丝裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位点、经修饰的蛋白和用途的制作方法

专利名称：：丝裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位点、经修饰的蛋白和用途的制作方法丝裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位点、经修饰的蛋白和用途发明领域本发明涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的新磷酸化位点、在所述磷酸化位点修饰的MAPKs及其用途。发明背景^袭j活必蛋冷激爽fM4尸。术语MAPK包括三种激酶级联ERK、JNK和p38及其各自的亚型[PearsonG,，etal"2001,"Mitogen-activatedprotein(MAP)kinasepathways:RegulationandPhysiologicalFunctions(丝裂原活化蛋白(MAP)激酶路径调节和生物学功能)"，EndocrineReviews22(2):153-183]。这些激酶介导的细胞效应有多种并且覆盖细胞的整个生命周期生长、分裂、分化、能动性、渗透反应、应激反应、炎症、癌等。对特定细胞外刺激的4企测被传递至第一激酶，其称为MAPKKK，其标靶为另一激酶MAPKK的丝氨酸和苏氨酸。该磷酸化通过对有限的T-Xaa-Y三联体或三氨基酸基序(其中T是苏氨酸、Y是酪氨酸并且Xaa是氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或脯氨酸的残基)中的丝氨酸和苏氨酸残基进行磷酸化而决定MAPKK的活化，所述有限的T-Xaa-Y三联体或三氨基酸基序称为活化区段，携带该三组件级联的最终标靶。MAPK是负责在丝氨酸和苏氨酸上磷酸化数种底物如转录因子、其它激酶、结构元件等的效应物激酶。，蛋白p38MAPK，或p38,是属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族的酶，并且其在对外部应激信号例如紫外光、渗透性休克、热等的细胞响应中起重要作用。由于此原因，该蛋白还被称为应激活化蛋白激酶或SAPK。p38通过对转录因子、其它激酶进行磷酸化和活化从而控制基因表达来完成其调节作用，并且还通过调节重要信使RNA的稳定性来完成其调节作用。尽管p38亚型中研究最多的并且因此了解最多的是a亚型，用适当的刺激处理后在多种细胞类型中观察到其活化(在造血和非造血组织中)，但存在四种p38亚型，其在不同组织中的分布不同，并且对不同p38抑制剂的敏感性不同。然而，尽管有这些不同，所有的p38亚型具有由12个氨基酸形成的活化结构域，其含有被MKK6/MKK3磷酸化的活化区段Thr-Gly-Tyr，所述MKK6/MKK3是在细胞信号传导级联中p38上游发现的激酶家族的酶。p38是细胞功能必不可少的调节物，其介导细胞因子及其它分子的产生，这些分子是造成炎性过程发展的原因，并参与由细胞应激诱导的不同生理学状态，如在某些心脏病和炎症现象的情况下和在细胞周期控制中。在最近数年中，分析了p38在不同疾病的发展或进化中的作用。已确立了p38活化在心力衰竭的建立和发展中的重要性。在小鼠试验模型中和在高盐食i昝的高血压大鼠模型中已观察到在大动脉缩窄后的持续活化。在人中，p38在受晚期冠心病之后的心力衰竭影响的心脏中活化。p38活化的调节在心脏病的发展中似乎是必不可少的，这是由于数个研究小组已在人和大鼠心肌中的晚期心力衰竭中观察到p38活性的降低。现有技术中还通过使用p38MAPK抑制剂，描述了p38MAPK在不同于心脏病的其它病理状态例如炎症、肺病或神经元疾病中的作用。所有这些病理状态的特征在于其具有活化的p38，即具有磷酸化的Thrl80和Tyrl82残基。另一方面，在来自癌症患者的细胞中观察到化学疗法和放射疗法均产生p38活化，这似乎是造成诱导肿瘤细胞死亡的信号的原因。在治疗以活性p38的存在为特征的不同疾病中最普遍的策略在于药理学抑制其活性或如WO2005/032551、WO2004/021988、EP1534282或CA2497448中所述，与其它治疗剂4关合抑制其活化。G衡G蛋白偶联受体(GPCR)介导在心血管系统或免疫系统功能中起必不可少作用的不同信使的作用。除了与异三聚体G蛋白相互作用之外，活化的GPCRs与G蛋白偶联受体激酶(GRKs)及与称为视紫红质抑制蛋白的调节蛋白相互作用。基于结构相似性，将GRK家族的7个成员(GRKl-7)分为4个亚家族GRK1、GRK2/3、GRK4/5/6和GRK7，其中GRK2/3和GRK5/6在生物体中具有普遍的分布。然而，改变GPCR信号传导和促成这些病理状态的触发和/或进展的机理是未知的。除了允许其它细胞蛋白的募集和调节，开始新的信号传导途径之外，这些蛋白在细胞内功能的快速调节和被配体活化后的受体动力学中起着必不可少的作用，因此它们是GPCR介导的信号传导的必不可少的调节物和成分。在病理状态，例如充血心力衰竭、心脏肥大、高血压或诸如类风湿性关节炎的炎性过程中，数种GRKs的水平和功能被改变。另一方面，SAPKs在心肌病和心力衰竭的发展中的重要作用是已知的，并且还已知选择性GPCR活化促进这些激酶在心肌中的慢性活化，该步骤在心室肥大引起的心力衰竭的发展中是必不可少的。附图的简要说明图1显示GRK2在体外直接磷酸化p38。图1A显示p38被GRK2磷酸化。为了抑制GRK2活性的目的，于30。C下将用杆状病毒体系纯化的重组GRK2(50nM)与50nM的重组p38(GST-p38)在p38磷酸化緩沖液(25mMHepes、pH7.5、10mM乙酸镁、50jhMATP,2000-3000cpm/pmo1[7-32p]ATP)中以40jLd的最终体积，与或不与肝素(50ng/jid)孵育30分钟。在相同的条件下进行激酶自身磷酸化对照。通过加入SDS上样緩冲液终止反应，在8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白，并通过放射自显影法显影。图lB显示GRK2直接磷酸化p38并且不促进其自身磷酸化。如与图1A相关的描述进4亍磷酸化反应。以IC5Q浓度的10倍使用GRK2的抑制剂肝素和p38的抑制剂SB203580化合物，以保证完全抑制相应的激酶，即，对于肝素为1.5/xM以及对于SB203580为0.5gM。所用的底物对于p38为MBP(每点14pg)，以及酪蛋白(每点7.5jLig)。通过加入SDS上样緩冲液终止反应，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白，并通过放射自显影法检测。图lC显示GRK2不在p38的活化区段中磷酸化p38。在上述条件下，但不存在放射性ATP的条件下开始磷酸化反应。使用40ng的MKK6cAM(MKK6/MKK3,Upstate)在体外磷酸化GST-p38。电泳分离后用于检测的抗体在较大蛋白的情况下识别GRK2和GST-p38(抗-PF2抗体，在本发明人的实验室中制得的多克隆血清，其含有抗GST-PF2融合蛋白的抗体，其中PF2是GRK2的C末端片段)。用于检测p38活化状态的T180/Y182磷特异性抗体是Ce11Signaling的。图1D显示GRK2磷酸化p38的时间依赖性。如前述在相同的条件进行磷酸化，除了孵育时间，如所指明的，其为0至90分钟。用箭头表示两种蛋白(GRK279.6kDa;GST-p3868kDa)的迁移率。通过Cerenkov对切出的凝胶带进行定量后得到的数据示于右側。图1E显示磷酸化动力学参数。考虑到D部分的数据，15分钟的反应被认为是在初始速度条件下测定磷酸化动力学常数的时间长度。如已描述地进行磷酸化反应，保持GRK2浓度固定(25nM)并改变p38浓度，从12.5nM至400nM。通过加入SDS上样緩冲液终止反应，在8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白，通过》文射自显影法才全测并通过Cerenkov定量。该图是用Kaleidagraph程序制作的，其提供能够导出下列动力学参数的算法Michaelis國Menten常数(Km-79.56nM)和最大速度(Smax=每mgGRK2每分钟掺入0.9nmolP043-)。图2显示GRK2和p38依赖性地与j82-肾上腺素能(仏-AR)受体刺激相关。图2A:用pCDNA3國GRK2、pBC12BI-i82-AR和pCDNA3誦Flag誦p38a(lpg每种DNA每p60)载体瞬时转染HEK293细胞。转染后48小时后并在血清饥饿2小时后，用肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素(ISO，10juM)刺激细胞5分钟或10分钟，或者不进行刺激(O分钟ISO)。同样地，用0.5MNaCl刺激不具有过表达的/VAR受体的细胞15分钟。将细胞溶于适于用结合于琼脂糖的M2抗Flag抗体进行免疫沉淀的緩冲液中，并且在取等份的这些溶解产物(10%)用于过度表达对照(溶解产物图)之后，将这些免疫复合物在4。C孵育过夜。将免疫沉淀的蛋白(Ip抗Flag)重新悬浮在电泳裂解緩沖液(breakingbuffer)中并且将结合蛋白在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离。电转移之后，用抗p38以及用抗GRK2的抗体抗PFZ来检测蛋白(分别为上图和下图)。该图中还包括了没有Flag-p38a的存在下以及不用IOpM的异丙肾上腺素刺激时的阴性免疫沉淀对照(Cneg)。在溶解产物图中，通过抗磷酸化p38抗体检测GRK2(上图)以及p^活化状态(下图)(参见表l)。图2B:在与2八中所述相同的方法中，用抗GRK2的抗体抗PF2免疫沉淀过表达的蛋白，并且在每一刺激点(接触异丙肾上腺素后0分钟和5分钟，左上图)用抗p38检测后者的共免疫沉淀。Flag-p38表达对照(上图)和GRK2表达对照(下图)以及总免疫沉淀GRK2(左下图)显示于相邻的图中。在接触10/iM异丙肾上腺素后刺激5分钟，再次检测两种蛋白之间的结合。图2C:此时，只将编码/VAR和Flag-p38ce的载体引入HEK293细胞中以确保内源GRK2以低于p38的总量共免疫沉淀(0.5/ig的DNA)。用10MM异丙肾上腺素处理后5分钟产生Flag-p38a与GRK2之间的最大结合(参见左上图和左下图)。右图证实了细胞溶解产物中的GRK2表达(上图，抗PF2)和p38表达(下图，抗p38)。图2D:在与A部分所述相同的实验中，检测了失去催化活性的GRK2-K220R突变体与Flag-p38共免疫沉淀的能力。上部分两张图别显示两个GRK2亚型的共免疫沉淀和总免疫沉淀的p38。两张溶解产物图显示在每一点GRK2和GRKLKM0R的过表达(上图，抗PF2)以及Flag-p38活化状态(下图，抗磷酸化p38)。如A中所述，进行M2抗-Flag-琼脂糖抗体的非特异性免疫沉淀对照(Cneg)。图3显示GRK2如何能够通过MKK6cAM降低p38活化。图3A:用pCDNA3-Flag-p38a、pCDNA3-MKK6CAM以及增加量的pCDNA3-GRK2载体瞬时转染通常接种于具有6孔或12孔的多孔4反(M6或M12)中的HEK293细胞。在此实验中，使用M6板并且引入的DNA量为100ng的Flag-p38、100ng的MKK6cAM和0至lgg的GRK2。在所有的点，用pCEFL-EGFP来补足DNA总量，并且在对照组(CTRL)的情况下用空pCDNA3代替pCDNA3-MKK6cAM。48小时后，通过将细胞溶解于M2緩沖液中而收集细月包。上图显示过表达的GRK2剂量。用CellSignaling的抗磷酸化p38评价p38活化状态，并且在放出首次免疫检测的抗体之后，用同一公司的总抗p38对其进行检测。注意显示了轻微曝光的放射自显影以避免显影的^f氐分辩率饱和。图3b:用pCDNA3-GRK2稳定转养被Flag-p38和MKK6cAM转染。以与A中相同的方式测定Flag-p38活化状态。此外，用UpstateBiotechnology的抗MKK6/SKK3抗体确认MKK6cAM的正确表达。在图4中，实验显示GRK2降低p38的催化活性。图4a:用0.5的pCDNA3-Flag-p38a、0.5/Ag的pCDNA3-MKK6cAM(或在对照组CTRL中为0.5/xg的空pCDNA3)以及用1pg或2gg的pCDNA3-GRK2(+)载体对接种于p60中的HEK293细胞进行瞬时转染，每一点重复两次。以平行的方式进4亍对照，用pCEFL-EGFP(-)代替pCDNA3-GRK2。用空pCDNA3补足DNA总量。48小时后，将细胞溶解，取等份的溶解产物并从中免疫沉淀Flag-p38。A中的图显示GRK2(抗PF2)和MKK6cam(抗MKK6)的过表达以及Flag-p38(抗磷酸化p38)活化。图4b:将免疫沉淀物用15ml的M2緩冲液洗涤三次并用15ml的不含ATP的磷酸化緩冲液(15mMNaF、25mMHepespH7.5和10mM乙酸镁)洗涤两次。在最后的洗涤步骤中，将琼脂糖免疫复合物重新悬浮在lml的緩冲液中，并且分离每一点的10。/。以对照Flag-p38的免疫沉淀(B部分图中的插图)。用免疫沉淀的Flag-p38进行激酶测定，使用APRTPGGRR肽(最初由CalbioChem提供，然后由CBMSO的ServiciodeQuimicadeProtdnas〈蛋冷^化夢應J^合成)作为底物。在由25mMHepespH7.5;10mM乙酸镁、15mMNaF、50/*MXtP和500國1000cpm/pmol[y32p]atp和2mM的肽底物形成的磷酸化緩冲液中以25/xl的最终浓度进行该反应。当指出(+SB)时，以0.5jiiM的最终浓度向体外反应中加入SB203580。使磷酸化在30。C进行30分钟，然后通过加入15jiil的30。/。TCA使其终止。通过离心(25000xg，15分钟，4。C)使蛋白沉淀，并且从每一反应中回收含有石岸酸化的肽的上清液。将正方形(1cmx1cm)WhatmanP81纸切片用肽溶液浸渍。将其B京干，用75mM磷酸充分洗涤，并且通过Cerenkov对掺入被吸附的肽的放射性进行定量。活性水平被定义为在不存在MKK6CAM时(CTRL)Flag-38对肽底物的磷酸化。图5显示GRK2水平的降低允许在原位MKK6cAM对p38的更高的活化。图5A:用150ng的pCDNA3-Flag-p38a、50ng的pCDNA3國MKK6cAM以及用增加量的pCEFL-GRK2反义(AS)载体0.5/ig至2/xg或等量的pCEFL-EGFP作为对照(C)对接种于M6板中的HEK293细胞进行瞬时转染。在所有的点，用空pCEFL载体补足DNA总量。将细胞溶解并且在每一点对GRK2总量(上图，抗PF2)、p38活化(中图，抗磷酸化p38)和总p38(下图，抗p38N)进行免疫检测。图中显示了来自代表性实验的2/xg(对于GFP和反义)点的数据。在两种条件下每一种中p38活化水平均指其各自的不存在MKK6cAM时的对照。图5B:基础p38活化被GRK2的量调节。用100ng的pCDNA3-Flag-p38a以及用0.5jng至2/xg的pCEFL-GRK2反义或pCEFL-EGFP对HEK293细胞的M6板进行瞬时转染。用pCEFL补足每一点的DNA总量。在这些条件下通过电转移和免疫检测评价GRK2的总量(抗PF2，上图)、p38活化状态(中图，抗磷酸化p38，在化学发光显影中过度曝光的放射自显影)和总p38(下图，抗p38)。来自三次独立研究的数据的平均值(土SEM)—式两份显示于图的下部。应用fpO.005的双边学生t检验统计来确定显著性。图6显示仅带有其整体结构决定子的p38为GRK2的底物。图6A:从用质粒pGEX2T-p38a、pGEX4T-Mxi2和pGEX4T画Mxi2A17:p38a、Mxi2和Mxi2A17转化的细菌中纯化与GST(蛋白示意图中的黑色矩形)融合的蛋白。Mxil亚型被用作C-末端截短的突变体，以试图限制GRK2磷酸化位点。将重组GRK2(200nM)与0.5/ig的每一融合蛋白在磷酸化緩冲液(25mMHepespH7.5，10mM乙酸镁，50/xMATP，2000-3000cpm/pmo1[7-32p]ATP)中在30。C孵育30分钟。还包括肝素(150nM)作为特异性GRK2抑制剂。通过加入SDS裂解緩冲液终止反应。将样品在8%SDS-PAGE上分离。为了确保包含相同量的蛋白，首先通过考马斯亮蓝(CBB)染色在凝胶中对其进行观察。然后将凝胶干燥并检测掺入蛋白的》文射性(32p)。图6B:通过InvitrogenGateway系统产生对应于p38a的最后80个氨基酸的截短的GST-280-360p38蛋白。在与A部分中所述相同的条件下，使用Mxi2A17作为p38N-末端、280-360p38作为C-末端以及使用完整p38a进行磷酸化测定。