AMPK抑制剂Compound C在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种AMPK抑制剂Compound C在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用。本发明AMPK抑制剂Compound C可有效促进外周神经髓鞘的形成。
【专利说明】
AMPK抑制剂Compound C在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种AMPK抑制剂Compound C在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]AMPK(Adenosine Monophosphate-activated Protein Kinase)是细胞能量的关键传感器。该蛋白质激酶能够通过感受细胞能量状态来维持真核细胞的ATP生成和消耗的平衡，即能量稳态，它的激活有助于纠正代谢紊乱，使细胞代谢趋向生理平衡，由此成为治疗代谢紊乱和癌症的可能靶点。很多研究表明，AMPK的激活可刺激机体产生ATP，为生理活动提供能量;同时，AMPK的激活可强烈抑制蛋白及脂肪的合成，以减少ATP的消耗。
[0003]髓鞘包裹在神经细胞轴突外面的一层膜，由雪旺细胞或少突胶质细胞组成，其生理作用表现为绝缘作用，防止神经电冲动从神经元轴突传递至另一神经元轴突。地震，车祸，事故等各种自然灾害或意外都有可能造成外周神经损伤，因此，在我们的日常生活中，外周神经损伤是一种常见病症。神经损伤后髓鞘的形成是神经功能得以恢复的重要保证。大量研究表明，髓鞘的主要组分为脂类及蛋白分子。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种可促进外周神经髓鞘形成的AMPK抑制剂CompoundC在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用。
[0005]本发明的技术解决方案是:
[0006]—种AMPK抑制剂Compound C在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用。
[0007]本发明AMPK抑制剂CompoundC可有效促进外周神经髓鞘的形成。
【附图说明】
[0008]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0009]图1是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)基因表达分析示意图。其中上方的线为实验组大鼠数据;下方的线为对照组大鼠数据。***P〈0.001, Student ’ s t test分析。
[0010]图2是固醇调节元件结合蛋白-2(SREBP-2)基因表达分析示意图。其中上方的线为实验组大鼠数据;下方的线为对照组大鼠数据。***P〈0.001, Student ’ s t test分析。
[0011]图3是大鼠出生后7天(P7)坐骨神经组织是p-ACC、ACC、SERBP2及HMGCR蛋白表达分析示意图。
[0012]图4是对图3中的蛋白表达定量分析结果示意图Vehicle:对照组，ComC:实验组。**p〈0.01 ,Student’s t test分析。
[0013]图5是大鼠坐骨神经组织胆固醇含量测定示意图Vehicle:对照组，ComC:实验组。*p〈0.05，Student’s t test分析。
[0014]图6是大鼠坐骨神经组织蛋白表达分析示意图。
[0015]图7是大鼠坐骨神经组织蛋白表达(图6)定量分析。*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，***ρ〈
0.001,Student's t test分析。
[0016]图8是大鼠坐骨神经电镜照片示意图Vehicle:对照组，ComC:实验组。
[0017]图9是大鼠坐骨髓鞘厚度分析示意图。Vehicle:对照组，ComC:实验组。*p〈0.05，Student’s t test分析。
【具体实施方式】
[0018]一种AMPK抑制剂Compound C在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用。
[0019]一、实验步骤
[0020]1、动物处理
[0021]实验材料为刚出生的SD大鼠，向每只大鼠皮下注射Compound C(6_[4_[2-(4-Morpholinyl )ethoxyJphenyl ]-3-phenyl-pyrazo1[ 1,5_a]pyrimidine)，以下简称为ComC，剂量为50mg/kg体重/天，溶剂为二甲基亚砜(DMS0)。对照大鼠注射等剂量的DMSO。在处理后的不同天数收集大鼠坐骨神经组织用于后续分析。每组实验动物6只，实验重复三次。
[0022]2、坐骨神经组织胆固醇含量的测定
[0023]胆固醇含量的测定利用Sigma-Aldr ich的试剂盒(MAK043)进行。取I Omg坐骨神经组织置于200μ1匀浆液(氯仿:异丙醇:IGEPAL CA-630 = 7: 11:0.1)中，用组织匀浆进行匀浆，将所得匀浆液进行离心(13000rpm，10分钟)，去除不溶物质。上清有机相转移到一个新的小管，50°C下干燥去除氯仿，并用真空干燥器将去除剩余溶剂。用胆固醇测定液(试剂盒所附)溶解干燥所得的脂类，进一步测定参照试剂盒操作步骤进行。
[0024]3、坐骨神经RNA提取及基因表达检测
[°°25] 使用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取坐骨神经组织的RNA，再经cDNA合成试剂盒(B1-Rad公司产品)转录成cDNA。用SYBR Green Supermix(B1_Rad公司产品)来做基因表达分析，仪器为iQ5Multicolor Real-Time PCR Detect1n System(B1_Rad公司产品)。结果2- △ Ct方法计算mRNA水平。以18S持家基因来校准mRNA的水平。所使用的引物序列如下:
[0026]18S rRNA正向引物:5’-AGT CCC TGC CCT TTG TAC ACA-3，;
[0027]18S rRNA负向引物:5，-CGT TCC GAG GGC CTC ACT-3，;
[0028]Hmgcr正向引物:5，-AGC TTG CCC GAA TTG TAT GTG-3，；
[0029]Hmgcr负向引物:5;-TCT GTT GTG AAC CAT GTG ACT TC-3，.
