶解于90％乙醇30ml，用5C滤器(ADVANTEC公司生产)除去白色沉淀，采用交联葡聚糖(Sephadex)LH-20柱(35×650mm)进行凝胶过滤。洗脱液使用90％乙醇。洗脱图如图31所示。也就是说，图31是表示用交联葡聚糖LH-20柱进行凝胶过滤结果的图，图中纵轴表示采用苯酚硫酸法测得的洗脱液中的糖含量(吸光度490nm黑圆圈)，横轴表示流份号(每1流份10ml)。
采用与上述相同的硅胶板对各洗脱流份进行分析。
TLC分析结果检测出的各成分大致分为5组流份号30～35、36～40、41～44、45～48、49～53。每一流份号125μl合并成上述组，用蒸发器干固，溶解于500μl离子交换水，测定对HL-60细胞的增殖抑制活性。
将对HL-60细胞的增殖抑制活性最强的36至40号流份用蒸发器干固，溶解于5ml的1-丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2，用填充有经1-丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2洗涤的硅胶60F254柱(20×710mm)处理。用1-丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2作为洗脱液(1流份＝3ml)。
采用硅胶板对各洗脱流份进行与上述相同的分析。结果，检测出的成分大致分为流份号46～52(第1组)、60～70(第2组)、72～84(第3组)、86～94(第4组)、96～120(第5组)。
用蒸发器将各组干固，分别溶解于5ml离子交换水中，用孔径0.45μm的滤器(IWAKI公司生产)过滤。测定所得各溶液对HL-60细胞的增殖抑制活性。结果，确认第3、4、5组具有增殖抑制活性。
通过TLC分析和质量分析，确认第4、5组的结构为琼脂二糖。
通过质量分析和NMR分析，确认第3组的结构为β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖。图32是β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖的质谱图，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。另外，图33是β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖的1H-NMR光谱图，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号的强度。
判断出β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖与琼脂二糖同样对HL-60细胞具有较强的细胞增殖抑制活性。实施例17(1)如下所述测定实施例3所得来自琼脂的糖类抑制过氧化脂质游离基产生的活性。
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)3A(National CollectionOf Type Culture，NCTC 8319)接种在5ml脑心浸出(Brain heartinfusion)培养基(Difco公司生产，0037-17-8)中，在37℃培养1夜。通过离心分离收集菌体，用磷酸缓冲食盐水洗涤3次后，悬浊于磷酸缓冲食盐水中，使之达到1×107菌落形成单位/ml。将100μl上述菌悬浊液、100μl试样水溶液、100μl的1mg/ml高铁血红蛋白(Sigma公司生产，M9250)水溶液以及600μl磷酸缓冲食盐水和100μl的50mM叔丁基氢过氧化物(片山化学公司生产，03-4990)水溶液混合，在37℃下反应30分钟。加入1ml的2×NMP培养基〔将8g营养肉汤(Difco公司生产，0003-01-6)、5g胰蛋白胨(Difco公司生产，0123-17-3)、5g NaCl、10g甘露醇(Nacalai Tesque公司生产，213-03)、0.035g酚红(Nacalai Tesque公司生产，268-07)溶解于蒸馏水，达到500ml，用NaOH调节为pH7.4后，过滤灭菌得到的物质〕，停止反应，用NMP培养基(用无菌水将2×NMP培养基稀释2倍得到的物质)稀释3倍，共稀释12次，在96孔微孔板的各孔中加入160μl，在37℃下培养1夜。用肉眼观察培养基的颜色，可见菌生长且培养基由红色变为黄色的孔中的试样具有抑制过氧化脂质游离基产生的活性。