通过放射自显影("P)检测磷酸化，并且通过使用抗GST抗体的Western印迹，同时进行对测定中所用蛋白的量的对照的检测。清楚观察到未磷酸化的GST-280-360p38蛋白的存在。STD，标准分子量蛋白的迁移率。图7显示GRK2使p38在单个残基上磷酸化p38。图7A:在二维电泳中分析GRK2对p38的磷酸化并且该反应在与前述相同的条件下进行。通过加入等电聚焦上样緩冲液而终止反应。第一电泳维度具有pH3至pHIO的两性电解质梯度。通过8%聚丙烯酰胺凝胶分离第二维度。用箭头表示两种蛋白(GRK2，79.6kDa;GST-p38,68kDa)的迁移率。图7B:在凝胶中分离来自非放射性磷酸化测定的样品，旨在进行蛋白质组序列分析。将凝胶染色以观察条带，并且将与GST-p38对应的条带从凝胶上切出并进行胰蛋白酶消化。通过MALDI-TOF分析得到的肽。显示了所得质i普的区域的放大，其中检测到磷酸化的肽(质量对应于1,945.330)，其只存在于#皮GRK2磷酸化的样品中。图8显示GRK2在单个残基上磷酸化p38。利用MALDI-TOF(BrokerAutoflex型号)中得到的数据，鉴定了进行磷酸化的候选者，胰蛋白酶肽LTDDHVQFLIYQILR。为了证实这些迹象，用HPLC-ESI國IT(Thermo-FinniganDeca-XP型号)分离样品，该仪器以SIM(单离子监测)模式工作，使得分析器仅片段化候选肽。为可识别的肽质量分配系列(根据片段化的行为称为bn或y，，n)。与Ab8系列(橙色盘中)对应的质量表明在得自磷酸化样品的下方谱带中观察到存在于被分析肽中的苏氨酸上的磷酸化。同样地，在两种情况下均确定了肽的总质量(黄色椭圆内部)。该图右侧插入的缩孩史窗口显示了来自磷酸化的样品和对照样品中的相同的肽在HPLC柱中的差异洗脱的信息。考虑到其更大的亲水性，磷酸化的肽被洗脱的时间要早几十秒。图9显示p38T123A和T123D突变体在体外未被GRK2磷酸化。图9A:与GST融合的p38T123A和p38T123D蛋白在原核表达质粒pGEX2T中通过定点诱变制备。测定了在图中所表明的最终浓度下与野生型GST-p38WT蛋白相比，重组GST-p38T123A和GST-p38T123D蛋白作为GRK2底物的能力。上图代表得到的磷酸化("P)，并且下图通过抗p38NWB显示测定中所用的重组蛋白的量。图9B:p38a的代表性示意图，其中突出显示了功能特征，例如激酶结构域延伸、TGY活化区段和推测被GRK2调节的LTDD序列中相同的位置。还突出显示了最初涉及调节底物和活化剂结合的CD基序。图10显示苏氨酸123是高度保守的残基，位于用于p38活化剂和底物的对接槽的外表面。显示的多序列比对由Dr.Perdiguero通过ClustalX程序(http:〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)完成。虚线引入用于调整比对的空位(gap)。用红色写在黄色背景上来突出显示所有亚型中相同的残基，蓝色和绿色背景分别表示排列的蛋白之间根据大或小分布的保守置换。非保守的氨基酸留在白色背景上。在每一多序列比对的底部表明共有序列，并且通过红色椭圆，突出显示了苏氨酸123区域，还在下部的序列比较中用箭头指出。图ll显示p38T123D突变体在体外没有被MKK6cAM活化，并缺乏对ATF2的激酶活性。图11A:用融合蛋白GST-p38WT、GST-p38T123A和GST-p38T123D(150nM)作为重組MKK6cam(40ng)的磷酸化底物(UpstateBiotechnology),在体外进行磷酸化测定(25mMHepespH7.5;10mM乙酸4美，15mMNaF，ATP50^M和1000-2000cpm/pmo1[7-32P]ATP)。在30。C进行反应30分钟，并且在8。/。SDS-PAGE凝胶中分离蛋白。通过考马斯蓝染色在观察每一点的p38的量。然后测定每一p38亚型中的放射性。放射自显影("P)显示三个独立测定的代表性实验，每一实验重复两次。图11B:在这些相同的测定中，评价了MKK6cAM活化的GST-p38WT、GST-p38T123A和GST-p38T123D磷酸化2/xg的GST-ATF2的能力。附上总GST-ATF2对照(考马斯蓝)的代表性放射自显影(3卞)。图12显示p38苏氨酸123对于其在MEF2A底物上的正确催化活性是必需的。图12A:用图中所示的融合蛋白在存在(+)或不存在(-)重组MKK6CAM(40ng)和2pg的GST-MEF2A时进行体外磷酸化。测定进行30分钟。将蛋白在8。/。SDS-PAGE中分离，用CBB染色，并检测掺入的放射性("P)。提供了独立进行的三个测定的代表性实验的图。图12B:在前述条件下评价了没有MKK6cAM活化剂的存在下三种p38融合蛋白的基线活性。显示了长时间曝光后的代表性放射自显影。图13显示p38T123D突变体与野生型p38相比4交少地孚皮MKK6cam原位活化。在与前述类似的过表达实验中，用150ng的pCDNA3-Flag-p38aWT或pCDNA3-Flag-p38aT123D和50ng的pCDNA3-MKK6CAM(或空pCDNA3)转染接种在M6中的HEK293细胞，并总是重复两次。评价了p38被抗磷酸化p38抗体的活化。对于两种亚型的每一种，通过MKK6CAM的活化均相对于基线条件，得到特定的活化水平。在每一实验中，100%活化被建立为p38aWT活化。显示了三次独立实验的数据(士SEM)。进行双边学生t检验，得到*p<0.0001。右图(Western印迹法)例示了这些实-睑之一。图14显示p38T123D突变体不与底物结合，并且其不与MKK6结合，也不被MKK6磷酸化。在结合洗脱测定(pulldownassay)中用GST作为阴性对照，将纯化的GST-p38及其T123突变体(300nM)在纯化的MKK6(3nM)或His标记的MAPKAPK2(MK2，20nM)的存在下孵育。通过Western印迹法使用抗MKK6、抗组氨酸(对于His-MK2)或抗GST(对于GST-p38s总量)抗体使沉淀的蛋白显影。在所有图中，结果是三个重复两次的独立实验的代表。图15显示GRK2如何降低结締组织细胞向脂肪细胞的p38依赖性分化。制备了被pCDNA3-GRK2和pCDNA3-GRK2K220R稳定转染的3T3L1系。包括了在细胞系中得到的与3T3L1水平相比的GRK2(抗GRK2)表达对照。将细胞进行标准分化处理，并且在处理后第15天将细胞用福尔马林固定并用油红染色，油红为亲脂性染料，其与脂肪细胞积蓄的脂肪结合。在显微镜下对总共25个视野中具有脂肪细胞表型的细胞(红色)进行计数。以两个重复显示两个独立实验的代表性照片。还包括了分化过程中不受胰岛素刺激的(对照)3T3L1细胞的照片。本图反映了这些实验中的脂肪细胞计数(士SEM)。对于每一稳定系进行关于3T3L1细胞的双边学生t4企验并得到*p<0.0001。通过用10/iM的SB203580的药理学处理而平行进行p38依赖性对照。图16代表抗磷酸化Thrl23抗体对从培养物中的人细胞免疫沉淀的p38的识别以及p38被GRK2体外磷酸化。图16A:用小鼠Flag-p38a和GRK2或其无活性突变体(GRK2-K220R)的表达载体转染HEK293细胞。在细胞溶解之前将细胞在没有血清的条件下培养16小时。通过抗flag(M2)抗体将Flag-p38进行免疫沉淀(IPP)并且在电泳和转移之后，通过Western印迹法(WB)用在亲和柱中纯化的特异性抗体(P-p38-T123，稀释l:200)检测在Thrl23磷酸化的蛋白。用总抗p38(p38)将同一张膜进行显影，并且用抗GRK2436-689(GRK2)显影对应于包含在免疫沉淀之前的细胞提取物(溶解产物)中的蛋白的另一张膜。图16B:将SGST-p38(50nM)单独地、与纯化的GRK2(150nM)—起或与40ng的组成型活化的MKK6cAM—起在磷酸化缓沖液中在非放射性标记的ATP的存在下于30。C孵育30分钟。上图用抗磷酸化形式的p38的Thrl23的多克隆抗体显影。中图用p38的Thrl80/Tyr182残基的磷酸特异性抗体(抗Pp38)孵育，并且在下方显影中使用抗总p38的抗体。图17显示抗磷酸化抗体识别被GRK2在苏氨酸123处磷酸化的p38，这是因为p38的T123A突变体的在该条件下不被识别。将GST-p38wt和GST-p38T123A(70nM)分别与纯化的GRK2(25nM)或与重组MKK6CAM(2ng)孵育；当特别指明时，加入特异性GRK2抑制剂肝素(IOOng尔l)。通过Western印迹用抗磷酸化T123分析GSTp38蛋白的磷酸化，并用抗GST分析总GST-p38。数据为3次独立实验的代表。图18显示响应从GRK2部分缺乏的小鼠中提取的巨噬细胞的脂多糖的p38活化水平和TNF分泌水平。腹膜小噬细胞来自野生型C57BL/6(+/+)或GRK2半合子(+/-)小鼠。将其置于无刺激下2小时后，向培养基中加入细菌脂多糖(LPS:0.5ng/ml),保持16小时。通过可商购的ELISA试剂盒(AmershamBiotrak)对炎性细胞因子(TNFce)的产生进行定量。为了确认该过程对p38的依赖，在加入LPS之前使用SB203580(30pM)30分钟。显示了4个独立实验中处理的IO只小鼠的平均值土SD。数据对应于来自M24的每孔106个细胞的TNFa分泌。*p<0.005(根据学生t检验)。发明的详细描述一方面，本发明涉及MAPK蛋白，在本说明书中有时称为"本发明的MAPK蛋白"，其选自a)在磷酸化位点中包含磷酸化的残基的MAPK蛋白，所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，或者所述MAPK蛋白是包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段，其中-所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的123位的苏氨酸残基(Thrl23)，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对来定义，并且-在所述不同磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化及其对其底物的活性；以及b)在磷酸化位点中或所述磷酸化位点的周围区域包含负电荷或大残基的MAPK蛋白，所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，或者所述MAPK蛋白是包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段，其中-所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的123位的苏氨酸残基(Thrl23)，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对来定义，并且-向所述磷酸化位点或所述磷酸化位点的周围区域引入负电荷或大残基防止所述MAPK蛋白的活化及其对其底物的活性。本文所用的术语"位置等同"是指MAPK蛋白的氨基酸的位置，其通过MAPK蛋白的氨基酸序列的多序列比对，对应于小鼠p38、a亚型的Thrl23。术语"MAPK蛋白"包括任何物种的ERK、JNK和p38蛋白激酶，以及其各自的亚型。关于所述激酶及其功能以及其细胞效应的信息能够在Pearson等人的综述中找到[PearsonG.，etal.，2001,"Mitogen-activatedprotein(MAP)kinasepathways:RegulationandPhysiologicalFunctions(丝裂原活化蛋白(MAP)激酶调节和生理学功能)"，EndocrineReviews22(2):153-183]。关于所述MAPK蛋白的氨基酸序列的信息能够在本领域技术人员已知的适当的数据库中找到(如Swissprot、NCBI等)。MAPK激酶在不同物种中广泛分布，并且其一级结构在不同家族的不同成员(ERK、JNK和p38)中是广泛保守的。MAPK蛋白的特征之一是存在包含至少一个易于被适当的激酶磷酸化的残基的活化区段。在具体实施方案中，所述活化区段包含通式(I)的氨基酸三联体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中Thr是苏氨酸，Tyr是酪氨酸，并且Xaa是氨基酸残基。在具体实施方案中，Xaa是选自天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸的氨基酸的残基。在哺乳动物p38、a亚型的具体情况下，所述活化区段在其氨基酸序列的180-182位置包含通式(I)的氨基酸三联体。在另一具体实施方案中，所述活化区段包含式(II)的氨基酸三联体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中Ser是丝氨酸，Glu是谷氨酸，并且Gly甘氨酸。在本发明的实施方案中，本发明的MAPK蛋白选自ERK、JNK和p38激酶。以例示的方式，在具体实施方案中，本发明的所述MAPK蛋白是p38。p38激酶在不同的物种中广泛分布并且其一级结构是广泛保守的(图10)。在具体实施方案中，所述p38是以其任何亚型(a、/3、7或S)存在的哺乳动物p38，例如人、啮齿动物等的p38。在特定实施方案中，所述p38是小鼠p38的Q!亚型(小家鼠(Mwm^sci//1^)),其氨基酸序列示于SEQIDNO:1(GenBank，登记号P478U)。本发明人惊讶地发现，MAPK蛋白在易于磷酸化的位点的磷酸化能够抑制所述MAPK蛋白的活化，所述易于磷酸化的位点不同于所述MAPK蛋白的活化区段中存在的一个或多个磷酸化位点，已知所述活化是通过对所述活化区段中，例如尤其是在上文所提到的所述氨基酸三联体中存在的易于磷酸化的残基(如苏氨酸或酪氨酸)进行磷酸化而发生的。事实上，本发明人进行的研究已清楚地显示小鼠p38、a亚型的123位的苏氨酸残基(Thrl23)的磷酸化防止在所述p38的活化区段中存在的通式(I)氨基酸三联体中的180和182位分别存在的苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化。结果是p38不能被活化，并且因此其不能在信号转导级联中实现其功能，这对于治疗那些涉及在细胞信号传导级联中所述MAPK的活化的疾病可能是特别有用的。本领域技术人员会理解，不仅在所述新磷酸化位点的磷酸化，而且在所述新磷酸化位点或所述位点的周围区域引入负电荷或大残基，也可以产生防止MAPK蛋白活化及其对其底物的活性的效果。因此，本发明教导MAPK蛋白中新磷酸化位点的存在，其中所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，所述磷酸化位点例如小鼠p38、a亚型的Thr123，或者是存在于另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同是通过氨基酸序列的多序列比对所定义的，并且所述磷酸化位点的进一步特征是，一旦其被磷酸化，其能够抑制所述MAPK蛋白的活化。所述不同的磷酸化位点的具体位置可根据所讨论的MAPK蛋白(ERK、JNK或p38)、亚型和动物物种而不同，尽管在其磷酸化之后(或在所述磷酸化位点或所述位点的周围区域中引入负电荷或大残基之后)其防止所讨论的MAPK蛋白活化的功能不变，其位置等同或对应也不变。含有具有上述位置和功能特征的所述磷酸化位点的MAPK蛋白被包括在本发明的范围内。因此，本发明的MAPK蛋白不仅包括在Thrl23上磷酸化的小鼠p38蛋白a亚型，还包括其直系同源蛋白，即来自共同祖先基因的、在不同物种中实现相同功能的蛋白，以及其亚型和包括在MAPK蛋白的组中的其它激酶(ERK和JNK)，而不论磷酸化位点是否在所述位置(Thrl23)或在另一不同位置并且磷酸化的氨基酸是否是不同于苏氨酸的氨基酸。此外，本发明的MAPK蛋白还包括在新的磷酸化位点或在所述位点的周围区域具有负电荷或大残基的经修饰的MAPK蛋白，如在Thr123或所述位点的周围区域含有负电荷或大残基的经修饰的小鼠p38蛋白，a亚型，还包括其直系同源蛋白以及其亚型和包括在MAPK蛋白类群中的其它激酶(ERK和JNK),而不论该负电荷或大残基是否在所述位置(Thrl23)或在另一不同位置并且经修饰的氨基酸是否是不同于苏氨酸的氨基酸。根据本发明可被引入所述新磷酸化位点或所述位点的周围区域的负电荷的示例性、非限制性实例对于本领域技术人员是很显然的，例如，任何能够提供负电荷的分子或化合物，如带有磷酸盐基团的肽，所述肽能够与所述磷酸化位点结合或与其周围区域结合，并在该位点模拟磷酸化的效果。根据本发明可被引入所述新磷酸化位点或所述位点的周围区域的大残基的示例性、非限制性实例对于本领域技术人员是很显然的，例如，任何能够与所述磷酸化位点结合或与其周围区域结合，并在该位点模拟磷酸化的效果的分子，如肽或低分子量化合物；尽管本发明人不想提出任何理论，但相信所述大残基可在MAPK蛋白中产生构象变化，这防止了所述MAPK蛋白的活化以及其对其底物的活性。