[0030]Srebp2正向引物:5’-GCA GCA ACG GGA CCA TTC T_3，;
[0031]Srebp2负向引物:5’-CCC CAT GAC TAA GTC CTT CAA CT-3，.[0032 ] 4、坐骨神经蛋白提取及检测
[0033]动物组织样品裂解液配方:25mM Tris-HCl,pH 7.4； 10mM NaF；50mM Na4P207 ；1mM Na3V04；1mM EGTA；1mM EDTA；I%NP-40；10yg/ml Leupeptin；10yg/ml Aprotinin；2mM PMSF；20nM Okadaic acid。用台式匀浆器(Polytron，PT2100)匀浆，样品于4°C旋转裂解I小时后离心(13000印111，4°0201]1；[11，离心后小心去除上层脂质，其余上清转至另一离心管并再次离心。这一过程重复2次以彻底去除蛋白样品中的脂质。样品蛋白含量用蛋白测定试剂盒测定，根据所得结果将所有样品的蛋白浓度调至相同水平，加入上样缓冲液，混匀后于100°C煮5min，冷却至室温用于Western blot分析。
[0034]将上述步骤所得的样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并将胶上蛋白转至PVDF膜。转膜结束后的PVDF膜用含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-buffered salinesolut1n/Tween)缓冲液室温封闭I小时。封闭后的PVDF与一抗共孵过夜(4°C)。与一抗作用结束后，用TBST洗PVDF膜三次，再与二抗室温作用I小时。二抗作用结束后用TBST洗三次。最后PVDF膜用化学发光反应体系(chemiluminescence assay system，Roche)反应，并曝光至X胶片(Kodak)。各蛋白表达水平定量用软件Quantity-One(B1-Rad)分析。所有抗体均购自于Cell Signaling Technology公司。
[0035]5、坐骨神经电镜观察
[0036]各组随机抽取3只动物取坐骨神经作为电镜标本。动物在深度麻醉下，经心脏依次灌注0.85%氯化钠溶液和固定液(1%多聚甲醛+1.25%戊二醛)。灌注固定后，取坐骨神经组织并修切成电镜标本大小(1.5mm X Imm x 1mm)，将标本浸入4%戊二醛溶液进行前固定，并用1%锇酸进行后固定，醋酸铀块染，梯度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片定位，超薄切片(70nm，横切)，常规枸橼酸铅复染，透射电镜观察。所得照片在图象分析系统上测量有髓神经直径和轴突直径，以轴突直径/有髓神经直径数值(g-rat1)衡量髓鞘厚度。
[0037]二、实验结果
[0038]为研究抑制AMPK是否可促进外周神经髓鞘的形成，我们用AMPK的抑制剂CompoundC(6-[4-[2-(4-Morpholinyl)ethoxy]phenyl]-3-phenyl-pyrazolo[I，5_a]pyrimidine)处理刚出生的大鼠(剂量为50mg/kg/day，皮下注射)，在处理后的不同时间点(出生后2天、5天、7天和11天，图中分别标注为P2、P5、P7、P11)收集坐骨神经组织用于后续分析。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)和固醇调节元件结合蛋白-2(SREBP2)是脂肪合成过程中的两个关键基因，我们结果表明Compound C(ComC)处理可有效激活这两个基因的表达(图1;图2)。同时，我们也检测了这两个基因的蛋白表达水平。结果表明ComC处理可显著促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCRMP固醇调节元件结合蛋白-2 (SREBP2)这两个基因的蛋白水平(图
3)。此外，ACC是AMF1K信号通路的下游分子，我们结果表明ComC处理可降低磷酸化ACC(p-ACC)和ACC的表达(图3)。对上述结果进行蛋白定量分析，结果表明p-ACC水平显著下降，SREBP2和HMGCR的表达则显著上升(图4)。胆固醇是髓鞘的一个重要组分，其在坐骨神经中的水平在ComC处理下显著升高(图5)。除脂肪合成被ComC激活外，蛋白的合成也被激活。如图6所示，蛋白合成的负调控因子(p-AMPK，p-TSC2，p-Raptor)在ComC作用下均呈下降趋势；而蛋白合成的正调控因子(p-P70S6K，p-4E-BPl)则呈上升趋势。对上述蛋白表达差异进行定量分析，结果表明p-AMPK，p-TSC2，p-Raptor蛋白表达在ComC处理下均显著下降，而p-P70S6K，p-4E-BPl均显著升高(图7)。在接下来的实验中，我们用电镜观察了坐骨神经的超微结构，结果显示ComC处理的大鼠坐骨神经髓鞘套厚度较对照组变厚(图8)。定量数据也表明ComC处理可促进新生大鼠坐骨神经髓鞘的厚度(图9)。以上结果说明抑制AMPK抑制剂ComC可加速外周神经髓鞘的形成。
【主权项】
1.一种AMPK抑制剂Compound C在制备激活坐骨神经髓鞘形成制剂中的应用。
【文档编号】A61K31/5377GK105920015SQ201610301629
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】孙诚, 刘晓宇
【申请人】南通大学