活化ampk的化合物及其使用的制作方法

活化ampk的化合物及其使用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于活化AMPK的化合物，其为腺嘌呤及/或其医药学上可接受的盐。并公开了该化合物的应用，此化合物适用于活化AMPK(AMP-活化蛋白激酶)，并使用该化合物于预防或治疗生理状况或疾病，因此于哺乳动物预防或治疗可被AMPK改善的生理状况或疾病。
【专利说明】活化AMPK的化合物及其使用

【技术领域】
[0001] 本发明关于腺嘌呤，此化合物适用于活化AMPK (AMP-活化蛋白激酶），并使用该 化合物于预防或治疗生理状况或疾病。

【背景技术】
[0002] AMPK明确为细胞能量的感应器及能量需求的回应者。AMPK为异三元体由催化性 α次单元体、调节性β、Y次单元体组成，所有次单元体在真核生物具高度保留性。AMPK 活化是借由其上游激酶如LKB1、钙离子/携钙素依赖的蛋白质磷酸激酶（Ca27Calmodulin dependent kinase)及TAKl磷酸化α次单元体具保留性的第172苏胺酸残基，由生理或 病理压力造成高ΑΜΡ/ΑΤΡ比例亦活化AMPK。AMPK活化后会促进分解代谢路径进行并抑制 合成代谢，借由减少ATP消耗及促进ATP生成进而恢复细胞能量平衡。
[0003] 作为一能量代谢平衡调节者，AMPK被认为对代谢症候群，包括第二型糖尿病、心血 管疾病、脂肪肝等为一具潜力的药物标的。许多代谢症候群都与胰岛素抵抗有关。胰岛素 抵抗是为一病理状态，在此状况细胞无法对胰岛素进行回应，因此血液中过多的葡萄糖无 法移除至骨胳肌或脂肪组织。在肌肉细胞中，AMPK活化以非胰岛素依赖性方式，通过转录 调控增加葡萄糖运输蛋白（GLUT4)表现量，并诱导GLUT4转移至细胞膜上导致细胞摄取葡 萄糖速率增加。AMPK活化亦分别借由抑制乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase) 及羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMG-CoA reductase)抑制脂肪酸及胆固醇合成。此 外AMPK活化导致数个转录因子的抑制，包括SREBP-lc，ChREBP and HNF-4a，并下降调节 脂肪酸合成及糖质新生作用相关酵素的蛋白质表现。上述提及的研究发现，均支持AMPK是 为代谢症候群尤其糖尿病的治疗标的。
[0004] 除了能量代谢平衡调节外，AMPK亦参与数个细胞机制的调节，包括发炎反应、细 胞生长、细胞雕亡、自体吞噬、老化及分化。许多研究显示AMPK为发炎反应抑制者。AMPK 活化通过抑制细胞核转录因子（NF-kB)的讯息传递抑制发炎反应。细胞核转录因子的讯 息传递为活化先天免疫及后天免疫主要路径，当AMPK活化后会通过刺激SIRTl、Forkhead box 0 (FoxO)或 peroxisome proliferator-activated receptor co-activator Ια (PGCla)抑制细胞核转录因子的转录活性以达到抑制发炎反应的效果。此外数个研究室 亦证明AMPK活化抑制环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2，C0X_2)的蛋白质表现。环氧化 酶-2是为一诱导性酵素，可被发炎性细胞激素及生长因子调控，其功能为将花生四烯酸转 化成前列腺素因而导致发炎反应及疼痛，因此抑制环氧化酶的活性或表现已被证实具抗发 炎作用。
[0005] 数个AMPK活化剂已于生物体内实验被证实具抗发炎功能。举例而言， 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR)于小鼠模式已被证实可缓 解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯钠所引起的急性及复发性结肠炎，AICAR治疗显著 降低疾病小鼠的体重减少并减缓发炎反应。此外AICAR对于人类多发性硬化症动物模式 (EAE)有明显的治疗效果，亦降低以脂多醣诱导小鼠肺损伤的严重程度。