本文中所用的表达"在(新)磷酸化位点的周围区域"是指磷酸化位点周围的区域，其中通过负电荷或大残基在其中引起的修饰防止所述MAPK蛋白的活化及其对其底物的活性。能够在所附的实施例中找到用于测定防止或抑制MAPK蛋白的活化及其对其底物的活性的效果的适当测定方法；因此所述信息能够被本领域技术人员用于识别所述的"磷酸化位点的周围区域"。在具体实施方案中，本发明的MAPK蛋白是在磷酸化位点包含磷酸化的残基的MAPK蛋白的片^爻，所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区IS:中的一个或多个磷酸化位点，其中，如前所述，所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thrl23或者另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对来定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化。所述片段的长度可在很宽的范围内变化，例如3个至30个氨基酸残基，通常为5个至25个氨基酸残基，优选10个至20个氨基酸残基。然而，如果需要，所述片段可包含更大数目的氨基酸残基。所述片段有利地包含本发明的MAPK蛋白的表位。在具体实施方案中，所述片段包含对应于表位QKLpTDDHVQFLIY的SEQIDNO:2，其中"pT，，代表磷酸化的Thrl23残基并且剩余的字母表明基于小鼠p38激酶，a亚型的单字母编码的氨基酸注解。所述表位在进化中是高度保守的，因此所述SEQIDNO:2能够被认为是不同物种的p38的直系同源蛋白中所述表位的共有序列。在另一具体实施方案中，本发明的MAPK蛋白是在磷酸化位点(或在所述位点的周围区域)包含负电荷或大残基的MAPK蛋白片>^,所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中，如前所述，所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thrl23或者另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对来定义，并且在所述不同的磷酸化位点处的所述修饰(负电荷或大残基)防止所述MAPK蛋白的活化。所述片段的长度可在很宽的范围内变化，例如3个至30个氨基酸残基，通常为5个至25个氨基酸残基，优选10个至20个氨基酸残基。然而，如果需要，所述片段可包含更大数目的氨基酸残基。所述片段有利地包含本发明的MAPK蛋白的表位。已知多种涉及MAPK活化的病理状态。通过非限制性的示例性实例，已知不同疾病与活化的p38之间存在的关系，所述活化的p38即在存在于活化区段中的磷酸化残基，例如哺乳动物(小鼠)p38、a亚型的Thrl80和Tyrl82残基上磷酸化的p38。因此，通过在本发明所鉴定的所述MAPKs的所述新磷酸化位点或在新磷酸化位点的周围区域进行磷酸化或引入负电荷或大残基能够防止MAPK活化(防止在存在于MAPK的活化区段中的磷酸化位点上的磷酸化)的事实(如在哺乳动物(小鼠)p38、a亚型的Thrl23上的磷酸化防止Thrl80和Tyrl82残基上的磷酸化)，以及在Thrl23或在Thrl23的周围区域进行磷酸化或引入负电荷或大残基能够防止p38对其底物的对接及其对其底物的活性的事实具有重要的生物学意义，其可用于诊断由活性MAPK介导的病理状态，或用于确定个体患所述病理状态的风险或易患病体质，或用于评价或监控对患有所述病理状态的个体进行治疗的效果，或用于分析所述病理状态的阶段或严重性和/或发展，以及用于识别潜在的可用于治疗所述病理状态的化合物，以及其它应用。在这种意义上，本发明的MAPK蛋白可起重要的作用。术语"个体"包括任何动物物种，包括人；以示例的方式，所述个体能够是哺乳动物，例如人、家畜、啮齿动物等，优选任何年龄和种族的男人或女人。本文所用的表达"由活性MAPK介导的病理状态"包括任何病理状态，其中涉及活性MAPK或者活性MAPK起某种作用，所述活性MAPK即在存在于活化区段中的磷酸化残基上磷酸化的MAPK。由活性MAPK介导的所述病理状态的示例性、非限制性实例包括癌症和心脏的、传染性的、神经元的、肺的和炎性的疾病。所述疾病的示例性、非限制性实例包括心肌梗塞、肥大、高血压、心肌炎、血管成形术谈发的病变、心肌功能障碍、病毒或细菌感染、神经元死亡或其它细胞类型的死亡、阿尔茨海默病、银屑病、类风湿性关节炎、自体免疫神经炎、克隆病、癌(肿瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤等)、血凝块形成、对化学治疗剂和放射治疗剂的反应、对缺血/再灌的反应等。因此，本发明的MAPK蛋白是可用作诊断标记或用作个体对由活性MAPK介导的病理状态具有易患病体质的标记的蛋白，所述病理状态例如癌症或心脏的、传染性的、神经的、神经元的、肺的或炎性的疾病。由于活性MAPK的存在与上述由活性MAPKs介导的病理状态相关，本发明的MAPK蛋白的检出表明对于患所述病理状态的较低风险或易患病体质，因为在本发明鉴定的磷酸化位点中的磷酸化，或在所述磷酸化位点或在所述位点的周围区域中引入负电荷或大残基会防止所述MAPK的活化。在具体实施方案中，本发明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位点磷酸化的哺乳动物p38蛋白，所述磷酸化位点不同于存在于所述哺乳动物p38的活化区段中的磷酸化位点，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳动物p38，或包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段。在具体实施方案中，本发明提供用于分析个体罹患由活性MAPK介导的病理状态的风险或易患病体质的体外方法，其包含a)对来自所述个体的生物样品中的本发明的MAPK蛋白的水平进行检测和/或定量；以及b)将所述水平与对照样品的水平比较，其中所述水平相对于对照样品的下降表明个体罹患由活性MAPK介导的所述病理状态的风险。事实上能够使用来自所研究个体的任何生物样品，例如血液、血清、血浆、组织等。能够通过常规方法获得所述样品。对照样品是来自不患有由活性MAPK介导的所述病理状态的个体的样品，并且包括参考或基线值。本发明的所述MAPK蛋白水平(浓度)的检测和/或定量能够通过本领域技术人员已知的常规方法来测定，例如通过免疫化学方法(见下文)。本发明的MAPK蛋白还能够被用于评价或监控对患有由活性MAPK介导的所述病理状态的个体进行的治疗的效果，所述病理状态例如癌或心脏的、传染性的、3申经的、神经元的、肺的或炎性的疾病。在这种意义上，防止MAPK活化的治疗，例如通过在本发明中所鉴别的磷酸化位点进行磷酸化或通过在所述磷酸化位点或在所述位点的周进行的治疗的效果，并且如果该治疗无效，则修改治疗或设计定制的治疗。在具体实施方案中，本发明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位点磷酸化的哺乳动物p38蛋白，所述磷酸化位点不同于存在于所述哺乳动物p38的活化区段中的磷酸化位点，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳动物p38，或包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段。本发明的MAPK蛋白还能够被用于分析由活性MAPK介导的所述病理状态的阶段或严重性和/或发展，所述病理状态例如癌症或心脏的、传染性的、神经的、神经元的、肺的或炎性的疾病。在这种意义上，本发明的MAPK蛋白的检出表明这类病理状态的较好的发展。在具体实施方案中，本发明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位点磷酸化的哺乳动物p38蛋白，所述磷酸化位点不同于存在于所述哺乳动物p38的活化区段中的磷酸化位点，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳动物p38，或包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段。在具体实施方案中，本发明提供用于评价或监控对患有由活性MAPK介导的所述病理状态的个体进行的治疗的效果，或用于分析由活性MAPK介导的所述病理状态的阶段或严重性和/或发展的体外方法，其包含a)对来自所述个体的生物样品中的本发明的MAPK蛋白的水平进行检测和/或定量；以及b)将所述水平与来自相同个体的对照样品的水平进行比较。两个水平之间的比较表明治疗的效果和/或病理状态的发展。为此目的，在该情况下对照样品是进行治疗之前或进行治疗之后的一段时间内来自个体的样品，以分析治疗的效果和病理状态的发展。本发明的所述MAPK蛋白水平(浓度)的检测和/或定量能够通过本领域技术人员已知的常M^方法来测定，例如通过免疫化学方法(见下文)。本发明的MAPK蛋白还能够被用于识别潜在的可用于治疗由活性MAPK介导的所述病理状态的化合物，所述病理状态例如癌症或心脏的、传染性的、神经的、神经元的、肺的或炎性的疾病。在这种意义上，防止所述MAPK活化的化合物能够被用于治疗所述心脏的、传染性的、神经的、神经元的、肺的或炎性的疾病；使本发明的MAPK去磷酸化的化合物也能够被用于治疗癌症，因为对个体进行化学疗法或放射疗法之后所述MAPKs的活化产生诱导肿瘤细胞死亡的信号。在具体实施方案中，本发明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位点磷酸化的哺乳动物p38蛋白，所述磷酸化位点不同于存在于所述哺乳动物p38的活化区段中的磷酸化位点，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳动物p38，或包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段，或具有结合于Thrl23或结合于Thrl23区域的周围区域的化合物，并在Thrl23或在Thrl23残基的周围区域模拟磷酸盐负电荷或大残基的存在的p38。在具体实施方案中，本发明提供用于识别潜在的可用于治疗由MAPK蛋白介导的病理状态的化合物的体外方法，其包含a)将候选化合物与MAPK蛋白接触，以及b)检测所述MAPK蛋白在磷酸化位点的磷酸化，所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，以及c)当所用MAPK蛋白是所述蛋白时，分析(i)所述磷酸化位点是否为小鼠p38、a亚型的Thr123，或为另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且(ii)所述不同磷酸化位点上的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化；或者i)将候选化合物(即能够磷酸化所述MAPK蛋白的化合物或模拟所述磷酸化的作用的化合物)与MAPK蛋白接触；ii)检测所述MAPK蛋白在所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点的磷酸化以测量候选化合物对MAPK活化的效果，或检测在所述MAPK蛋白上模拟所述磷酸化的作用以测量候选化合物对MAPK活化的效果；iii)分析所述MAPK蛋白在候选化合物存在下对其底物的活性以检测在竟争化合物存在下MAPK蛋白对其底物的对接和/或对其底物的活性的可能抑制；以及iv)分析(i)在小鼠p38、a亚型的Thrl23处的所述磷酸化位点(当所用MAPK蛋白是所述蛋白时)是否受候选化合物的影响，并且(ii)所述磷酸化位点中的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化。在具体实施方案中，候选化合物可以是能够磷酸化MAPK蛋白的化合物(如激酶等)或者在与MAPK蛋白接触时模拟所述磷酸化的作用的化合物。在具体实施方案中，竟争化合物可以是能够磷酸化MAPK蛋白的化合物(如激酶等)。能够通过本领域技术人员已知的任何常规方法测定蛋白的磷酸化以及模拟MAPK蛋白上的磷酸化的效果。已知多种测定蛋白或特定蛋白中被磷酸化的氨基酸残基磷酸化状态的测定方法，例如使用放射性标记的ATP的体外激酶活性测定；因此^皮磷酸化并被标记的蛋白的二维电泳(允许分析蛋白中有多少个氨基酸残基被磷酸化)；预先纯化的蛋白的质i普，该蛋白的磷酸化状态待测；定向诱变，然后用纯化蛋白进行体外激酶活性测定；涉及胰蛋白酶消化后磷酸化的蛋白的二维分离的磷酸-肽分析，或技术上最不复杂的Western印迹法，其考虑使用抗所述蛋白的抗体，所述抗体特异性识别蛋白的磷酸化的氨基酸残基或表位。检测蛋白中磷酸化的残基的技术对本领域技术人员是公知的，并被包括在现有技术中。在具体实施方案中，所述MAPK蛋白是p38激酶，例如哺乳动物p38,并且磷酸化在存在于所述哺乳动物p38、a亚型的Thrl23残基上进行。另一方面，本发明涉及能够与本发明的MAPK蛋白结合和/或能够^r测本发明的所述MAPK蛋白的化合物。在具体实施方案中，所述化合物是能够与本发明的所述MAPK蛋白结合和/或能够检测本发明的所述MAPK蛋白的抗体。本说明书中所用的术语"抗体"旨在包括嵌合或重组抗体以及单克隆抗体和多克隆抗体或其蛋白水解片,殳，例如片l爻Fab或F(ab，)2等。此外，编码抗体的可变区的dna能够#:插入到另外的抗体中，以通过此方式产生嵌合抗体。简单链抗体(scFv)能够是由具有抗体的与抗原结合的特征性能力且包含一对与免疫球蛋白的轻链和重链可变区同源或类似的氨基酸序列(VH-VL或scFv键)的简单链形成的多肽。抗体的轻链和重链可变区的多肽类似物，如果需要，能够通过连接多肽结合。产生抗体的方法是本领域技术人员公知的，并且被包括在现有技术中。作为示例，本发明提出的抗体是能够结合和/或检测本发明的所述MAPK蛋白中存在的表位的抗体。在具体实施方案中，本发明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位点中磷酸化的哺乳动物p38蛋白，所述磷酸化位点不同于存在于所述哺乳动物p38的活化区段中的磷酸化位点，例如所述MAPK蛋白是在Thrl23上磷酸化的哺乳动物p38，或包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段。在特定实施方案中，所述抗体能够与包含在哺乳动物p38激酶片段中的表位结合，所述片段包含磷酸化的Thrl23残基或其它MAPK蛋白中的位置等同的(匹配)残基。在另一特定实施方案中，所述抗体是能够与包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的表位相结合的抗体，所述表位是进化过程中高度保守的表位，因此所述SEQIDNO:2能够被认为是不同物种的同源p38蛋白中所述表位的共有序列。在另一具体实施方案中，能够与本发明的MAPK蛋白结合的所述化合物是在本发明所鉴别的新的磷酸化位点[即小鼠p38、a亚型的Thrl23或另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同是由氨基酸序列的多序列比对所定义的]或在所述位点的周围区域与所述MAPK蛋白结合的化合物，所述化合物导致MAPK蛋白在活化区段的磷酸化下降，并因此防止其活化和/或其对其底物的活性，例如，在所述磷酸化位点或在所述位点的周围区域引入负电荷或大残基的化合物。所述化合物的示例性、非限制性实例包括(i)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷(如磷酸盐基团)的化合物，如在小鼠p38、a亚型的Thrl23(或在周围区域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23或在Thrl23的周围区域的结合防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷(如磷酸盐基团)的化合物，如在小鼠p38、a亚型的Thrl23或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合削弱所述MAPK蛋白对其底物的活性。另一方面，本发明涉及能够与本发明的MAPK蛋白结合和/或能够检测本发明的所述MAPK蛋白的所述化合物在分析个体罹患由活性MAPK介导的病理状态的风险或易患病体质中的用途，或在评价或监控对患有所述病理状态的个体进行治疗的效果中的用途，或在分析所述病理状态的阶段或严重性和/或发展中的用途，以及在识别潜在的可用于治疗所述病理状态的化合物中的用途。