其结果如表14所示。在表14中，+表示可见菌生长的孔中的试样，-表示不可见菌生长的孔中的试样。另外，表的最上列所示的浓度为叔丁基氢过氧化物和菌体在37℃下反应30分钟的反应液中的试样浓度。表140.1mM1mM琼脂二糖+ +琼脂四糖- +半乳糖 - -以上结果表明琼脂二糖和琼脂四糖具有较强的抑制过氧化脂质游离基产生的活性。角叉菜二糖和3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同样的活性。
(2)将市售琼脂(伊奈琼脂型S-7，伊奈食品工业公司生产)5g悬浊于50mM枸橼酸45ml中，在93℃下加热155分钟，用NaOH调节为pH6得到的试样(枸橼酸处理产物)，以及悬浮于100mM盐酸45ml中，在95℃加热13分钟，用NaOH调节为pH6的试样(盐酸处理产物)用水稀释1、2、4、8、10、100倍，按照与实施例17-(1)相同的方法测定抑制过氧化脂质游离基产生的活性。其结果，确认枸橼酸处理产物、盐酸处理产物两者均在稀释到10倍之前具有活性，两者具有同等的抑制过氧化脂质游离基产生的活性。实施例18琼脂二糖对刀豆球蛋白(Con A)引起的淋巴细胞胚细胞样转变的抑制作用由ddY小鼠(日本SLC；雄性，7周龄)摘出脾脏，充分粉碎，悬浊在含有10％牛胎儿血清(HyClone)的RPMI-1640培养基(Gibco)中，得到单细胞液。将细胞浮游液接种在塑料陪替氏培养皿中，用二氧化碳培养器在37℃下培养2小时，使粘连性细胞粘附在陪替氏培养皿上，将其除去，以非粘连性细胞作为脾脏淋巴细胞使用。将细胞浓度调整为2×106细胞/ml，以200μl/孔接种在96孔微孔板上，在对照组以外的各孔中添加各种浓度的琼脂二糖。而且，在所有孔中添加5μg的ConA(刀豆球蛋白)，用二氧化碳培养器在37℃下培养1天。培养后在各孔中加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，再培养1天，用液体闪烁计数器测定摄入细胞的量。
其结果如图34所示。也就是说，图34是表示ConA引起的淋巴细胞胚细胞样转变中琼脂二糖浓度和3H-胸腺嘧啶核苷摄入量之间关系的图，横轴表示琼脂二糖浓度，纵轴表示3H-胸腺嘧啶核苷的摄入量(cpm)。白色棒形图表示没有刺激时3H-胸腺嘧啶核苷的摄入量，斜线棒形图表示用ConA刺激时3H-胸腺嘧啶核苷的摄入量。图34说明对于促细胞分裂剂刺激引起的小鼠淋巴细胞增殖，琼脂二糖具有用量依存的抑制作用，100μg/ml几乎可以完全抑制，确认对淋巴细胞的活化具有抑制作用。另外，确认3，6-脱水吡喃半乳糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、角叉菜二糖和3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同样的活性。实施例19琼脂二糖对混合淋巴细胞反应的抑制作用由BALB/c小鼠(日本SLC，雄性，6周龄)以及C57BL/6小鼠(日本SLC，雄性，6周龄)摘出脾脏，按照上述方法得到脾脏淋巴细胞。将各细胞浮游液的浓度调整为2×106细胞/ml，将各100μl混合接种在96孔微孔板上。在对照组以外的各孔中添加各种浓度的琼脂二糖，用二氧化碳培养器在37℃下培养4天。培养后在各孔中加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，再培养1天，用液体闪烁计数器测定摄入细胞的量。
其结果如图35所示。也就是说，图35是表示混合淋巴反应中琼脂二糖浓度和3H-胸腺嘧啶核苷摄入量之间关系的图，横轴表示琼脂二糖浓度，纵轴表示3H-胸腺嘧啶核苷的摄入量(cpm)。白色棒形图表示单独使用来自两种系统的细胞时3H-胸腺嘧啶核苷的摄入量，斜线棒形图表示将来自两种系统的细胞混合时3H-胸腺嘧啶核苷的摄入量。图35说明对于异抗原刺激活化的淋巴细胞，琼脂二糖具有用量依存的抑制作用，10μg/ml几乎可以完全抑制，确认对淋巴细胞的活化具有抑制作用。另外，确认3，6-脱水吡喃半乳糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、角叉菜二糖和3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同样的活性。