[0006] 细胞讯息传递路径失调可能会导致细胞异常生长，最终导致癌症。哺乳动物雷帕 霉素标靶蛋白（mTOR)是为一丝胺酸/苏胺酸激酶，其调控细胞生长及自体吞噬作用。哺 乳动物雷帕霉素标靶蛋白讯息传递路径的活性失调在许多不同癌症被发现，因此哺乳动 物雷帕霉素标靶蛋白抑制剂被认为是癌症治疗的潜力药物。大量研究证实AMPK磷酸化 tuberous sclerosis complex 2 (TSC2)及Raptor达到抑制哺乳动物雷帕霉素标革巴蛋白 路径。各种AMPK活化剂包括AICAR、metformin、phenformin已被证实抑制哺乳动物雷帕霉 素标靶蛋白讯息路径，并抑制癌细胞生长。此外AMPK活化通过抑制哺乳动物雷帕霉素标靶 蛋白复合体-1诱导自体吞噬作用。由于AMPK抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白复合体-1， Ulkl上第757丝胺酸磷酸化减少，其后第317及777丝胺酸被AMPK磷酸化，Ulkl被AMPK 憐Ife化后随的启动自体吞喔作用。
[0007] 综上所述，AMPK被认为对许多人类疾病或病理状况，包括发炎性疾病、伤口愈合、 神经退化、癌症、氧化压力及心血管疾病为一很好的治疗标的。事实上，AMPK活化剂已被应 用于至少24类疾病的临床试验，包括：细菌及真菌疾病、行为及心理失调、血液及淋巴疾 病、癌症、肿瘤、消化系统疾病、耳鼻喉疾病、眼疾、腺体及贺尔蒙相关疾病、心血管疾病、免 疫系统疾病、嘴巴及牙齿疾病、肌肉、骨胳、软骨疾病、神经系统疾病、营养及代谢性疾病、呼 吸道疾病、皮肤及结缔组织疾病、伤口愈合等。


【发明内容】

[0008] 本发明提供了一种新颖AMPK活化剂-腺嘌呤及使用该化合物于预防或治疗疾病。
[0009] 本发明提供一种用于活化AMPK的化合物，其为腺嘌呤及/或其医药学上可接受的 盐。
[0010] 本发明提供上述化合物作为制备治疗可被AMPK活化剂改善的疾病或生理状况的 药物的应用。
[0011] 本发明提供上述化合物作为制备治疗发炎性生理状况或疾病的药物的应用。
[0012] 本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗前期糖尿病、第二型糖尿病、代谢症 候群的一种或其组合的生理状况或疾病的药物的应用。
[0013] 本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗前期糖尿病、第二型糖尿病、代谢症 候群的一种或其组合的生理状况或疾病的药物的应用。
[0014] 本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗阿兹海默症的药物的应用。
[0015] 本发明提供上述化合物作为制备治疗可被自体吞噬作用改善的疾病或生理状况 的药物的应用。
[0016] 本发明提供上述化合物作为制备伤口愈合过程抑制疤痕形成的药物的应用。
[0017] 本发明提供上述化合物作为制备加强伤口愈合的药物的应用。
[0018] 本发明提供上述化合物作为制备哺乳动物中保护及治疗受活性氧族伤害的细胞 的药物的应用。
[0019] 本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗癌症药物的应用。
[0020] 根据本发明的实施例，提供一新颖AMPK活化剂-腺嘌呤，可于细胞内活化AMPK，因 此可于哺乳动物预防或治疗可被AMPK改善的生理状况或疾病。
[0021] 根据本发明的实施例，提供一通过活化AMPK降低血糖的方法，从而预防或治疗疾 病包括：代谢症候群、前期糖尿病、第二型糖尿病、胰岛素抵抗，其中给予需要此治疗的哺 乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。
[0022] 根据本发明的实施例，提供一通过活化AMPK抗发炎的方法，从而预防或治疗发炎 性状况或疾病，其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受 的盐。
[0023] 根据本发明的实施例，提供一通过活化AMPK抑制纤维母细胞生长的方法，从而于 伤口愈合期间预防疤痕组织生成。