另一方面，本发明涉及载体，以下称为本发明的载体，其包含(i)编码对磷酸化位点进行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)编码防止对磷酸化位点进行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点；或(iii)对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iv)防止对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点。在具体实施方案中，所述MAPK蛋白是哺乳动物p38激酶并且磷酸化发生在不同于存在于所述哺乳动物p38的活化区段中的一个或多个石岸酸化位点的-粦酸化J立点，例如哺乳动物p38的Thrl23。本发明的载体能够是病毒载体或非病毒载体，其是本领域技术人员公知的并能够被用在治疗，例如基因疗法中。在具体实施方案中，本发明的载体包含编码对磷酸化位点进行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、ce亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化，或者本发明的载体包含对所述磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化。在所述不同的磷酸化位点的磷酸化对所述MAPK蛋白的活性产生抑制，因此本发明的所述载体能够被用于治疗由活性MAPKs介导的病理状态。在另一具体实施方案中，本发明的载体包含编码防止对磷酸化位点进行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，或者本发明的载体包含防止对所述磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，例如激酶抑制剂，如GRK2激酶抑制剂或使所述磷酸化位点去磷酸化的磷酸酶。由于所述磷酸化位点的磷酸化被防止，MAPK蛋白的活化能够被促进，当对个体进行放射疗法或化学疗法之后活性MAPK蛋白的存在导致肿瘤细胞的死亡时，这对于治疗癌症能够引起特别关注。因此，在这种情况下，本发明的载体能够被用于治疗由活性MAPKs介导的病理状态，尤其是癌症。在本发明载体的特定实施方案中，对不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点的磷酸化位点进行磷酸化的化合物是激酶，或能够执行所述激酶的特征性功能的其功能活性片段，例如GRK2激酶或其功能活性片段，其如本发明所示，磷酸化哺乳动物p38,如小鼠p38、a亚型中存在的Thrl23残基。另一方面，本发明涉及药物組合物，其包含治疗有效量的(i)对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区^a中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)模拟在磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位点中进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点；或(iv)本发明的栽体；或(v)能够与本发明的MAPK蛋白结合的化合物，其与所述MAPK蛋白在本发明所鉴别的新磷酸化位点结合，或在所述位点的周围区域结合，所述化合物导致MAPK蛋白在活化区段的磷酸化减少，并因此防止其活化和/或其对其底物的活性，例如在所述磷酸化位点中或在所述位点的周围区域引入负电荷或大残基的化合物；或(vi)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷(如磷酸盐基团)的化合物，如在小鼠p38、a亚型的Thrl23(或在周围区域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23或在Thrl23的周围区域的结合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷(如磷酸盐基团)的化合物，如在小鼠p38、a亚型的Thrl23或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合削弱所述MAPK蛋白对其底物的活性，以及，任选地，药物可接受的载体。在具体实施方案中，所述MAPK蛋白是哺乳动物p38激酶并且磷酸化发生在不同于存在于所述哺乳动物p38活化区段中的一个或多个磷酸化位点的磷酸化位点，例如哺乳动物p38的Thrl23上。在具体实施方案中，本发明的药物组合物包含对不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点的磷酸化位点进行磷酸化的化合物，例如激酶，或能够执行所述激酶的特征性功能的其功能活性片段，例如GRK2激酶或其功能活性片段。所述激酶磷酸化哺乳动物p38的Thrl23。在另一具体实施方案中，本发明的药物组合物包含防止对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点。在另一具体实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的载体。为了在预防和/或治疗由活性MAPK介导的病理状态中给药，活化化合物(包括栽体)被以治疗有效量与一种或多种药物可接受的载体、佐剂或赋形剂一起组方成适当的药物组合物。用于以任何适当的给药方法给药的药物组合物的实例包括任何固体(如片剂、胶嚢剂、颗粒剂等)或液体(如溶液2、混悬剂、乳剂等)组合物，所迷适当的给药方法例如口服、皮下、腹膜内、静脉等，由于待治疗疾病通常为慢性的特征，通常以口服给药，。在具体实施方案中，所述药物组合物能够是口服给药的固体或液体药物剂型。口服给药的药物剂型的示例性实例包括片剂、胶嚢剂、颗粒剂、溶液、混悬剂等，并且能够含有常规的赋形剂，例如粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑和润湿剂等，并且能够通过常规方法制备。还能够调整药物组合物以便其以例如无菌的、冻干溶液、混悬液或任何适当剂型的产品的形式进行肠胃外给药；在这种情况下，所述药物组合物将会包括适当的赋形剂，例如緩冲剂、表面活性剂等。在任何情况下，将根据所选的药物给药形式选择赋形剂。不同药物给药形式及其制备的综述能够在C.FauliiTrillo的"TratadoofFarmaciaGal6nica"，第10版，1993，Luzdn5,S.A.deEdiciones中找到。通常，给予的治疗有效量(或载体)取决于被治疗的个体、所述个体所患的病理状态的严重性、所选的给药形式以及其它因素。因此，本发明中所提及的剂量必须仅被视为对本领域技术人员的指导，并且必须根据上述变量调整剂量。然而，能够以通常25mg/kg/天至75mg/kg/天的每日总量每天一次或多次给予本发明的药物组合物，例如每天1、2、3或4次。本发明的药物组合物能够与其它用于预防和/或治疗所述由活性MAPKs介导的病理状态的另外的药物一起使用以提供联合治疗。所述另外的药物能够形成同一药物组合物的一部分，或者能够将其以单独组合物的形式提供，用于与本发明所提供的药物组合物进行同时的或非同时的给药。另一方面，本发明涉及(i)对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、ce亚型的Thr123,或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)才莫拟在磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位点中进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点；或(iv)本发明的载体；或(v)能够与本发明的MAPK蛋白结合的化合物，其与所述MAPK蛋白在本发明所鉴别的新磷酸化位点结合，或在所述位点的周围区域结合，所述化合物导致MAPK蛋白在活化区段的磷酸化减少，并因此防止其活化和/或其对其底物的活性，例如向所述磷酸化位点或所述位点的周围区域引入负电荷或大残基的化合物；或(vi)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷(如磷酸盐基团)的化合物，如在小鼠p38、a亚型的Thrl23(或在周围区域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23或在Thrl23的周围区域的结合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷(如磷酸盐基团)的化合物，如在小鼠p38、a亚型的Thrl23(或在周围区域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合削弱所述MAPK蛋白对其底物的活性，在制备用于治疗由活性MAPKs介导的病理状态的药物组合物中的用途。在具体实施方案中，所述MAPK蛋白是哺乳动物p38激酶并且磷酸化发生在不同于存在于所述哺乳动物p38活化区段中的一个或多个磷酸化位点的磷酸化位点，例如哺乳动物p38的Thrl23。在具体实施方案中，对不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点的磷酸化位点进行磷酸化的所述化合物是激酶，或能够执行所述激酶的特征性功能的其功能活性片段，例如GRK2激酶或其功能活性片段，其磷酸化哺乳动物(小鼠)p38、a亚型的Thrl23。另一方面，本发明涉及包含本发明的MAPK蛋白或如前述的能够与本发明的所述MAPK蛋白结合和/或检测本发明的所述MAPK蛋白的化合物的试剂盒。在具体实施方案中，本发明所提供的试剂盒能够被用于诊断由活性MAPK介导的病理状态，或被用于测定个体患所述病理状态的风险或易患病体质，或被用于评价或监控对患有所述病理状态的个体进行治疗的效果，或用于分析所述病理状态的阶段或严重性和/或发展，以及用于鉴别潜在的可用于治疗所述病理状态的化合物。在特定实施方案中，所述MAPK蛋白是在哺乳动物p38、a亚型的Thrl23上磷酸化的哺乳动物p38激酶。另一方面，本发明涉及治疗由活性MAPK介导的病理状态的方法，其包含对需要治疗的个体给予本发明所提供的药物组合物。下列实施例举例说明本发明，并且不旨在限制其范围。实施例GRK2酶对p38蛋白的Thrl23的磷酸化I.材料和方法产品所用的所有试剂和产品均为分析级。氯化钠、氯化钩、氯化铵、氯化锰和氯化镁、磷酸钠和磷酸钾、碳酸钠、氬氧化钠、乙酸钠、蔗糖、尿素、Tris、曱酪、多聚曱醛、甘氨酸、冰乙酸、盐酸、乙醇、丁醇和甘油均由Merck提供。ATP(三磷酸腺香)、氟化钠、脱氧胆酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇二(2-氨基乙醚)-N，N，N，,N，-四乙酸)、P-巯基乙醇、DTT(二硫苏糖醇)、肝素、原钒酸钠、DMSO(二甲亚砜)、丽春红(Ponceaured)、HEPES(N-(2-羟乙基)哌溱-N，-2-乙烷磺酸)、NonidetP-40、曲拉通x-100、吐温-20、抑酶肽、胰蛋白酶抑制剂、叠氮化钠、蛋白A-琼脂糖由Sigma提供。PMSF(苯曱基磺酰氟)、苄脒、还原型谷胱甘肽、BSA(牛血清白蛋白)和氨千青霉素和卡那霉素抗生素以及IPTG(异丙基-i3-D-硫代半乳糖苷)得自Roche。TEMED(N,N,N，N-四曱基乙二胺)、SDS(十二烷基硫酸钠)、过硫酸铵、溴苯酚蓝、考马斯蓝、具有已知分子量的预先染色的蛋白标准、硝化纤维纸和布4i福德、i式剂(Bradfordreagent)由Bio誦Rad提供。福4木-乔卡才弟奥i式剂(Folin-Ciocalteaureagent)得自Panreac,TCA(三氯乙酸)得自Carlo-Erba。》文射性[丫-32]ATP同位素由AmershamBiosciences提供，并且曱硫氨酸-半胱氨酸代谢标记混合物["S]由NewEnglandNuclear提供。所用的构建体和质粒本说明书中使用下列质粒G肠-大鼠pCMV-GRK3构建体由瑞士Lausanne大学的S.Cotecchia博士捐赠。誦牛pCDNA3扁GRK2、牛pCDNA3-GRK2-K220R和pCDNA3-GRK5构建体由美国费城ThomasJefferson大学的J.L.Benovic博士的实验室捐赠。-GRK2的pCEFL-DNAc反义构建体得自C.Shayo博士。-组成型活化的突变体pCDNA3-MKK6j3(E)、pCDNA3-MKK6]S(Glu):MKK6S207E/T211E由CentroofBiologiaMolecularSeveroOchoaf^everaOc/wa为、子J^浙夢^心」(马德里)的J.M.Redondo博士提供，其还提供了小鼠pCDNA3-Flag-p38a构建体和pGEX2T-p38a原核表达载体。-用于产生GST融合蛋白的pGEX4T-Mxi2和pGEX4T-Mxi2A17载体由Cantabria大学的P.Crespo博士和V.Sanz博士捐赠。岸它-空pCDNA3载体来自Invitrogen。-质粒pCEFL-EGFP由C.Murga博士(CentroofBiologiaMolecularSeveroOchoa)提供。-pBC12BI-Z52-AR构建体由A.Ruiz-G6mez博士(CentroofBiologiaMolecularSeveroOchoa)捐赠。-Raf-1YY340/341DD突变体由英国格拉斯哥的Beatson癌症研究所的A.S.Dhillon博士提供。-pTrcHisB得自Invitrogen。细胞培养物建i的勿/S,秀使用了数个建立的细胞系HEK293细胞(人胚胎肾)得自Invitrogen,COS-7细胞(绿猴肾细胞)和Sf9(草地贪夜蛾(5^^o/^ra/n/^;/7m^))细胞得自ATCC(美国典型培养物保藏中心)。HEK293和COS-7细胞在单独的P-IOO、P-60(Falcon)板上或多孑LM6、M12或M24(Falcon,Costar)板上，在补充有2mM谷氨酰胺、10%胎牛血清以及抗生素混合物(50ng/ml庆大霉素、0.01%链霉素和0.063%青霉素G)的Dulbecco，s改良的Eagle培养基(DMEM)中单层生长。同样，使用稳定表达GRK2的、由EBNA(衍生自HEK并用编码EBNA抗原的质粒转染)细胞和由抗新霉素的pCDNA3-GRK2载体产生的两种大规模培养物，因此将其在200/xg/mlgeneticin(新霉素G418，Calbiochem)的存在下培养。得自ATCC的前脂肪细胞细胞系3T3-L1,以及由其产生的稳定系4皮维持在补充有谷氨酰胺和抗生素和10。/o新生牛血清(NCS)的DMEM培养基中。向用pCDNA3-GRK2和用pCDNA3-K220R稳定转染的群中加入750/xg/mlgeneticin。下文详细描述了分化成脂肪细胞的条件。所有这些细胞类型均在37°C下在含有5%至7%的C02的潮湿气氛中孵育。Sf9细胞在3x1()S细胞/ml的密度下并在150rpm搅拌下在混悬液中生长，或在P-100或P-150板上在27。C和没有C02气氛的条件下在补充有胎牛血清和庆大霉素(50貼/ml)的Grace's培养基(Gibco)中单层生长。使用标准方案得到和保持鼠科巨噬细胞(pacrophage)的原代培养物。基本上，将由MarcCaron博士(杜克大学，北卡罗来纳)好意捐赠的3月龄的C57BL/6GRK2+/+和+/-小鼠腹膜内注射巯基乙酸钠(lml)。4天后，通过用15mlPBS腹膜内洗涤分离腹膜巨噬细胞。在M12板上每孔接种一百万个细胞，允许其粘附在补充有0.5%FCS的RPMI培养基中，并将其充分洗涤。将得到的巨噬细胞于37。C在潮湿舱内在RPMI0.5%FCS中用详尽(detailed)浓度的来自E.Coli的LPS(Sigma)刺激16小时。脊染HEK293和C0S-7细胞的瞬时转染通过Lipofectamine/PLUS方法(Invitrogen)以70%至80%的融合在P-100P-60板中进行。尽管对于诸如Fugene(Roche)、JetPei(PolyTransfection)或Escort-II(Sigma)的试剂使用另外的转染方案，但最常用的方法是脂转染胺试剂(lipofectamine)方法。概括地说，转染前一天通过P-60平板接种1.5乂106个细胞(HEK293)或与所用的板表面成相关比例的数目的细胞。此后，所述方案指P-60板。