实施例20(1)将RAW264.7细胞(ATCC TIB 71)悬浊于含有10％牛胎儿血清(Gibco公司生产)、不含酚红、含有2mM L-谷氨酸(TechnologiesOriental公司生产，25030-149)的Dulbecco改进的Eagle培养基(Bio Whittaker公司生产，12-917F)中，使之达到3×105细胞/ml，在48孔微孔板的各孔中加入500μl，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养12小时。在各孔中加入10μl的25μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司生产，L-2012)和10μl的5000、1500、500、150或50μM琼脂二糖或新琼脂二糖(Sigma公司生产，G4410)水溶液，再培养12小时后，测定NO在培养基中氧化生成的NO2-浓度。另外，对照组设定为不加LPS的组和不加琼脂二糖或新琼脂二糖的组。
上述培养后，在100μl的培养基中加入100μl的4％Greece试剂(Sigma公司生产，G4410)，在室温下放置15分钟后，测定490nm处的吸光度。按照上述培养基中溶解的已知浓度的NaNO2制作标准曲线，通过标准曲线计算培养基中的NO2-浓度。测定均进行三次。
其结果，琼脂二糖可以浓度依存的抑制LPS诱导产生NO，而新琼脂二糖则不能抑制。其结果如图36和图37所示。也就是说，图36是表示添加琼脂二糖在各种培养条件下进行培养时培养基中NO2-浓度的图。图37是表示添加新琼脂二糖在各种培养条件下进行培养时培养基中NO2-浓度的图。在图36、图37中，横轴表示培养条件，纵轴表示NO2-浓度(μM)。
用3，6-脱水吡喃半乳糖、角叉菜二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖和3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖代替琼脂二糖，也可以得到同样的结果。
(2)将市售的琼脂(伊那琼脂型S-7，伊那食品工业公司生产)5g悬浊于45ml的0.1N HCl中，在95℃下处理13分钟。冷却到室温后，用NaOH中和，用0.22μm的MILLEX-GP滤器(Milipore公司生产，SLGPR25LS)过滤。对于该试样(琼脂盐酸分解溶液)和实施例11-(1)得到的琼脂分解低聚糖溶液(琼脂枸橼酸分解溶液)，按照实施例20-(1)记载的方法测定NO抑制活性。也就是说，对预先在48孔微孔板培养的RAW264.7细胞，在各孔中加入10μl的25μg/ml LPS和10μl的上述试样的20倍稀释液，进行测定。另外，对照组设定为不加LPS的组、不加上述试样的组以及加入2.5mM枸橼酸的组。另外，测定均进行2次。
其结果，琼脂盐酸分解溶液、琼脂枸橼酸分解溶液均可抑制LPS诱导产生NO。其结果如图38所示。也就是说，图38是表示添加琼脂盐酸分解溶液、琼脂枸橼酸分解溶液进行培养时培养基中NO2-浓度的图。图38中，横轴表示培养条件，纵轴表示NO2-浓度(μM)。
(3)按照与实施例20-(2)同样的方法，使用100mM半乳糖(Nacalai公司生产，编号165-11)、100mM 3，6-脱水-D-半乳糖(Funakoshi公司生产，编号G0002)水溶液，评价抑制NO产生的活性。
其结果，3，6-脱水-D-半乳糖可以抑制NO产生，而半乳糖则不能抑制。其结果如图39所示。也就是说，图39是表示添加3，6-脱水-D-半乳糖、半乳糖进行培养时培养基中NO2-浓度的图。图39中，横轴表示培养条件，纵轴表示NO2-浓度(μM)。
(4)将RAW264.7细胞悬浊于实施例20-(1)记载的Dulbecco改进的Eagle培养基中，使之达到3×105细胞/ml，在48孔微孔板的各孔中加入500μl，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养10小时。然后，添加10μl的5000 mM琼脂二糖水溶液，分别培养1、2、4、6小时。之后，除去培养上清液，在各孔中分别加入新的上述Dulbecco改进的Eagle培养基500μl，添加10μl的2.5μg/ml LPS、800 U/ml干扰素-γ(IFN-γ，Cosmobio公司出售，GZM-MG-IFN)水溶液，培养1小时。之后，除去培养上层清液，在各孔中分别加入新的上述Dulbecco改进的Eagle培养基500μl，再培养16小时后，按照实施例20-(1)记载的方法测定NO在培养基中氧化生成的NO2-浓度。另外，对照组设定为不添加LPS、IFN-γ水溶液的组以及不添加琼脂二糖的组。另外，测定均进行2次。