[0024] 根据本发明的实施例，提供一加强伤口愈合的方法，其中给予需要此治疗的哺乳 动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。
[0025] 根据本发明的实施例，提供一抑制反应性氧族（ROS)生成的方法，从而保护或治 疗哺乳动物的细胞远离反应性氧族伤害，其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌 呤及/或医药学上可接受的盐。
[0026] 根据本发明的实施例，提供一抑制癌细胞生长的方法，从而预防或治疗癌症，其中 给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。
[0027] 本发明是关于腺嘌呤，此化合物适用于活化AMPK，并使用腺嘌呤于预防或治疗生 理状况或疾病，包括：前期糖尿病、胰岛素抵抗、第二型糖尿病、代谢症候群、肥胖、发炎、伤 口愈合、阿兹海默症、癌症、氧化压力及心血管疾病。
[0028] 本发明发现，腺嘌呤为一新颖的AMPK活化剂，并具有各种生物性功能。近年来， AMPK活化已被证实有助于疾病的预防及治疗，如前期糖尿病、胰岛素抵抗、第二型糖尿病、 代谢症候群、肥胖、发炎、伤口愈合、阿兹海默症、癌症、氧化压力、心血管疾病以及促进伤口 愈合。本发明认为，此效果可归因于AMPK活化所导致但不限于降低环氧化酶-2表现量、抑 制应性氧族（ROS)的生产及葡萄糖摄取活性的增加。
[0029] 预期适应症 基于本发明的研究成果（见实施例），腺嘌呤可通过活化AMPK作为使用于各种生理状 况或疾病的治疗剂。以下提供预期适应症的示例性引导及证据。
[0030] 腺嘌呤于高血糖、前期糖尿病、胰岛素抵抗、第二型糖尿病的治疗 最近已有报告指出AMPK活化剂包括metformin，A769662，AICAR于糖尿病或肥胖小 鼠模式降低血浆葡萄糖浓度。于本发明中，1 μ M飞00 μ M的腺嘌呤显著增加肌肉细胞C2C12 的葡萄糖摄取（表2)。更进一步以高脂肪饲料喂养小鼠作为第二型糖尿病动物模型评估腺 嘌呤对血浆葡萄糖浓度调节效果。与控制组的高脂肪饲料喂养小鼠比较，给予腺嘌呤显著 减少高脂肪饲料喂养小鼠的血浆葡萄糖30%以上，并减少血浆三酸甘油酯35%以上，15%以 上的体重减少（实施例3)。这里使用的术语「高血糖」是指一生理状况，其特征为血糖高 于126毫克/分升。这里使用的术语「前期糖尿病」是指一生理状况，其特征为空腹血糖高 于100毫克/分升但低于140毫克/分升。这里使用的术语「胰岛素抵抗」是指一生理状 况，其中全身或组织包括肝脏、骨胳肌、脂肪组织无法对胰岛素反应。这里使用的术语「第二 型糖尿病」亦指非胰岛素依赖型糖尿病或成人发病型糖尿病。是指代谢失调引起的胰岛素 生产不足或胰岛素抵抗，其特征通常为空腹血糖高于140毫克/分升。根据此实施例，腺嘌 呤被证实加速葡萄糖摄取，因此可作为与高血糖有关的生理状况或疾病的有效治疗方式。
[0031] 腺嘌呤于发炎性疾病的治疗 各种AMPK活化剂已被证实于生物体内具抗发炎功能。举例而言， 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR)于小鼠模式已被证实可缓 解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯钠所引起的急性及复发性结肠炎，AICAR治疗显著 降低疾病小鼠的体重减少并减缓发炎反应。此外AICAR对于人类多发性硬化症动物模式 (EAE)有明显的治疗效果，亦降低以脂多醣诱导小鼠肺损伤的严重程度。于本发明中，腺嘌 呤于体外试验中抑制脂多醣诱导的发炎反应：于脂多醣刺激下，经腺嘌呤处理的巨噬细胞 的发炎性细胞激素分泌量，包括肿瘤坏死因子α (TNF-α)、介白素_1β (IL-Ιβ)及介白 素-6 (IL-6)，与控制组相比有显著性减少。腺嘌呤亦减少人类巨噬细胞因脂多醣诱导表现 的环氧化酶-2表现量（实施例4)。于三硝基苯磺酸诱导的发炎性肠病（IBD)小鼠模式中， 给予腺嘌呤治疗组别的结肠发炎性细胞激素，包括肿瘤坏死因子（TNF)、干扰素 γ (INFy) 及介白素（IL-17)均较控制组小鼠显著减少，且挽救体重损失（实施例5)。