下一天，制备高纯质粒DNA(在Quiagen提供的亲和柱中分离并再次悬浮在无菌的超纯水中)(在P-60的情况下为3jug至5jiig)、PLUS试剂(对于P-60为8jtd)和OPTIMEM(Gibco，BRL)(对于P-60为250./zl)的混合物(1)，将其在室温下孵育15分钟。在每一实验中，加入需要量的空载体(通常为pCDNA3)以保持每板的DNA总量恒定。以平4亍的方式，在另一试管中，将lipofectamine(对于P-60为12.pl)与OPTIMEM(对于P-60为25Q/il)混合(2),并且也进行孵育。15分钟后，将(1)和(2)以等份混合，将所制备的混合物继续孵育15分钟，并且最后将其倾倒在预先被OPTIMEM(每一P-60为2ml)覆盖的板上(最终反应混合物对于P-60为0.5ml)。将细胞于37。C在转染培养基中孵育3小时，然后除去转染培养基并用补充有10%血清的DMEM培养基代替。下一天，用新鲜培养基取代原培养基并且在为了实验而处理培养物之前使细胞恢复至少24小时。通常，细胞的处理、收集和溶解发生在转染之后48小时。GRK2和P38MAPK在GRK2和Flag-p38a结合实验中，使用1:1:1比率的GRK2(或GRK2-K220R)、Flag-p38a和]32-肾上腺素能受体(通常对于每一p60为在增加GRK2量的过表达测定中，通常接种在6孔或12孔(M6或M12)多孑l板中的HEK293细胞被pCDNA3-Flag國p38a、pCDNA3-MKK6CAM以及被增加量的pCDNA3-GRK2载体转染(如附图所示)。通常对于M6使用100ng的Flag-p38仏100ng的MKK6CAM和0至1jug的GRK2。在所有的点，用pCEFL-EGFP来补足DNA总量，且在对照点的情况下，用空pCDNA3代替pCDNA3-MKK6CAM。在M6多孔板中的GRK2反义DNA的转染中，所用的DNA的量稍微不同150ng的pCDNA3陽Flag-p38a、50ng的pCDNA3-MKK6CAM以及0.5jiig至2/xg的pCEFL-GRK2反义(AS)载体或等量的pCEFL-EGFP。在所有的点中，用空pCEFL载体补足DNA总量。在类似的过表达测定中，用150ng的pCDNA3-Flag-p38aWT或pCDNA3-Flag-p38aT123D和50ng的pCDNA3-MKK6CAM(或空pCDNA3)瞬时转染M6中的细胞，总是重复两次。通过电泳后免疫检测(Western印迹法)用每一情况下指定的特异性抗体分析细胞溶解物(约细胞溶解物总体积的10%)证实了不同蛋白的瞬时表达。在所有情况下，在转染后48小时对瞬时转染的细胞进行刺激处理。用不同的试剂刺激后，用冷的磷酸盐缓冲液盐水(PBS)洗涤细胞并用刮板收集。收集细胞所用的溶解緩冲液取决于要进行的具体免疫沉淀(参见免疫沉淀部分)。用10j^M异丙肾上腺素(Sigma)于37。C在不含血清的培养基中对HEK293细胞进行刺激。在这些实验中，在刺激之前将细胞在没有血清(血清饥饿)的条件下保持2小时，以便将来自血清中存在的化合物的刺激最小化。在细胞培养箱中用0.5MNaCl(Merck)进行刺激15分钟。脂肪细胞分化用NCS血清的10。/。DMEM培养基进行细胞培养。然而，下文所述的整个分化过程必须在耗尽的(depleted)AXC血清(离子交换树脂)中进行，耗尽的AXC血清通过使胎牛血清连续在阴离子交换树脂上和在活性碳上吸附而得到。AXC血清由InstitutoofInvestigacionesBiom6dicas(^:參厓夢^f^T^f)的制备服务(kitchenservice)提供。使细胞生长直至融合，并将其平板接种在(在P-100中5x105)补充有4/aM的生物素(Sigma)的DMEM-10%AXC培养基中。下一天，用新鲜的培养基代替原培养基。使细胞继续生长3天，直至再次达到融合，该天称为第"0"天。在分化的第0天，将细胞在含有0.5gM地塞米松(Sigma)、0.5mM3-异丁基-l-曱基黄噤呤(IMBX,Sigma)和1/xM胰岛素(Sigma)的培养基中培养，并在该培养基中再保持3天。在第3天，这种开始脂肪生成处理的培养基被补充有4生物素和1/AM胰岛素的DMEM-10%AXC取代，在其中发生剩余的分化，每3天更换培养基。从第6天至第15天，通过用油红染色来分析脂肪生成，油红为具有亲脂性结构的红色染料，其与被脂肪细胞积聚在其细胞质中的脂肪滴结合。为此，将细胞用福尔马林(3.7%曱趁)固定5分钟并用冷的PBS洗涤。将其与预先过滤的60:40(v/v)油红(以0.2%w/v溶于异丙醇)和水溶液孵育。将其用PBS充分洗涤，并且在光学显微镜下观察细胞。在每个实验板中总共计数25个视野的细胞。突变体产生,威^f傳大多数突变体通过StratageneQuickChange定向i秀变方案产生。冲既括地说，使用热稳定Pfu作为聚合酶制备反向平行诱变寡核芬酸，下文对于每一具体突变体均指明了反向平行诱变寡核普酸，在热循环器(AppliedBiosystemsGeneAmp9700)中用其进行聚合酶链式反应(PCR)。整体扩增的载体用Dpnl消化以除去霉菌或肠胃外DNA并且将消化产物转化至感受态细菌中，从中能够由SIDI(ServicioInterdepartamentalofInvestigaci6n，部间研究月l务)通过用每一类型质粒的特异性引物寡核苷酸(Sp6、T7、T3或用于对克隆在pGEX载体中的蛋白进行测序的特异性引物寡核苷酸)进行测序而检查突变掺入。p38T123A誦寡核苦酸FWD:5'GTGAAGTGCCAGAAGCTGGCCGACGACCACGTTCAG3'(SEQIDNO:3)画寡核苦酸REV:5'CTGAACGTGGTCGTCGGCCAGCTTCTGGCACTTCAC3'(SEQIDNO:4)用界定pCDNA3中的p38的ORF(开放阅读框)的引物核苷酸SP6和T7，或用对AmershampGEX质粒系列进4亍测序的特异性核苷酸测序诱变PCR产物。p38T123D-寡核香酸FWD:5'GTGAAGTGCCAGAAGCTGGACGACGACCACGTTCAG3'(SEQIDNO:5)-寡核芬酸REV:5'CTGAACGTGGTCGTCGTCCAGCTTCTGGCACTTCAC3'(SEQIDNO:6)使用InvitrogenGateway系统产生截短的蛋白GST-280-360p38，其对应于p38a的最后80个氨基酸。这种通过重组酶的多价克隆方法允许感兴趣的蛋白或蛋白片段在用于真核和原核宿主且具有数个表位的许多质粒中表达。首先，需要设计允许attB序列并入的寡核苷酸，attB序列为重组酶的标耙并界定待翻i奪的p38a的ORF区域。它们被称为GTW,得自Gateway。制备寡核苷酸GTW-FWD，使得要翻译的p38的第一个氨基酸(Ala281，在核苦酸序列中带下划线的)与attBl序列符合读框。寡核苷酸GTW-REV包括翻译的终止密码子(也带下划线的)。使用质粒pGEX2T-p38a作为PCR的模板。-寡核苷酸GTW誦FWD:5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCTGTCGACCTACTGGAGAAGATG3'(SEQIDNO:7)-寡核苦酸GTW-REV:5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGGACTCCATTTCTTCTTGGTC3'(SEQIDNO:8)将240bpPCR产物克隆到pDONORTM201载体中是通过BP-克隆酶反应(25。C至少1小时)进行的，该反应包括由attB序列介导的PCR产物与pDONOR载体的重组。通过在37。C下加入蛋白酶-KIO分钟而终止反应。重组产物，DNA，^皮用于转化DH5a细菌，用卡那霉素选择。随后，选择想要的质粒pDEST15确保克隆于其中的蛋白的原核表达，该蛋白与GST融合，从重组序列至GST符合读框。(p38的0末端片段也被引入真核表达质粒pDEST27中，但省略了所述结果)。通过使用入门克隆(pDONOR-280-360p38)和载体线性化的pDEST15，并与酶促LR-克隆酶混合物在25。C孵育1小时而进行LR-克隆酶反应。通过将样品与蛋白酶-K在37。C赙育20分钟而终止反应，并且在通过用attB寡核苷酸测序而进行相关检查后，得到的DNA被用于转化BL21细菌，从中纯化GST-280-360p38构建体。对于带有C-末端组氨酸标签的MAPKAPK2(MK2)的表达和纯化，从PhilCohen博士(英国，苏格兰，Dundee大学)得到为了更稳定的表达而删除了富含脯氨酸的N-末端区域的质粒pFtx5-MK2AN1并用作PCR反应的才莫板，该PCR反应使用引物5，GGGGCCATGGTCAAGTCCGGCC3，(SEQIDNO:9)和5'CCCCCTCGAGGTGGGCCAGAGCCGCAGC3，(SEQIDNO:10)。产物被NcoI-XhoI亚克隆(黑体)到pTrcHis2B载体(Invitrogen)中。纯化的重组蛋白和多肽活化MEKK6/MEKK3由Upstate提供。A.Ruiz-G6mez博士由被杆状病毒中的GRK2构建体感染的Sf9细胞进行了GRK2的纯化。根据常规方法从牛视网膜中纯化视紫质。这样得到了制备物，其中视紫质超过蛋白的90%(通过考马斯蓝染色证实)。根据筒单描述的常规方法纯化融合蛋白GST-p38、GST-ATF2、GST-MEF2A、GST-Mxi2、GST-MxiA17和GST-280-360p38、GST-p38T123A和p38T123D:所述构建体被转化至大肠杆菌细菌，并且用IPTG诱导其表达。将细菌沉淀并溶解在pH8的10mMTris-HCl、1%曲拉通X-IOO、2mg/ml溶菌酶和蛋白酶抑制剂中，然后将细菌溶解产物超声处理并使之澄清。将其上样到谷胱甘肽-Sepharose4B⑧(AmershamBiosciences)柱中并过柱至少3小时，将柱用PBS洗涤，然后用pH8的50mMTris-HC1、5mM还原谷胱甘肽(Sigma)将蛋白洗脱。在变性聚丙烯酰胺-SDS凝胶中检查所得蛋白的纯度和浓度。在前面的部分中已指明了编码这些蛋白的质粒的来源，或者如果它们是由本发明人制备的，则在适当的时候指明。特异性p38底物，例如MBP(髓磷脂碱性蛋白)或PHAS-I(磷酸化的、热和酸稳定的、被胰岛素调节的)分别得自SIGMA和Stratagene。被描述为MAPKs特异性底物的APRTPGGRC肽被用在使用p38激酶的磷酸化反应中，APRTPGGRC肽由CBMSO的ServicioProte6mica(蛋白质组服务)合成。将其溶解在pH7.6的Tris20mM中至0.5mM的最终浓度。通过Bradford方法或通过Lowry等人的方法使用牛血清白蛋白作为构建标准曲线的标准而进行蛋白测定。电泳丙雄凝麽凝魔豕一维凝胶根据Laemmli所述的方法使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶，根据实验要求的分辨率丙烯酰胺-二丙烯酰胺百分比的范围为7%至12%。1吏用下列蛋白作为分子量标准肌球蛋白(200kDa)、p-半乳糖苷酶(l16.25kDa)、磷酸化酶B(97.4kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵白蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(31kDa)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21kDa)和溶菌酶(14kDa)(RainbowMarkers,Bio-Rad)。在若干情况下，用考马斯蓝对凝胶进行染色。将蛋白分离后，如果蛋白被[7-"P]ATP所标记则能够对凝胶进行放射自显影，或者如果蛋白被["S]-甲硫氨酸标记则能够对凝胶进行荧光自显影。在这两种情况下，均要求在甲醇:乙酸(50:10)中进行20分钟的固定步骤。在代谢标记中，常常通过与Amplify(Amersham)孵育20分钟而将信号放大，然后将凝胶干燥并暴露于100NIF的AgfaCurixRP2X-射线胶片下。二维凝胶为了分析p38中被GRK2磷酸化的底物残基的数目，将两种蛋白在下文指明的反应条件下孵育。将得到的磷蛋白在二维凝胶中分离。通过使用两性电解质的分离混合物(Bio-Rad)，以3-10的最终pH范围，在具有8M尿素的4%丙烯酰胺-二丙烯酰胺凝胶中进行等电聚焦或第一电泳维度。有时候，可选择使用预先装配的Biorad条(IPG条，pH范围3-10)进行第一维度。在8。/。凝胶SDS-PAGE中进行第二维度，并且通过放射自显影检测磷蛋白。核凝的7M￡-银腐潜凝魔<^泳在0.8-1%水平琼脂糖凝胶中进行DNA片段的分离。所用的电泳緩沖液是TAE(40mMTris-乙酸，2mMEDTA),并且样品的上样(charging)緩冲液是50%甘油、0.4%溴苯酚蓝和0.4%二曱苯蓝。分子量标准是吞噬细胞和029的HindIII酶消化片段(由CentrodeBiologiaMolecular(分子生物学中心)的发酵服务提供)。蛋白质组测序所关注的翻译后修饰的位置的确定由CardiovascularNetwork的ServiciodeProte6micadelNodoUAM(马德里自治大学)(UAMNode蛋白质组月良务)进4亍，CardiovascularNetwork净皮包4舌在ServiciodeProte6micadelCentrodeBiologiaMolecular"SeveroOchoa"中(http:〃www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt_Servicio—Pagina.aspxIdServicio=29&IdObjeto=118)。对样品进行电泳分离(SDS-PAGE8%)并将凝胶染色。将待分析的条带从聚丙烯酰胺凝胶上切下，并进行胰蛋白酶消化(Promega的胰蛋白酶)。通过MALDI-TOF(基质辅助的激光解吸/离子化-飞行时间，Broker的Autoflex型号)分析胰蛋白酶肽的混合物。概括地说，各种类的肽通过结晶吸附在基质上，然后通过激光短脉冲的入射将其以质子化形式释放。这种样品离子化的方法与飞行时间分析器结合。单负载的肽有效地获得与其质量成比例的动力学能量，并且"飞行"通过真空管直至撞击检测器。在MALDI-TOF型的质i普仪-装备有反射器的Bruker的autoflex型号中直接分析少量(0.5jiil)的消化物的上清液，使用DHB(2，5-二羟基苯甲酸)作为基质和Anchor-Chip表面(Bruker)作为样品架。得到的谱图最终根据质荷比(m/z)与分离的肽对应。比较了GST-p38和GRK2磷酸化的GST-p38的片段谱图，并发现了候选肽。为了证实该指示，对样品进行另一类光镨分析，其允许得到单个肽的片段镨图(MS/MS):电喷雾/质谱-离子阱ES/MS-IT，Thermo-Finnigan的Deca-XP型号(SanJos6,California,USA)。离子化之前，由于后者能够在毛细管中进行，即用液体样品，通过RP-HPLC(反相高压液相色语)将候选肽(先前被MALDI-TOF"怀疑的")分离。使用内径为180/xm的柱(0.18mmx150mmBioBasic18RP柱，Thermo-Keystone)、1.5gl/m的流速、使用"金属针工具包(metalneedle-kit)"界面(Thermo-Finnigan)的微喷雾模式、5%至60%溶剂B的梯度将肽洗脱(90分钟)。色谱与离子阱质i普仪连接。在该片段化方法中，对样品施加强电场，结果是产生带电的液滴，在蒸发溶剂后，带电液滴成为与样品混合物的肽对应的发射的离子。这些离子能够是多质子化的，优选地在N-末端末梢处以及在组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基中。离子阱分析器产生三维电场，其允许通过离子喷雾电离而分离离子。因此，最终得到片段语图或MS/MS语图，当在"SIM"(单离子监测)模式下工作时，所述镨图限于候选肽的片段谱图。在高灵敏度模式或"SIM"模式下分析样品，监测下列m/z:937.51和977。51。在对"推测"磷酸化的肽的片段系列进行理论预测之后，b和y"系列的数个酶被确定至得到的谱图。免疫方案表I显示所用的第一抗体。^豕^的^瘦检W""义瘦伊遂减『e^em伊遊法"J将待分析的样品(纯化的蛋白、溶解产物或亚细胞部分等)与商购的分子量标准(Bio-Rad)—起在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离。通过在碳酸盐纟爰沖液(3mMNa2C03、10mMNaHC03、20%甲醇，pH约为10)中进行液体转移75分钟(在50V，在12x14cm凝胶、使用Bio-RadTrans-BlotCell的情况下，或者在30V、120分钟)将这样分离的蛋白转移至硝化纤维素滤膜(Bio-RadTransblot)。在用丽春红对硝化纤维素膜进行染色后，将其于4。C在补充有5%的5。/。