结果，预先将琼脂二糖添加到细胞中时间长的可以抑制NO产生。也就是说，预先将琼脂二糖添加到细胞培养基中，可以抑制、预防LPS、IFN-γ诱导产生NO。其结果如图40所示。图40是表示在各种培养条件下进行培养时培养基中NO2-浓度的图。图40中横轴表示培养条件，纵轴表示NO2-浓度。另外，确认3，6-脱水吡喃半乳糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、角叉菜二糖和3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同样的活性。实施例21(1)将琼脂粉末(和光纯药公司生产)加入50mM枸橼酸溶液，使终浓度达到3％，95℃下，加热处理160分钟，制成用于抗癌试验的低聚糖溶液。
由日本Charles River公司购入4周龄、雄性裸鼠(SPF/VAF Balb/cAnNCrj-nu)，预喂养1周。向该小鼠皮下移植大肠癌细胞株HCT116(ATCC CCL-247)达到1.5×106细胞/小鼠。
从移植大肠癌细胞株第2周开始，在使用上述用于抗癌试验的低聚糖溶液之前调节为pH6.5，每周5天作为饮水使之自由摄取。每只小鼠平均每天摄取3.5ml。另外，作为饲料，使之自由摄取Oriental酵母公司生产的MF。
在开始给与低聚糖后第4周，摘除低聚糖给药组各小鼠的实体瘤，将其重量与摄取普通饮水的对照组的实体瘤重量进行比较。另外，本试验每组10只小鼠。
结果，确认抗癌试验用试样口服给药组显著抑制癌细胞增殖，来源于琼脂的低聚糖经口服给药显示很强的抗癌作用。
其结果如图41所示。也就是说，图41是表示本发明低聚糖抗癌活性的图，纵轴表示实体瘤重量(g)，横轴表示对照组、低聚糖给药组。
另外，在抗癌试验用试样中和物的口服给药组中，有1例癌症完全消失。
(2)使用实施例11-(1)记载的琼脂低聚糖溶液，进行对欧利希氏腹水癌的抗癌试验。
采用5周龄的雌性ddY系小鼠(体重约25g)，腹腔投给欧利希氏癌细胞(1.2×106细胞/小鼠)，由存活数计算平均存活天数和寿命延长率。
每组8只小鼠，设定对照组、实施例11-(1)记载的琼脂分解低聚糖溶液的3.3倍稀释液摄取组及16.7倍稀释液摄取组，共3组。也就是说，配制实施例11-(1)制备的琼脂分解低聚糖溶液的各种水稀释液，在投给癌细胞3天前作为饮水自由摄取。琼脂分解低聚糖溶液的3.3倍稀释液摄取组每天摄取该稀释液的量是5ml/天/小鼠。琼脂分解低聚糖溶液的16.7倍稀释液摄取组每天摄取该稀释液的量是6ml/天/小鼠。另外，对照组每天摄取水的量是7ml/小鼠。
结果，对照组平均存活天数是11.8天，琼脂分解低聚糖溶液的3.3倍稀释液摄取组，及琼脂分解低聚糖溶液的16.7倍稀释液摄取组的平均存活天数分别是19.8天及14.4天，寿命延长率分别为168％及122％，确认具有显著延长寿命的效果。实施例22在Wistar系大鼠(雄性，5周龄，体重约150g；日本SLC)的腹腔内注射100μg的蛋清白蛋白(OA；Sigma公司)及1ml的明矾(商品名Imject Alum；Piace公司)致敏，14天后由腹腔大动脉采集末梢血，其血清作为抗OA抗体。
在Wistar系大鼠(雄性，7周龄，体重约为200g；日本SLC)的剃毛背部皮下投给抗OA抗体100μl，被动致敏。在致敏48小时后，在每组4只大鼠的腹腔投给实施例11-(1)记载的琼脂分解低聚糖溶液或其10倍的水稀释溶液2ml。对照组的大鼠腹腔给予水2ml。
在给药30分钟后，由尾静脉注射含有0.1％OA、0.5％伊文思蓝(Nacalai Tesque)的生理盐水1ml，引起PCA。在抗原诱发30分钟后，断头、放血处死大鼠，切除背部漏出色素的部位，回收。
将回收的皮肤浸泡在1ml的1N KCl(Nacalai Tesque)中，放置1夜后，加入含有0.6N H3PO4(Merck公司)的丙酮溶液(Nacalai Tesque)9ml，提取色素，用ELISA阅读器测定620nm处的吸光度。由伊文思蓝的标准曲线求出皮肤的色素漏出量。
结果如图42所示。也就是说，图42是表示本发明低聚糖PCA抑制的图，图中纵轴表示色素漏出量(μg/部位)，横轴表示使用的琼脂分解低聚糖溶液。
如图所示，通过给与琼脂分解低聚糖溶液，PCA引起的色素漏出被抑制到一半以下，与对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