[0032] 这里使用的术语「发炎性细胞激素」是指促进系统性发炎反应的细胞激素。这里 使用的术语「发炎性疾病」是指与发炎相关的疾病，包括但不限制于僵直性脊椎炎、关节炎 (骨关节炎、风湿性关节炎、干癣性关节炎）、气喘、动脉粥样硬化、克隆氏症、结肠炎、皮肤 炎、大肠憩室炎、纤维肌痛症、肝炎、激躁性结肠症、系统性红斑性狼疮、肾炎、阿兹海默症、 帕金森式症、溃疡性大肠炎等。近年来，许多报告已证实AMPK是环氧化酶-2上游调控者，可 抑制环氧化酶-2的蛋白质表现。与先前研究相符，发明人发现一新颖AMPK活化剂，腺嘌呤， 可有效抑制环氧化酶-2的蛋白质表现，由此可知腺嘌呤可抑制环氧化酶_2介导的发炎。根 据本发明，腺嘌呤被发现可抑制发炎，因此可作为发炎相关的生理状况或疾病的治疗。
[0033] 腺嘌呤于伤口愈合及疤痕形成 AMPK被认为可促进细胞能动性并加强伤口愈合。一 AMPK活化剂，白藜芦醇，已被证实 可加强手术伤口的愈合。除了伤口愈合外，在愈合过程中减少疤痕的形成一直为现代医学 的首选目标。新生儿伤口愈合不同于成人的伤口愈合，不会伴随疤痕的形成，此间差异在于 环氧化酶-2的活化。于成人的伤口愈合过程，环氧化酶_2活性会经由TGF-beta被提升， 因而导致伤口处前列腺素生产的增加。前列腺素已被证实可促进纤维母细胞增生及胶原蛋 白的形成，此两种因素可导致疤痕形成。因此，抑制环氧化酶-2的活性被认为可有效预防 疤痕形成。于本发明中，腺嘌呤抑制纤维母细胞生长（实施例8)并降低环氧化酶-2的蛋 白质表现。于动物模式中，于伤口处直接施用腺嘌呤不仅可加强伤口愈合并可减少疤痕生 成（实施例9)。依据上述资料，局部施用腺嘌呤可有效加强伤口愈合并防止疤痕形成。 [0034] 神经退化 许多细胞机制的缺陷已被证实与神经退化性疾病有关，包括发炎、细胞内运输、自体吞 噬等。自体吞噬的功能在于移除细胞内失去功能的胞器或蛋白质团块，并且对细胞内平衡 扮演重要角色。许多神经退化性疾病的发病机制涉及细胞内或细胞外蛋白质团块的沉积， 而移除这些蛋白质团块已显示可改善此类疾病的进展。此外，自体吞噬途径受损或移除负 责自体吞噬的蛋白质已被证实导致神经退化。AMPK活化已证实可促进自体吞噬路径。因此， 通过活化AMPK以促进自体吞噬路径可作为预防或控制神经退化性疾病的有效策略。AMPK 活化剂已被证实可经由自体吞噬路径减少类淀粉沉积。每日给予AMPK活化剂-白藜芦醇 可增加阿兹海默症小鼠的寿命。另一 AMPK活化剂-姜黄素亦被证实可作为阿兹海默症治 疗的潜在药物。于本发明中，发明人发现腺嘌呤于神经细胞NeUr〇-2A中显著加强自体吞噬 活性并降低A累积，此外腺嘌呤改善阿兹海默症疾病小鼠的认知功能（实施例6、7)。根据 上述发现，腺嘌呤可作为神经退化性疾病的治疗使用。
[0035] 这里使用的术语「神经退化」是指神经元结构或功能逐渐丧失的情况。神经退化 性疾病是为神经退化的结果，包括但不限制于阿兹海默症、帕金森氏症、汉丁顿舞蹈症、肌 萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓小脑萎缩症、脊髓性肌肉萎缩症等。
[0036] 反应性氧族相关疾病 生物组织中，反应性氧族包括超氧化物自由基、羟基自由基及过氧化氢不断的被产 生，且过量的反应性氧族与许多疾病有关，包括但不限制于：神经组织肌肉无力伴随运动 失调与色素沉积性视网膜炎（NARP)、MELAS症候群、肌抽跃癫痫合并红色褴褛肌纤维症 (MERRF)、Leber遗传性视神经萎缩症（LHON)、KSS症候群、阿兹海默症、帕金森氏症、汉丁 顿舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、弗里德赖希氏共济失调（FA)及老化。许多研究报告 证实AMPK活化剂如AICAR，于高葡萄糖、棕梠酸或白蛋白诱导状况下，可减少反应性氧族产 生。于本发明中，腺嘌呤降低HUVEC细胞中反应性氧族的生产（表6)，因此腺嘌呤可作为反 应性氧族相关的生理状况或疾病的治疗使用。