脱脂奶粉(Molico)或5%的BSA的TBS基质(10mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl)中孵育过夜，目的为封闭可能的非特异性结合位点。丟弃封闭基质之后，将膜与相应的、在1%TBS-BSA中稀释的抗体(表I)接触。在与1:50,000稀释的第二抗体(当第一抗体为多克隆时为与过氧化物酶结合的家兔抗免疫球蛋白，并且对于单克隆抗体第二抗体为小鼠抗免疫球蛋白，二者均为得自NordicImmunology)孵育之前，将膜用至0.15%的conTBS-吐温20洗涤三次(3x10分钟)。最后，为了显影而使用化学发光方法，其中过氧化物酶在H202(ECL，Amersham)存在下催化鲁米诺底物的氧化。通过被曝光胶片的激光密度测定进行定量(MolecularDynamics300A计算光密度计)。由PacificImmunology使用鼠科p38a的肽QKLpTDDHVQFLIYC作为免疫原在家兔中产生多克隆抗磷酸化Thrl23p38血清，然后通过两次连续通过肽和抗磷酸化肽亲和柱进行纯化。抗-His抗体购自Sigma。都定p3S和五及《的活'/i通过免疫检测方法对由不同活化刺激引起的转染的p38和转染的ERK的活性程度进行测定。特异性抗体仅与磷酸化的和活化的这些激酶形式反应(分别为抗磷酸化p38和抗磷酸化ERKs)(参见表I的描述)。HEK293细胞，通常经过饥饿(不含血清的培养基)不同时间在p38的情况下为2小时并且在ERK的情况下为整夜，然后被刺激，在处理溶解产物细胞之后，用两种蛋白的活化区段的磷特异性抗体进行磷蛋白的免疫检测。在显影此第一免疫检测之后，用緩冲液2%SDS、100mM/3-巯基乙醇、62.5mMTris-HCl、pH6.7释放免疫复合物并用总抗p38和抗ERK抗体进行膜的再孵育。在激光光密度计中进行条带的定量。在所有情况下，相对细胞中表达的p38或ERK的总量对用抗磷酸化蛋白抗体检测到的条带所得到的值进行归一化。这样，表示了不同激酶的刺激相对于基线条件的增加。然而在某些情况下，假设第一显影有干扰第二显影的风险，则通过分别显影的两张不同膜的光密度测定来评价活化，一张用磷特异性抗体显影，另一张用抗总蛋白的抗体显影。将要进行免疫沉淀的总样品或细胞溶解产物稀释在补充有蛋白酶抑制剂(STI大豆胰蛋白酶抑制剂)和苯曱脒100/xg/ml、PMSF200/xg/ml和抑酶肽10p/ml的不同緩沖液中。如下文详细说明的，緩冲液根据每一情况下所用的抗体而变化。在所有情况下，允许溶解在搅拌和4。C下发生至少1小时后，将样品离心(24000xg)并取部分(约10%)以证实特定蛋白的表达。向剩余样品中加入BSA(500Mg每一p60)和每一情况下相应量的抗体。所有免疫沉淀均在4°C下进行过夜。下一天，根据抗体是多克隆的还是单克隆的分别加入30pl的50%蛋白A-琼脂糖(Sigma)或蛋白G-琼脂糖(Zymed)，并将其在4。C再孵育卯分钟。若抗体共价结合在树脂上则省略该步骤，而是加入5-10]Ltl的"免疫树脂"。通过离心分离收集免疫复合物并且在弃去上清液后，用10-15ml的洗涤緩冲液洗涤3-5次(800xg,5分钟)。若免疫沉淀的目的是磷酸化反应，则将其用不含ATP的相同的孵育緩冲液再洗涤两次(2x10-15ml)。将免疫沉淀的蛋白重新悬浮在电泳裂解緩沖液中，并且通常将其煮沸5分钟，用于后来将全部样品上样到适当百分比的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。RIPA(放射免疫沉淀测定)緩沖液该增溶緩冲液被广泛使用，尤其是在GRKs的免疫沉淀中300mMNaCl、20mMTris-HClpH7.5、2%诺乃洗涤剂P-40、1%脱氧胆酸和0.2%SDS。"M2抗flag"免疫沉淀緩冲液对于用M2抗flag抗体进行的免疫沉淀，将细胞收集于pH7.4的10mM磷酸钠緩沖液(由0.1MNaHP04和NaH2P04的母溶液制备)、150mMNaCl和1。/。正十二烷基-(3-D-麦芽糖苷。溶解后，用由20mMTris-HCl;150mMNaCl和蛋白酶抑制剂形成的盐水緩冲液将其补足至300/il(每一p60板)。最后，将免疫沉淀物在由下列形成的緩冲液中洗涤50mMTris-HClpH7.5、20mMMgCl2、1%曲拉通X-IOO、1mMEDTA、1mMMgCl2、15mMNaF、20mM焦石粦酸盐。潜合遂i^^^發按照标准程序对蛋白GST、GST-p38wt、GST-p38T123A和GST-p38T123D进行细菌表达并使用谷胱甘肽-琼脂糖4B(GE画Amersham)进4亍分离(Murga，C."a/.Highaffinitybindingofbeta-adrenergicreceptorkinasetomicrosomalmembranes.ModulationoftheactivityofboundkinasebyheterotrimericGproteinactivation肾上腺素能受体激酶与微粒体膜的高亲和性结合。通过异三聚体G蛋白活化调节结合激酶的活性).JBiolChem271,985-994(1996))。使用Probond树脂(Invitrogen)，按照生产商的说明纯化His-MAPKAPK2。MKK6cAM购自UpstateBiotech。持续振荡下，于30。C将每一图的图例中详细说明的量的蛋白在结合緩冲液(25mMTrispH7.5、0.25MNaCl、10mMMgCl2、5mMNaF和0.5%BSA)中孵育30分钟。加入ATP(50^M)以进行MAPKAPK2潜合遂應一实验。将沉淀用含有0.5%曲拉通X100的相同緩冲液洗涤三次(10ml)。将沉淀的复合物用SDS-PAGE分离并通过Western印迹法显影。磷酸化测定蛋冷的沐斧礴^^p38被GRK2磷酸化将重组GST-p38和GRK2(二者均为25-150nM的等摩尔量，除了在计算动力学参数的实验中，其中指定了浓度)在p38磷酸化緩沖液(25mMHepespH7,5、10mM乙酸镁、50ATP、2000-3000cpm/pmo1[7-32P]ATP)中以40jLil的最终体积孵育。通常，磷酸化反应在30°C进行30分钟。在二维电泳或样品用于蛋白质组测序的情况下，反应延长至1小时或2小时。化合物肝素和SB203580(Calbiochem)，分别为GRK2和p38抑制剂，将其以IC50十倍的浓度使用以确保对各自激酶的完全抑制，即，对于肝素为1.5/xM并且对于SB为0.5pM。所用的底物对于p38是MBP(14/ig每点)或PHAS-I,其最终浓度为25ng/^il,对于GRK2是酪蛋白(7.5/ig每点)。磷酸化终止后的样品处理与前述情况相同，除了在8%凝胶(SDS-PAGE)中进行蛋白分离。在30°C将与GST融合的蛋白p38a、Mxi2、Mxi2A17和280-360p38(每一蛋白均为0.5/ig)与重组GRK2(200nM)在磷酸化緩沖液(25mMHepespH7.5、10mM乙酸4美、50/aMATP、2000-3000cpm/pmo1[y32P]ATP)中孵育30分钟。其中包括肝素(150nM)作为特异性GRK2抑制剂。通过加入含有SDS的裂解緩冲液来终止反应。用8%SDS-PAGE分离样品。为了确保包含相同量的蛋白，首先将其通过考马斯蓝染色在凝胶中观察。然后，将凝胶千燥并检测掺入蛋白的放射性("P)。如前述产生并纯化在假设的被GRK2磷酸化的位点(T123)的精确p38突变体，并且在p38磷酸化緩冲液(25mMHepespH7.5、10mM乙酸镁、50/xMATP、2000-3000cpm/pmol|>32P]ATP)中以40]td的最终体积用GRK2进行磷酸化。GRK2和p38亚型的相对浓度(10-80nM)如附图所示变化。p38被MKK6^^^磷酸化用融合蛋白GST-p38WT、GST-p38T123A和GST-p38T123D(150nM)作为重组MKK6CAM(40ng)(UpstateBiotechnology)的磷酸化底物进行体外磷酸化测定(25mMHepespH7.5、10mM乙酸镁、15mmNaF、50/iMATP和1000-2000cpm/pmol[7-32P]ATP)。如前述情况中使反应在30°C进行30分钟并将蛋白在8%SDS-PAGE凝胶中分离。为了确保包含相同量的蛋白，将其通过考马斯蓝染色在凝胶中观察。然后，测定每一p38亚型中掺入的放射性。APRTPGGRR肽被p38磷酸化用M2抗Flag琼脂糖对HEK293、Flag-p38a细月包进行免疫沉淀。将免疫沉淀物用10-15ml的M2緩冲液洗涤三次并用相同体积的磷酸化平衡緩冲液(15mMNaF、25mMHepespH7.5和10mM乙酸镁)洗涤两次。最后一次洗涤中，将免疫琼脂糖复合物重新悬浮在lml的緩冲液中并分离每一点的10%(100/xl)以对照Flag-p38的免疫沉淀。用剩余的免疫沉淀的Flag-p38进行激酶测定，使用APRTPGGRR肽作为底物。在由25mMHepespH7.5;10mM乙酸镁、15mMNaF、50/MATP和500-1000cpm/pmol|>32P]ATP和1-2mM的底物肽所形成的磷酸化緩冲液中以25]til的最终体积进行反应。当指出时，将SB203580以0.5AtM的最终浓度体外加入。允许磷酸化在30°C进行30分钟，然后通过加入15pi的30%TCA而终止。通过离心(25,000xg，15分钟，4。C)使蛋白沉淀并从每一反应中收集含有磷酸化的肽的上清液。将正方形(1cmx1cm)WhatmanP81纸切片用肽溶液浸渍。将其晾干，用75mM磷酸充分洗涤并通过Cerenkov对掺入被吸附肽的放射性进行定量。在每一情况下，p38对该肽的活性是指在仅对应该肽的点所检测的基线(或背景)活性。ATF2和MEF2A底物被p38鳞酸化与GST结合的ATF2和MEF2A形式被用于检测GST-p38的催化活性。在大多数情况下，使用2jug我们自己生产的GST-ATF2或GST-MEF2A。磷酸化条件与前述情况下相同。然而，在另外的场合，如附图中贴切指出的，使用0.2/ig的底物，并且仅允许磷酸化反应进行15分钟。序列比较;Mi,秀/^源參和亚型的^对家肿瘤学研究中心)的Perdiguero博士用ClustalX程序(httt):〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)进行多序列比对并通过引入空位进4亍手工调整。数据的数学和统计分析实验进行至少两次，并且通常数据点重复两次或3次。数据表示为平均值与平均值的标准偏差(土SEM)。假定激酶的Michaelis-Menten行为以计算酶促反应的动力学常数。用"Kaleidagraph"程序作图，其算法能够导出动力学参数Michaelis-Menten常数(Km)和最大速率(Smax-So(每分钟每mg酶掺入的P043-nmol数))。通过"双边学生t检验"(双尾的)和n-l自由度进行统计分析，其中零假设是在我们希望确定其统计显著性的情况或条件与基线或对照条件之间没有显著差异。在每一情况下得到的对应符合零假设的概率(p)的值的范围是pO.OOl至p0.0001，如图所示。II.结果GRK2和p38MAPIC之间的功能相关性p3S被G及尺24#凝必本发明人研究了控制GRK2的活性调节及由MAPK调节其表达的机理，这是由于考虑到GRK2及其底物受体在心脏生理学和诸如高血压、充血性心力衰竭或心绞痛的心血管疾病的病因中的显著影响；并考虑到p38MAPK模块在心肌的发展及其后续功能中的重要性。在充血性心力衰竭中，升高的GRK2水平和p38的失活之间存在负相关。此外，在炎症型疾病，例如类风湿性关节炎中GRK2的水平下降。随后，本发明人决定研究GRK2和p38之间可能的相互作用。第一实验步骤是两种蛋白的磷酸化测定。图1，图A，显示GRK2磷酸化p38。为了排除在某种程度上由于GRK2的存在而造成的p38自体磷酸化的可能性，在磷酸化测定中包括广泛用作GRK2抑制剂的肝素(16ng//d)，预先确定肝素不影响p38的催化活性。同一图显示GRK2的催化活性伴随p38的较小磷酸化，因此GRK2的Ser/Thr激酶活性是造成放射性标记掺入GST-p38的直接原因。用GRK2对GST的磷酸化作为阴性对照并通过检查GST部分和p38的ORF之间的结合区域完成这些实-睑。最近的出版物描述了p38被其与TAB1的相互作用刺激而自体磷酸化；在磷酸化测定中包括了吡咬基咪唑SB203580,它是p38的特异性ATP的竟争性抑制剂。图1的图B显示SB203580抑制剂在p38对p38的通用底物如MBP(髓磷脂碱性蛋白)的催化活性中的影响。考虑到p38a的基线活性是微不足道的，未观察到MBP的显著磷酸化但即4更如此4全测到SB203580的抑制。接下来的两条泳道显示吡。定基。米唑不影响GRK2的激酶活性。最后，放射自显影的最后两条泳道显示p38的自体磷酸化活性在GRK2的存在下增加。所述这些实验的最终结论是p38在体外被GRK2磷酸化。为了4企查磷酸化没有发生在能够^皮诸如MKK3和MMK6的p38活化激酶(MAPKK)磷酸化的残基中，在冷条件下(换句话说，不具有sin[，"P]-ATP)进行磷酸化反应，并且使用磷特异性抗体抗P-p38进行免疫检测(图1，C部分)。该抗体识别p38的苏氨酸180或酪氨酸182中的序列中的磷酸化表位。在下图中能够观察到，仅重组蛋白MKK6的存在引起了磷p38被所述抗体的识别。在上图中，用识别GST的抗GRK2抗体斥企测总蛋白(以观察GST-p38)。这些实-验显示GRK在不同于T180的残基上磷酸化p38。G7^2",者弄力禅凝必-反应动力学参数的研究显示，这些表明反应在体内发生。图l显示磷酸化的动力学特征。起初，进行时间进程反应实验(图D)，其中显示迅速检测到磷酸化(5分钟后)，估计达到最大磷酸化的50%的平均时间为15分钟。GRK2是能够磷酸化诸如微管蛋白、突触核蛋白和光子转导蛋白(phosducin)的数种非颗粒化底物的选择激酶。GRK2对其底物显示的亲和力是不同的。因此，对于突触核蛋白和P-微管蛋白，取决于二者的亚型，Km为约U/xM。对于p38，Km-80nM(参见图1，图E的表)，更接近于对GRK2的其它生理学底物的值，所述底物例如光子转导蛋白和类似于光子转导蛋白的蛋白(PhD和PhLP，Km为40nM至100nM)或m2-毒蕈碱受体。通过Cerenkov的至少三次定量发现的化学计量值为0.4-0.8molPi/molp38,这显示存在^皮GRK2磷酸化的位点。Gi^O和;^S初i芈刀，承^于浚动W。GRK2与数种涉及信号传导和细胞转运的蛋白相互作用。因此，GRK2与Goq、G/^、PI3Ka和7、网格蛋白、GIT(GRK相互作用蛋白)和小凹蛋白(caveolin)以及其它分子相互作用，其相互作用引起对其活性的调节(如磷脂、Ca^-4丐调蛋白、激酶等)。GRK2是模块化激酶并且其催化活性受其不同结构域之间的分子内反应限制。因此，为了观察其与p38结合的能力，通过用j32AR受体刺激引起其活性构象的获得，由此产生的p38活化4艮少见。使用净皮编码iS2AR受体、Flag-p38和GRK2的质粒瞬时转染的HEK293细胞。将细胞饥饿过夜后，用浓度为10/xM的异丙肾上腺素激动剂刺激。在这些条件下，免疫沉淀在免疫沉淀物中检测到GRK2激酶，并且|32AR受体的刺激增强该效果(图2，图A)。如形成图2的不同部分所示，在暴露于异丙肾上腺素中5分钟后得到最大结合。另一方面，观察到两种激酶之间的结合不是必须由仏AR的刺激产生，因为它们在基础条件下(O分钟)也发生共免疫沉淀。在图A中，包括了抗Flag免疫沉淀的非特异性拖动(drag)对照(Cneg)以及证实了p38的另一显著刺激(NaCl)不触发该结合。最后，显示了在这些条件下p38活化的水平。这些首先显示了异丙肾上腺素对p38的活化不是很强，其次显示了p38与GRK2的结合越多则活化越小。进行了"相反的"免疫沉淀测定，即在相同的细胞体系中，但使用抗GRK2抗体以4企测免疫沉淀中的p38。在B部分中，观察到p38和GRK2依赖于激动剂而相互作用(5分钟的异丙肾上腺素)。C部分证实了通过降低GRK2的浓度，仍回收了与Flag-p38结合的GRK2。同样，被激动剂刺激后5分钟发现结合增加。在D部分中，研究了p38与无催化活性的GRK2突变体，K220R共免疫沉淀的能力。能够，见察到，在GRK2-K220R和GRK2-WT的相似的表达水平(参见第三幅图)，突变体不仅能够本身更大程度地与p38结合而且其相互作用似乎不依赖刺激。G及《2的i^表这學瓶p3S被M尺尺6邀凝活/么的然力。检测了p38和其最常用的活化剂之一，MKK6之间的界面。为了限制和切断可能的交叉活化，使用了该MAPKK的组成型活化突变体，MKK6CAM。图3，A部分包括了HEK293细胞瞬时转染实验的代表性图，其中增加剂量的pCDNA3-GRK2质粒与Flag-p38和MKK6CAM均是过表达的(始终用pCDNA3-GFP补足DNA总量)。观察到当越多的GRK2在细胞中表达时，依赖于MKK6CAM的p38活化下降越多。