另外，确认3，6-脱水吡喃半乳糖、琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、角叉菜二糖及3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖具有相同的效果。实施例23向6孔板中分别注入悬浊在含有10％FBS的RPMI-1640中的小鼠黑素瘤细胞B16BL6，使之达到5×104细胞/孔/2ml培养基，37℃下培养。第2天，加入100μl的琼脂二糖溶液(2mg/ml～0.2mg/ml)，第7天更换培养基，同时加入100μl的琼脂二糖溶液(2mg/ml～0.2mg/ml)。第8天，回收细胞，分解处理DNA、RNA、蛋白质后，测定400nm处的吸光度，检测抑制黑色素产生的作用。
也就是说，抽滤除去培养基后，每孔添加溶解在20mM EDTA溶液中的0.25％胰蛋白酶0.3ml，37℃下培养10分钟。接着，添加2ml新的培养基，悬浊细胞，回收到试管中。接着，离心除去培养基后，用2ml的PBS悬浊细胞，再次离心分离。除去上层清液后，向细胞中加入30μl含有5mM氯化锰的50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)和1μl的70000U/ml DNaseI(宝酒造公司生产)，充分混合后，37℃下培养2小时，分解DNA。接着加入10mg/ml的核糖核酸酶A(Sigma公司生产)1μl，50℃下培养1小时，分解RNA。最后，加入含有100μg/ml蛋白酶K(Sigma公司生产)、0.1％三硝基甲苯X和10mM EDTA的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)，使之达到相对于细胞数2×106液体总量为200μl，37℃下培养16小时后，测定400nm处的吸光度。
结果如表15所示。如表15所示，确认琼脂二糖在50、100μg/ml的浓度下具有抑制黑色素产生的活性，琼脂二糖具有美白效果。另外，确认琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、角叉菜二糖及3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖具有相同的效果。
表15琼脂二糖 400nm吸光度μg/ml平均 ±SD100 0.383 ± 0.007500.392 ± 0.172100.521 ± 0.256对照 0.487 ± 0.038注)测定进行3次，对照组添加培养基100μl。综上所述，本发明可以提供作为细胞凋亡诱发剂、抗癌剂、活性氧产生抑制剂、过氧化脂质游离基产生抑制剂、NO产生抑制剂等抗氧化剂、免疫调节剂的有效成分有用的，选自3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体及它们的2-O-甲基化衍生物的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物，例如含有该化合物的物质在pH低于7的酸性条件下通过酸分解和/或酶分解生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、角叉菜二糖、3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等功能性物质。
这些物质作为细胞凋亡诱发用药品、抗癌用药品、抑制活性氧产生用药品、抑制NO产生用药品等抗氧化用药品、免疫调节用药品、抗过敏反应用药品的有效成分是有用的，另外，含有、添加和/或稀释有选自这些的糖化合物的食品或饮料作为具有细胞凋亡诱发作用、抗癌作用、抑制活性氧产生的作用、抑制NO产生的作用等抗氧化作用、免疫调节作用、抗过敏反应作用的功能性食品或饮料是有用的，可以提供诱发癌症患者及病毒性疾病患者的病变细胞凋亡，对这些疾病的预防、症状改善有效的食品或饮料。特别是大肠癌、胃癌等消化系统癌症的场合，本发明的上述化合物作为食品、饮料经口服摄取，能够引起癌细胞凋亡，所以本发明的食品或饮料对消化系统癌症的预防、症状改善具有优良效果。另外，由于其具有抑制活性氧产生的作用等抗氧化作用，所以上述食品或饮料作为抗氧化应激反应用食品或饮料也具有优良效果。