[0037] 癌症 AMPK活化抑制环氧化酶-2与哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白途径，此二路径为癌细胞 生长的重要机制。基于环氧化酶-2与哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白对癌症的重要性，活化 AMPK以达抑制环氧化酶-2与哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白途径被认为是合理的癌症治疗 策略。事实上，许多研究报告证实AMPK活化剂中断癌症发展，举例而言，phenformin及 metformin于异体移植的癌症小鼠模式被发现抑制乳癌肿瘤发展及生长。于本发明中，腺嘌 呤抑制人类肝癌细胞H印G2、人类乳腺癌细胞MCF7及结肠癌细胞HT29的细胞生长（实施 例11)。腺嘌呤对H印G2、MCF7、HT29的50%生长抑制浓度分别为544. 1，537. 5 and 531. 9 μΜ。于!fep G2移植小鼠模式，长期给予腺嘌呤显著延迟肿瘤生长。根据本发明，以腺嘌呤 活化AMPK的治疗方式，可预防或控制癌症的形成或发展。

【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0039] 实施例1 AMPK活性分析 于小鼠肌肉细胞C2C12、小鼠纤维母细胞3T3、人类肝癌细胞H印G2、人类乳腺癌细 胞MCF7及人类结肠癌细胞HT29人类脐带静脉内皮细胞HUVEC、人类急性单核白血球细 胞株THP1、人类巨噬细胞U937、小鼠微神经胶细胞BV-2、神经母细胞瘤细胞Neur 〇2A及 毛乳突细胞Dermal Papilla进行腺噪呤对AMPK磷酸化影响的分析。细胞以Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)含 10% 胎牛血清（FBS)，4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate 及 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA)于37 ° C、5% CO2环境下培养。3X IO5细胞接种于6-well盘，24小时后以指 定化合物处理细胞30分钟，接着溶解细胞并以西方墨点法进行分析。等量蛋白质以十二烷 基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，接着转印至聚偏氟乙烯膜。转印后的聚偏氟乙烯 膜浸泡至溶于PBS缓冲液的3%牛血清白蛋白60分钟后，分别加入抗磷酸化AMPK (Thr 172) 抗体（1:2000，Cell signaling)、抗AMPK抗体（1:2000，Cell signaling)，于4。C 作 用。16小时后加入对应的二抗于室温下反应1小时。具免疫反应带以冷光受质侦测，并以 底片纪录信号。所得的信号扫描后以TotalLab Quant软件（TotalLab)进行分析。
[0040] 腺嘌呤对AMPK活化的影响统整于表1。于所有测试细胞中，腺嘌呤均显著活化 AMPK。
[0041] 表（1)

【权利要求】
1. 一种用于活化AMPK的化合物，其特征在于，其为腺嘌呤及/或其医药学上可接受的 盐。
2. 权利要求1所述化合物作为制备治疗可被AMPK活化剂改善的疾病或生理状况的药 物的应用。
3. 权利要求1所述化合物作为制备治疗发炎性生理状况或疾病的药物的应用。
4. 权利要求1所述化合物作为制备预防或治疗前期糖尿病、第二型糖尿病、代谢症候 群的一种或其组合的生理状况或疾病的药物的应用。
5. 权利要求1所述化合物作为制备预防或治疗前期糖尿病、第二型糖尿病、代谢症候 群的一种或其组合的生理状况或疾病的药物的应用。
6. 权利要求1所述化合物作为制备预防或治疗阿兹海默症的药物的应用。
7. 权利要求1所述化合物作为制备治疗可被自体吞噬作用改善的疾病或生理状况的 药物的应用。
8. 权利要求1所述化合物作为制备伤口愈合过程抑制疤痕形成的药物的应用。
9. 权利要求1所述化合物作为制备加强伤口愈合的药物的应用。
10. 权利要求1所述化合物作为制备哺乳动物中保护及治疗受活性氧族伤害的细胞的 药物的应用。
11. 权利要求1所述化合物作为制备预防或治疗癌症药物的应用。
【文档编号】A61P17/02GK104510736SQ201310444518
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】邱壬乙, 陈翰民, 郭正宜, 林俊材, 黄纯芳 申请人:华安医学股份有限公司