过表达使得对相同细胞的结果的评价是可靠的。当然，由于只进行了Flag-p38的免疫4企测，所以选择了转染细胞(并因此受GRK2和MKK6CAM的影响)并忽略了其它的影响。另一方面，在每一情况下这些细胞中的内源p38均很难检测。使用了表达固定量GRK2的细胞，两种稳定表达不同量GRK2的HEK293群，其中瞬时引入编码Flag-38和MKK6CAM(或其对照)的DNA。结果列于B部分，并且该结果显示，在该体系中，再次观察到p38被MKK6CAM活化的能力下降。GRK2的过表达降低p38对肽底物的激酶活性。随后，检测了受p38活化剂MKK6CAM刺激以及受增加剂量的GRK2刺激的p38对外源底物的催化活性。因此，将HEK293细胞在含血清的培养基中放置发生最佳表达所需的天数；作为其结果，GRK2能够被血清中存在的因子例如LPA等刺激，其信号来自GPCRs。收集细胞，并且使被结合在琼脂糖树脂上的单克隆抗flag抗体识別的Flag-p38激酶从中免疫沉淀。在每一点(始终重复两次)，保留等份的免疫沉淀用于通过免疫检测检查其量(参见图4的B部分中的插图)。然后在肽底物APR上的磷酸化反应中检测经重复洗涤的免疫沉淀。该肽被如此命名是因为其序列的开头三个氨基酸，其对应于MBP的残基94至102,并因该肽具有这些酶的磷酸化共有序列而在先前被用于检测MAPK活性。A部分包括溶解产物对照，其表明了在那些条件下GRK2的表达水平和p38达到的活化状态。B部分的分析允许得出不同的结论。第一是免疫沉淀的p38的催化活性在每一点与其各自的活化状态相关，用A中的抗磷酸化p38抗体检测，并且其特征在于被GRK2的过表达减弱。第二是Flag-p38被存在于培养基中的血清刺激后也具有与肽底物APR相比不显著的催化活性。因此，这些水平被当作是图解定量的参考。最后应该强调，APR肽的磷酸化严格依赖于p38，这是由于其明显被SB203580抑制。G/K2水乎的T犖众存;3S被M^:^6c蕭^强她活化。为了确认上述的结果，进行了相反的实验。换句话说，GRK2是否消45J也影响p38活性。独立于其对GPCRs的激酶活性，GRK2水平的下降应允许相同背景中MKK6cAM导致更强的抗磷酸化p38信号。使用HEK293细胞进行针对GRK2的增加量的DNA反义(AS)瞬时转染(图5A，左边部分)，其平行对照是相同量的编码GFP的质粒(C)。图中显示代表性实验的图。对于GRK2水平，根据所用的DNA剂量得到平均20%至50%的下降。这些数据确认了从先前的GRK2过表达实验中推断的结果，即细胞中GRK2的量越少，p38被MKK6cam的活化越强。附上该影响的图解估计代表(图5A，右边部分)。p38的活化水平(抗磷酸化p38/抗p38)指在每一条件下的基线活化或者为GRK2的更大降低(AS)，或者为GFP的更大降低(C，对照)。在这些相同实验中，在基线条件下评价Flag-p38的活化。p38a的静止活性，即不存在MKK6CAM时的活性通常是微不足道的。它能够通过免疫检测被检测到，通过在化学发光显影中进行长时间曝光(参见图5，B部分中的"过度曝光，，)。因此，如能够观察到的，p38的活化谱，在非共转染MKK6cam的条件下，模拟受到该组成型活化突变体活化的p38的语。按照所述变量之一的消除，与p38的不稳定活化有关的MKK6cAM的过表达、受总GRK2的较高或较低水平的存在影响的p38基线活性的数据是更定量的。因此，在下方图中表示了不存在MKK6cAM的情况下从对Flag-p38a的活化进行定量得到的数据。在DNA反义的每一点中将p38的活化与GFP的平行对照相关联，得到p38在更少的GRK2存在下作为其细胞活化剂的最佳底物的显著趋势(图5，B部分的图)。因此，通过星号指示的显著性是指与其代表性GFP对照相比，在DNA反义的每一点的统计学t学生^r^r中得到p<0.05的值的事实。遞i^减返的沟建沐对;M^被G/K24f凝化的在^迷/f的定在^/^S-G及《2哞涉及三i^潜V々^;t子。Mxi2是可供选择的p38的加工变体，其C末端不同于p38a的C末端。Mxi2是最初由双杂交实验中分离用于与蛋白Max相互作用的蛋白。从氨基酸1至280,其与p38a相同，但它具有含17个完全不同残基的C末端(参见图6中的图解)。除Mxi2之外，使用了截短的突变体MxiA17(与p38aA80精确对应)以确定p38的C末端的任何丝氨酸或苏氨酸是GRK2的磷酸化的标靶。通过标准蛋白纯化方法得到融合蛋白并检测其与p38a相比作为GRK2底物的能力(图6，A部分)。对于可比量的p38a、Mxi2和MxiA17，后两者不能被GRK2磷酸化。此外，在Mxi2和MxiA17中能够净皮辨别的石寿酸化痕迹比相应于p38a在肝素存在下的磷酸化的痕迹淡。图中还包括了这些激酶中每一种的自体磷酸化对照。考虑到这些结果，产生和纯化p38a序列的最后80个氨基酸，也与GST融合。通过QuickChange诱变方案制备该构建体，并随后在Gateway的el多价体系中包括编码GST-280-360p38a的DNA片段。令人惊奇地，将融合蛋白纯化并检测其抗GRK2之后，没有得到任何磷酸化的痕迹。这些结果显示于图6的B部分。这些显示了使用比GST-MxiA17和GST-p38a更大量的GST-280-360p38a(WB抗GST，下图)，对于GST-280-360p38a和GST-MxiA17均没有得到磷酸化，而对于GST-p38a则得到磷酸化。从该数据推断，对于被GRK2识别以及后来的磷酸化，需要在蛋白p38aWT中存在，而在其截短的N-和C-末端部分不存在的结构决定子。G及尺2^卓个/4'差丄4fp3S。在证实了前述确定被GRK2磷酸化的残基的方法的不足之后，通过蛋白质组技术寻找残基。为了确定计算出的化学计量数仅对应磷酸化位点，通过二维电泳分离GRK2和p38的磷酸化测定，其结果示于图7的A部分。在第一电泳中，利用了掺入磷酰基后蛋白等电点的变化，而在第二电泳中，按照常规SDS-PAGE根据其质量将蛋白分离。仅在对应于GRK2存在下的磷酸化的图中能够观察到对应于GST-p38的强放射性条带。类似地，在该图中，能够辨别出扩散的痕量"P，表明GRK2的多重自体磷酸化。在包4舌在ServiciodeProte6micaoftheCentrodeBiologiaMolecularSeveroOchoa中的CardiovascularNetwork的ServiciodeProte6micadelNodoUAM中(http:〃www.cbm.uam.is/mkfactorv,esdomain/webs/CBMSO/pltServicioPagina.aspxIdServicio=29&IdObieto=118)，鉴别了翻译后小务饰。通过比较GST-p38以及被GRK2磷酸化的GST-p38的片段图语，在胰蛋白酶消化和MALDI-TOF质镨分析后，在磷酸化的样品中观察到肽的存在，其质量可相当于在各自样品中检测到的另一肽的质量加80Da。有效地，观察到了较弱但是独有地存在被GRK2磷酸化的样品，具有磷酸基的翻译后修饰的该肽(1954.330=1874.326+80)。该图(图7的B部分)包括该谱图区域的放大，其中检测到该推定的磷酸化载体的痕迹，在材料和方法部分提供了全图。质i普的详细分析使得筌别了用胰蛋白酶消化得到的4美选肽LTDDHVQFLIYQILR。为了证实该指示，将候选肽通过HPLC分离，并进行更精细的i瞽图分析电喷雾/质谱-离子阱(IS/MS-IT)，独立地监控对应于先前所发现的肽的离子。结果首先显示了来自高压液相色语的、关于两种样品中监控的肽的洗脱时间信息。观察到被GRK2磷酸化的肽更早离开，这是由于色谱的原理，其通过疏水性分离肽，极性较小的肽更保留。第二，显示了两种肽的片段图语和为所得到的肽分配系列。该分析允许识别候选肽LTDDHVQFLIYQILR的苏氨酸作为磷酸化的载体。在图8中，对应于各自样品中不同种类的肽的总质量的峰被突出显示为黄色并且对应于磷酸化样品和非磷酸化样品的语图之间的差别种类的938.3Da峰被突出显示为橙色。谱图分析和蛋白质组方法的最后结论是GRK2在p38上的磷酸化是在p38a序列的苏氨酸123上产生的。的H^^爽f银乂G7^:2碌磁化为了证实被GRK2磷酸化的靶残基，产生了两种在T123上的p38a突变体。突变体p38aT123A代表不能被GRK2磷酸化的p38形式，而突变体p38aT123D，由于天冬氨酸的负电荷以及側链的长度，模拟苏氨酸123的组成型磷酸化的形式。纯化融合蛋白GST-p38c《T123A和GST-p38aT123D并被GRK2磷酸化，始终以蛋白p38aWT作为对照(图9，A部分)。在底物相对于激酶的低浓度且等摩尔浓度下，证实了两种突变体均不是GRK2底物，这证实了苏氨酸123作为所述磷酸化底物的身份。图的A部分还包括了通过用抗p38抗体的免疫检测定量的p38总量的对照。B中包括了带标尺的p38a的代表性图解(Swiss-Prot数据库的登记号为Q16539,www.expasy.org)，其中应该强调大的激酶结构域，包括几乎全部蛋白。称为CD的小区域位于蛋白的末端，并形成两种底物以及p38活化剂的CommonDocking结构域，并且观察到它介导MAPK家族中的蛋白-蛋白识别。p38结晶与来自MKK3和MEF2A的肽的分析允许改正对该对接槽的描述并使其完美。"3^^亚^之河和浙神之河葛,/^伊的嫂差。图IO显示本发明人制备的不同p38蛋白的序列的两个比对。在上图中，比较了不同物种的p38的a亚型(Swiss-Prot数据库中的MK14):鲤鱼(C》，;n'聰scar;zo)(鲤鱼，MK14A一CYPCA:Q90336)、黑腹果蝇CDmso;/n7ame/awogaWer)(果蝇，MK14A_DROME:062618)、非洲爪蟾(Jfewop^/aevh)(非洲爪蟾，MK14—XENLA:P47812)、黑猩猩(尸a"frag/o办&力(黑猩猩，MK14—PANTR:Q95NE7)、犬(Cams/am"/fl〃"(犬，MK14—CANFA:002812)、智人(Womoj印ze朋)(人，MK14—HUMAN:Q16539)、小家鼠(M"sw附cw/w)(小鼠，MK14—MOUSE:P47811)和褐家鼠(ia""s"c^veg!'a^)(大鼠，MK14—RAT:P70618)。使用简单的颜色代码以区分出p38之间相同的氨基酸(黄色)、与共有序列相同的非常保守的氨基酸的直系同源物(蓝色)、与共有序列等价的非常保守的氨基酸的直系同源物(绿色)。剩余的非保守的残基保持为白色。允许更大可变性的区域精确地是p38的激酶结构域之外的区域，其中强调CD结构域位于其中的C末端区域；由于建立与底物的碱性氨基酸、活化剂、去活化剂的静电相互作用，该结构域的酸性氨基酸允许其识別。所有比对的p38a的序列中T123的位置用红色椭圆突出显示。不仅在几乎所有亚型中存在苏氨酸123，而且当其不出现时，在其位置发现能够被同样磷酸化的丝氨酸。此外，通过酸性氨基酸排列的区域在所有的直系同源物中均是保守的，所述区域被认定为形成被GRK2磷酸化的共有序列。随后，研究了本发明人描述的调节是否对p38的所有四种显著的亚型a、j8、7和S都是普遍的。为此，预先比对了包含酵母菌的p38亚型的残基120至140的区域白色念珠菌(Cam/zWaa/^ca""的H0G1(Q92207)、酿酒酵母(Sacc/k^o附j;cMcereWw'ae)的HOG1(P32485)、粟酒裂殖酵母(5W^cwacc/wramj;c^/7owZ^)的Styl(Q09892);人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的p38的7亚型(比对中的亚型MK12,P53778、008911、Q63538、P47812);人、黑猩猩、小鼠和大鼠的p38的S亚型(亚型MK13:分别为比对中的015264、Q9N272、Q9Z1B7和Q9WTY9);果蝇的p38的两个亚型(MK14_DROME，062618和061443),人和小鼠的j3亚型(|32不同于起初分离的0，前者不具备后者中存在的通过八个氨基酸的选择性加工的插入。0亚型是少数并因此4艮难分离，i3形式通常被认为是|82变体)(MK11:Q15759、Q9WUI1);以及最后爪蟾(Xe"o;M力、鲤鱼(C^Wm^)(先前包括在比较中的亚型MK14A以及亚型MK14B，Q9I958)、黑猩猩、狗、人、小鼠和大鼠的a亚型(MK14)。在所有这些中，甚至那些来自酵母菌的亚型之间的高度保守是很惊人的。关于所讨论的苏氨酸(人p38a的T123)，能够说，发现它，以及它周围的氨基酸，在脊推动物中甚至在后生动物中是保守的，在所述周围的氨基酸中发现酸性残基D和E。因此，即使比对在该残基的精确位置受到打断，p38的S亚型仍然是保守的。包括在该比对中的在同源背景中缺少丝氨酸或苏氨酸的唯一亚型是人p38。物(小鼠)p38、a亚型的Thrl23上的磷酸化防止Thrl80和Tyrl82残基上的磷酸化)，以及在Thrl23或在Thrl23的周围区域进行磷酸化或引入负电荷或大残基能够防止p38对其底物的对接及其对其底物的活性的事实具有重要的生物学意义，其可用于诊断由活性MAPK介导的病理状态，或用于确定个体患所述病理状态的风险或易患病体质，或用于评价或监控对患有所述病理状态的个体进行治疗的效果，或用于分析所述病理状态的阶段或严重性和/或发展，以及用于识别潜在的可用于治疗所述病理状态的化合物，以及其它应用。在这种意义上，本发明的MAPK蛋白可起重要的作用。术语"个体"包括任何动物物种，包括人；以示例的方式，所述个体能够是哺乳动物，例如人、家畜、啮齿动物等，优选任何年龄和种族的男人或女人。本文所用的表达"由活性MAPK介导的病理状态"包括任何病理状态，其中涉及活性MAPK或者活性MAPK起某种作用，所述活性MAPK即在存在于活化区段中的磷酸化残基上磷酸化的MAPK。由活性MAPK介导的所述病理状态的示例性、非限制性实例包括癌症和心脏的、传染性的、神经元的、肺的和炎性的疾病。所述疾病的示例性、非限制性实例包括心肌梗塞、肥大、高血压、心肌炎、血管成形术谈发的病变、心肌功能障碍、病毒或细菌感染、神经元死亡或其它细胞类型的死亡、阿尔茨海默病、银屑病、类风湿性关节炎、自体免疫神经炎、克隆病、癌(肿瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤等)、血凝块形成、对化学治疗剂和放射治疗剂的反应、对缺血/再灌的反应等。因此，本发明的MAPK蛋白是可用作诊断标记或用作个体对由活性MAPK介导的病理状态具有易患病体质的标记的蛋白，所述病理状态例如癌症或心脏的、传染性的、神经的、神经元的、肺的或炎性的疾病。由于活性MAPK的存在与上述由活性MAPKs介导的病理状态相关，本发明的MAPK蛋白的检出表明对于患所述病理状态的较低风险或易患病体质，因为在本发明鉴定的磷酸化位点中的磷酸化，或在所述磷酸化位点或在所述位点的周围区域中引入负电荷或大残基会防止所述MAPK的活化。在具体实施方案中，本发明的所述MAPK蛋化，但它对所检测的两种底物的激酶活性下降。本发明人决定稍多地仔细研究这种p38Tcd23A和p38aWT之间的差别效应，因此本发明人集中关注了它们各自的基线活性，即不存在活化激酶MKK6时对MEF2A的活性(图12，B部分)。在有足够底物和长时间暴露的条件下可以评价p38的基线活性并且可以检查T123中的各自的突变体是否具有比野生型激酶更小的基线活性。p38Tcd23A的行为介于p38aWT和p38Tcd23D之间。因此，与最初实验所显示的相比，突变体p38Tal23A在更严格的酶促条件下(底物少10倍以及15分钟的磷酸化；图12的图C)与p38aWT有更大的催化差别。/^S772^D傳具才凝瓶的被A^《6c詹^位;'f化的錄力。该结果平行地提供与HEK293细胞中的最初数据一致的解释，并在此相同的系统中被确证。首先，通过PCR在真核细胞中产生表达pCDNA3-Flag-p38T123D突变体。然后，按照类似于在HEK293中过表达GRK2或降低GRK2表达的实验方法，将Flag-p38WT和Flag-p38T123D与活化剂MKK6cam—同梓染。图13中的图通过将较显示其显著的下降。在细胞中p38T123D的活化比野生型激酶的活化更不容易发生。该图中还包括了由这些实验提供的免疫检测的示例性图。在图14中，通过体外结合测定使用纯化的蛋白分析了底物(MK2)和活化剂(MKK6)与p38或其T123中突变体的结合。如图所示，T123D突变体与MK2或MKK6结合的能力相对于T123A突变体或野生型蛋白被显著削弱。G7W^岸炎源，應4,谬"f的;C^嚴细/《373-ZJ,秀的为V么。使用前脂肪细胞系3T3-L1作为研究p38被GRK2调节的细胞模型。这些结締组织细胞具有有趣的特性，当受到特定的刺激时，其中突出的是胰岛素，它们在约两周的处理结束时获得脂肪细胞表型。通过脂肪液滴的积累能够很容易辨别该分化，所述脂肪液滴被红色亲脂性染料染色并且其占据了3T3-L1的几乎全部细胞质。除了最传统的细胞应激响应之外，p38的生理学功能之一是其在分化过程中的作用。