另外，本发明的功能性物质作为用于抑制活性氧产生的抗氧化用糖是有用的，含有、稀释和/或添加有本发明抗氧化用糖的食品或饮料作为用于改善由活性氧等生物体内氧化物质引起的疾病症状的食品或饮料是有用的。另外，本发明的食品或饮料通过其有效成分——选自3，6-脱水吡喃半乳糖或其醛异构体或它们的2-O-甲基化衍生物的化合物和/或含有该化合物的可溶性糖化合物的作用，具有改善或预防便秘的效果。
本发明提供的抗氧化用糖作为赋予食品或饮料抑制活性氧产生作用等抗氧化性的新功能性糖化合物是有用的。
另外，本发明的功能性物质具有保鲜效果，对食品、新鲜物品的味道及鲜度的保持极为有效。
此外，含有本发明糖化合物的化妆品作为用于美白、保湿的化妆品有效。
本发明还提供含有、稀释和/或添加有该功能性物质的酸性食品或酸性饮料，在该食品或饮料的制备方法中，实质上除去对该功能性物质的含量有影响的因素，就能够得到有效性非常高、功能性物质含量高的食品或饮料。另外，在有机酸存在下制备的酸味剂作为在味道、功能性方面优良的新型酸味剂也很有用。
权利要求
1.用于治疗或预防对下述化合物具有敏感性疾病的药物组合物，它含有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物的化合物以及还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分。式1
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中，糖化合物是含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质在pH低于7的酸性条件下得到的酸分解产物和/或酶分解产物。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中，含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质，是选自琼脂、琼脂糖和角叉菜胶中的至少1种物质。
4.如权利要求1～3中任意-项所述的药物组合物，其中，糖化合物是选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物。
5.如权利要求1～6中任意一项所述的药物组合物，其中所说的疾病，是需要诱发细胞凋亡的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧产生的疾病、需要抑制一氧化氮产生的疾病或需要进行免疫调节的疾病。
6.用于改善对下述化合物敏感的疾病症状的食品或饮料，或用于预防该疾病的食品或饮料，其中所说的食品或饮料含有、添加和/或稀释有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物。
7.如权利要求6所述的食品或饮料，其中，糖化合物是含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质在pH低于7的酸性条件下得到的酸分解产物和/或酶分解产物。
8.如权利要求7所述的食品或饮料，其中，含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质，是选自琼脂、琼脂糖和角叉菜胶中的至少1种物质。
9.如权利要求6～8中任意一项所述的食品或饮料，其中，糖化合物是选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物。
10.如权利要求6～9中任意一项所述的食品或饮料，其中所说的疾病是需要诱发细胞凋亡的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧产生的疾病、需要抑制一氧化氮产生的疾病或需要进行免疫调节的疾病。
11.一种抗氧化剂，其特征在于，该抗氧化剂含有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分。
12.如权利要求11所述的抗氧化剂，其中，糖化合物是含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质在pH低于7的酸性条件下得到的酸分解产物和/或酶分解产物。
13.如权利要求12所述的抗氧化剂，其中，含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质，是选自琼脂、琼脂糖和角叉菜胶中的至少1种物质。
14.如权利要求11～13中任意一项所述的抗氧化剂，其中，糖化合物是选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物。
15.如权利要求11～14中任意一项所述的抗氧化剂，其中所说的抗氧化剂是活性氧产生抑制剂。
16.一种食品或饮料，其特征在于，该食品或饮料含有权利要求11～15任意一项所述的抗氧化剂。
17.一种抗氧化用糖，从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中选择的化合物和含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的。
18.如权利要求17所述的抗氧化用糖，它是选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物。
19.如权利要求17或18所述的抗氧化用糖，是用于抑制活性氧产生的糖。
20.一种保鲜剂，其特征在于，该保鲜剂含有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物和含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分。
21.如权利要求20所述的保鲜剂，其中，糖化合物是含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质在pH低于7的酸性条件下得到的酸分解产物和/或酶分解产物。
22.如权利要求21所述的保鲜剂，其中，含有选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的至少1种化合物的物质，是选自琼脂、琼脂糖和角叉菜胶中的至少1种物质。
23.如权利要求20～22中任意一项所述的保鲜剂，其中所说的糖化合物是选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物。
24.一种化妆品，其特征在于，该化妆品是以选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物作为有效成分。
25.一种酸性食品或酸性饮料，其特征在于，该酸性食品或酸性饮料由含有、添加和/或稀释有从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物构成的。
26.如权利要求25所述的酸性食品或酸性饮料，其中，糖化合物是选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物。
27.下列化合物在制备用于诱发细胞凋亡、抗癌、抑制活性氧产生、抑制过氧化脂质游离基产生、抑制NO产生或免疫调节的药物组合物中的用途，该化合物是从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物。
28.下列化合物在制备用于诱发细胞凋亡、抗癌、抑制活性氧产生、抑制过氧化脂质游离基产生、NO产生抑制剂或免疫调节的饮食品中的用途，该化合物是从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物。
29.下列化合物在制备抗氧化剂或保鲜剂中的用途，该化合物是从选自式1所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种的化合物。
30.下列化合物在制备化妆品中的用途，该化合物是选自琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1种糖化合物。
全文摘要
本发明提供用于治疗、改善或预防对下述化合物具有敏感性疾病的药物组合物、饮食品、化妆品等,它们含有从选自式1所示3,6－脱水吡喃半乳糖、其醛异构体、其水合物及它们的2－O－甲基化衍生物的化合物以及还原末端具有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少1种化合物作为有效成分。该化合物具有诱发细胞凋亡、抗癌、抑制活性氧产生、抑制过氧化脂质游离基产生、抑制NO产生等活性,作为抗氧化剂、保鲜剂的有效成分也是有用的。
文档编号C07G99/00GK1285838SQ98813026
公开日2001年2月28日 申请日期1998年11月11日 优先权日1997年11月11日
发明者榎龙嗣, 佐川裕章, 冨永隆生, 西山英治, 小山信人, 酒井武, 于福功, 猪饲胜重, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社