在3T3L1结締组织细胞的特定情况下，基于向脂肪细胞的分化被SB203580阻断并且MKK6CAM的存在是足够的，证明了p38的作用。转录因子C/EBP(CCAAT/增强子结合蛋白)和PPAR(过氧化物酶体增殖物活化受体7)，其表达在分化过程中变化，似乎被p38调节。更明确地，猜想C/EBPj8被p38磷酸化，而p38又仅在分化的最初步骤中才是活化的，它可能促进PPAR和受其控制的脂肪细胞标志物的后来的表达。为了研究GRK2对3T3L1的脂肪细胞分化的可能影响，产生了被质粒pCDNA3-GRK2和pCDNA3-GRK2K220R稳定转染的细胞系，提供对新霉素的抗性。相应地确认了与细胞系3T3L1相比GRK2水平在两种情况下均有效过表达(图15的插图中的窗口)，然后按照标准方案引发了分化。当不存在脂肪生成刺激时，3T3L1细胞具有结締组织细胞(对应于3T3L1中的对照的照片)清楚地转变为脂肪细胞表型的健康外观，如红色油脂液滴以及这些细胞获得的圓形形态所显示(3T3L1中+胰岛素的照片)。对于稳定的GRK2，每一视野的脂肪细胞数目明显少于具有内源水平的该激酶的结締组织细胞的情况。并且对于3T3L1-K220R细胞，其成脂效应显著高于对照细胞。因此GRK2抑制胰岛素介导的脂肪细胞形态的获得，而K220R刺激脂肪细胞形态的获得。此外，由于加入药理学抑制剂SB203580逆转整个脂肪生成，因此该效应依赖于p38。此外，当不进行分化处理的板被保留作为实验的内部对照时，稳定的K220R会发生比其它细胞更强的向脂肪细胞的自发转变。三个细胞系中每一个的每一视野中脂肪细胞数目的计数被标明在图的右侧。所述视野被理解为每一p100或p60中用光学显微镜观察的区域。通常在每一板中对多至总共25个随机视野进行计数。对于成对的数据(每一稳定的细胞系与3T3L1比较)通过学生t检验计算数据的显著性(pO.OOl)。从图16和17的数据得出下列结论针对在T123中磷酸化的p38的肽而产生的多克隆抗血清能够识别在体外被GRK2磷酸化的p38蛋白，而不识别被MKK6在其它残基上磷酸化的p38蛋白，并且这种识别对于T123残基是特异性的，因为T123A突变体不能被该抗体免疫才企测。此外，GRK2的过表达能够促进该表位;故该抗体免疫检测的增加，而当GRK2失活突变体(K220R)被过表达时信号降低。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>权利要求1.MAPK蛋白，选自a)在磷酸化位点中包含磷酸化的残基的MAPK蛋白，或是包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段，所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中-所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、α亚型的123位的苏氨酸残基(Thr123)，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对来定义，并且-在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化及其对其底物的活性；以及b)在磷酸化位点或所述磷酸化位点的周围区域包含负电荷或大残基的MAPK蛋白，或包含所述磷酸化的残基的所述蛋白的片段，所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中-所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、α亚型的123位的苏氨酸残基(Thr123)，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对来定义，并且-向所述磷酸化位点或所述磷酸化位点的周围区域引入负电荷或大残基防止所述MAPK蛋白的活化及其对其底物的活性。2.如权利要求1所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白选自任何物种的ERK、JNK和p38蛋白激酶以及它们各自的亚型。3.如权利要求1或2所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白是哺乳动物p38。4.如权利要求3所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白是小鼠p38、a亚型，并具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。5.如权利要求1所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白包含活化区段，所述活化区段选自-包含通式(I)氨基酸三联体的活化区段Thr-Xaa-Tyr(I)其中Thr是苏氨酸，Tyr是酪氨酸，并且Xaa是氨基酸的残基，优选是选自天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸的氨基酸的残基；以及-包含式(II)的氨基酸三联体的活化区段Ser-Glu-Gly(II)其中Ser是丝氨酸，Glu是谷氨酸，并且Gly是甘氨酸。6.如权利要求1所述的蛋白，包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。7.权利要求1的蛋白在诊断由活性MAPK介导的病理状态，或在确定个体患所述病理状态的风险或易患病体质，或在评价或监控对患有所述病理状态的个体进行治疗的效果，或在分析所述病理状态的阶段或严重性和/或发展，以及在鉴定潜在的可用于治疗所述病理状态的化合物中的用途。8.如权利要求7所述的用途，其中所述由活性MAPK介导的病理状态包括癌症和心脏的、传染性的、神经元的、肺的和炎性的疾病。9.用于在个体中4全测由活性MAPK介导的病理状态，或用于分析个体患由活性MAPK介导的病理状态的风险或易患病体质的体外方法，其包含a)对来自所述个体的生物样品中的权利要求1至6中任一权利要求所述的MAPK蛋白的水平进行检测和/或定量；以及b)比较所述水平与对照样品的水平，其中所述水平相对于对照样品的水平的下降表明个体患由活性MAPK介导的所述病理状态的风险。10.用于评价或监控对患有由活性MAPK介导的所述病理状态的个体进行的治疗的效果、或用于分析由活性MAPK介导的所述病理状态的阶段或严重性和/或发展的体外方法，其包含a)对来自所述个体的生物样品中的权利要求1至6中任一权利要求所述的MAPK蛋白的水平进行检测和/或定量；以及b)将所述水平与来自相同个体的对照样品的水平进行比较。11.用于鉴定潜在的可用于治疗由活性MAPK介导的病理状态的化合物的体外方法，其包含a)将候选化合物与MAPK蛋白接触，以及b)检测所述MAPK蛋白在磷酸化位点的磷酸化，所述磷酸化位点不同于存在于所述MAPK蛋白的活化区IS:中的一个或多个磷酸化4立点，以及c)(i)当所用MAPK蛋白是所述蛋白时，分析所述磷酸化位点是否为小鼠p38、a亚型的Thr123，或为另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且分析(ii)在所述不同的磷酸化位点中的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化；或者i)将选自能够磷酸化所述MAPK蛋白的化合物或模拟所述磷酸化的作用的化合物的候选化合物与MAPK蛋白接触；ii)检测所述MAPK蛋白在所述MAPK蛋白的活化区段的一个或多个-岸酸化位点的磷酸化以测量候选化合物对MAPK活化的影响，或检测模拟在所述MAPK蛋白上所述磷酸化的效果以测量候选化合物对MAPK活化的影响；iii)分析所述MAPK蛋白在候选化合物存在下对其底物的活性以检测在竟争化合物存在下MAPK蛋白对其底物的对接和/或对其底物的活性的可能的抑制；以及iv)分析(i)在小鼠p38、a亚型的Thrl23处的所述磷酸化位点(当所用MAPK蛋白是所述蛋白时)是否受候选化合物的影响，并且(ii)所述磷酸化位点中的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化。12.化合物，其能够与权利要求1至6中任一权利要求所述的MAPK蛋白结合和/或能够检测权利要求1至6中任一权利要求所述的所述MAPK蛋白。13.如权利要求12所述的化命物，其特征在于其是-抗体5或-能够与权利要求1至6中任一权利要求所述的MAPK蛋白结合的化合物，所述化合物与所述MAPK蛋白在小鼠p38、a亚型的Thr123，另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基结合，所述位置等同是由氨基酸序列的多序列比对所定义的，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合导致所述MAPK蛋白在所述活化区段的磷酸化下降并因此防止其活化和/或其对其底物的活性；或-能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亚型的Thrl23或其周围区域，或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23或在Thrl23的周围区域的结合防止所述MAPK蛋白的活化；或-能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亚型的Thrl23处，或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合削弱所述MAPK蛋白对其底物的活性。14.如权利要求13所述的化合物，其中所述抗体是能够与包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的表位结合的抗体。15.如权利要求12至14中任一权利要求所述的化合物在分析个体患由MAPK介导的病理状态的风险或易患病体质，或在评价或监控对患有所述病理状态的个体进行治疗的效果，或在分析所述病理状态的阶段或严重性和/或发展，以及在鉴定潜在的可用于治疗所述病理状态的化合物中的用途。16.载体，其包含(i)编码对磷酸化位点进行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点上的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)编码防止对磷酸化位点进行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点；或(iii)对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iv)防止对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点。17.药物组合物，其包含治疗有效量的(i)对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123,或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点中的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)模拟在磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位点中进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点；或(iv)权利要求16所述的载体；或(v)能够与权利要求1至6中任一权利要求所述的MAPK蛋白结合的化合物，所述化合物与所述MAPK蛋白在小鼠p38、a亚型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基处结合，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合导致所述MAPK蛋白在所述活化区段的磷酸化降低，并因此防止其活化和/或其对其底物的活性；或(vi)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亚型的Thr123，或在其周围区域，或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23或在Thrl23的周围区域的结合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷的化合物，所述化合物在小鼠p38a亚型的Thrl23，或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合削弱所述MAPK蛋白对其底物的活性，以及，任选地，药物可接受的载体。18.如4又利要求17所述的组合物，其包含激酶。19.如权利要求18所述的组合物，其中所述激酶是GRK2激酶或其功能活性片段。20.下列化合物在制造用于治疗由活性MAPKs介导的病理状态的药物组合物中的用途(i)对磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点中的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)模拟在磷酸化位点进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区段中的一个或多个磷酸化位点，其中所述不同的磷酸化位点是小鼠p38、a亚型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且在所述不同的磷酸化位点中的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位点中进行磷酸化的化合物，所述磷酸化位点不同于存在于MAPK蛋白的活化区,史中的一个或多个磷酸化位点；或(iv)权利要求16所述的载体；或(v)能够与权利要求1至6中任一权利要求所述的MAPK蛋白结合的化合物，所述化合物与所述MAPK蛋白在小鼠p38、a亚型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易于磷酸化的位置等同的氨基酸的残基处结合，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合导致所述MAPK蛋白在所述活化区段的磷酸化降低，并因此防止其活化和/或其对其底物的活性；或(vi)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亚型的Thr123，或在其周围区域，或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23或在Thrl23的周围区域的结合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能够与p38的对接区域结合并能够模拟在所述区域中引入负电荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亚型的Thr123,或在另一MAPK蛋白中位置等同的氨基酸的残基处引入负电荷或大残基，所述位置等同由氨基酸序列的多序列比对所定义，并且所述化合物在所述磷酸化位点Thrl23的结合削弱所述MAPK蛋白对其底物的活性。21.试剂盒，其包含权利要求1至6中任一权利要求所述的MAPK蛋白，或权利要求12至14中任一权利要求所述的能够与所述MAPK蛋白结合和/或检测所述MAPK蛋白的化合物。22.如权利要求21所述的试剂盒，其用于诊断由活性MAPK介导的病理状态，或用于确定个体患所述病理状态的风险或易患病体质，或用于评价或监控对患有所述病理状态的个体进行治疗的效果，或用于分析所述病理状态的阶段或严重性和/或发展，以及用于鉴定潜在的可用于治疗所述病理状态的化合物。23.如权利要求21或22所述的试剂盒，其中所述MAPK蛋白是在哺乳动物p38、a亚型的Thrl23上石寿酸化的哺乳动物p38激酶。全文摘要发现了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的新的磷酸化位点。在所述磷酸化位点磷酸化的MAPKs能够被用作由MAPKs介导的病理状态的诊断标记。文档编号C12N9/12GK101233228SQ200680027312公开日2008年7月30日申请日期2006年6月9日优先权日2005年6月10日发明者佩德罗·曼努埃尔·坎波穆埃拉斯,克里斯蒂娜·穆尔加蒙特西诺斯,桑德拉·佩雷格林佩德里克,玛丽亚·胡拉多普埃约,费德里科·马约尔梅嫩德斯申请人:马德里自治大学