玉米用选择体系的制作方法

专利名称：：玉米用选择体系的制作方法
技术领域：
：本发明涉及以D-丙氨酸或D-丝氨酸选择为基础将DNA整合进玉米(Zeamays)植物基因组中的改良方法。优选转化由农杆菌(Agrobacterium)介导。相关领域描述在过去十年中，通过重组DNA技术将基因从大范围的生物转移至农作物成为可能。该进步提供了大量机会来改良植物对害虫、疾病和除草剂的抗性并且修饰生物合成过程以改变植物产品的质量。已经有许多方法尝试转化单子叶植物。"生物射弹"是最广泛使用的转化方法之一。在"生物射弹，，(微粒介导的DNA递送)方法中，微粒颗粒用DNA包被，并通过机械装置加速到足够穿透植物细胞壁和细胞核的速度(WO91/02071)。外源DNA掺入到宿主DNA并产生经转化的细胞。"生物射弹，，方法存在许多变通方案(Sanford19卯；Fromm1990;Christou1988;Sautter1991)。尽管农杆菌介导的基因转移广泛应用于双子叶植物，但是适应单子叶植物中的应用长期令人失望。ffiei等(1994)的尝试说明转基因稻植物可以根据农杆菌介导的转化获得，但是使用的具体细菌菌株和细菌载体的选择对于成功获得转基因是关键性的。Ishida等(1996)的文章指出，可能通过将不成熟胚与根瘤农杆菌(A.tumefaciens)共培养来高效转化玉米。在稻和玉米转化的报导中，使用含有virB、virC和virG基因额外拷贝的超二元载体pTOK233达成高效转化。WO95/06722和EP-A1672752公开了使用不成熟胚的盾片与根瘤农杆菌转化单子叶植物的方法。EP-A10709462描述了用于转化单子叶植物的方法，其中改良在于在没有选择装置的共培养步骤后包含一天的恢复周期。已报导用于转化单子叶植物的大量其他方法，包括例如"花粉管方法"(WO93/18168;Luo1988)、将DNA大量注射进花分蘖中(Du1989;DelaPena1987)、将农杆菌注射进入发育中的颖果(WO00/63398)和在DNA溶液中组织培养种子(T6pfer1989)。WO94/00583中公开了在胚胎发生开始时直接将外源DNA注射进受精的植物胚珠中。用于玉米的所有转化方法都是低效的，并需要存在将经转化和未转化的细胞和植物区分开的选择性标记。主要使用阴性选择标记，其赋予针对植物毒剂(例如除草剂或抗生素)的抗性。迄今为止玉米中使用的阴性选择标记主要限制于膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT;也称作Bialophos⑧抗性；bar;deBlock1987;EP0333033;US4,975,374)、5-烯醇丙酮基莽草酸國3-磷酸合酶(EPSPS，其赋予对Glyphosate(N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性(Shah1986)，以及磺胺脲和/或咪唑啉酮失活乙酰乳酸合酶(例如X112ahas基因，US6，653，529;突变的XA17ahas基因，Bernnasconi1995、US4，761，373;US5,304,732;Anderson&Gregeson1989;Currie1995;Newhouse1991)。用多于一种构建体对玉米植物多次连续转化(对一些更复杂的重要性状和基因叠加是必需的)是复杂的，因为适当选择标记的可用性有限。由于更严格调节的需要和环境考虑^f吏得抗生素抗性标记(例如潮霉素或卡那霉素抗性)成为较不可行的选项，因此该情况开始变得复杂起来。备选的选择标记体系如基于D-氨基酸代谢酶(例如D-M酸脱水酶或氧化酶)的体系最近已被广泛描述(WO03/060133)。然而，迄今为止这类体系用于玉米中的应用和/或优化未被描述。因此，本发明的目的是提供基于D-氨基酸选择的改良的、有效的玉米植物转化方法。该目的通过本发明达成。发明概述本发明的第一个实施方案涉及用于产生转基因玉米植物的方法，其包括步骤a.向玉米细胞或组织中引入DNA构建体，所述DNA构建体包含i)至少一个第一表达构建体，其包含泛素(组成型？)启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨i)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状，和b.在选择性培养基上将步骤a)所述玉米细胞或组织培养至少5天的时间段，所述培养基包含总浓度约1mM到100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸和/或其f斤生物，和c.将步骤b)的所述玉米细胞或组织转移至再生培养基并再生和选择含有所述DNA构建体的玉米植物。优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(EC4.3.1.18)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)和D-丙氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.21)。更优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(EC4.3丄18)和D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)。对本发明的方法而言，进一步更优选能够代谢D-丝氨酸的酶选自i)SEQIDNO:2编码的大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶，和ii)与SEQIDNO:2编码的序列具有相同酶活性和至少80%同一性的ii)由能够与SEQIDNO:1所述序列的互补序列杂交的核酸序列编码的酶，其中在含有从约1mM到100mM浓度D-丝氨酸的培养基上进行选择。对本发明的方法而言还更优选能够代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选白i)SEQIDNO:4编码的瘦弱红酵母(Rhodotorulagracilis)D-氨基酸氧化酶，和ii)酶，其与SEQIDNO:4编码的序列具有相同的酶活性和至少80%的同一性，和iii)酶，其由能够与SEQIDNO:3所述序列的互补序列杂交的核,其中在含有总浓度从约1mM到100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸培养基上进行选择。与能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶有效连接的启动子是本发明的重要特征。优选泛素启动子是单子叶植物泛素启动子，更优选玉米启动子。进一步更优选泛素启动子选自a)包含SEQIDNO:5所述序列的序列，和b)序列，其包含SEQIDNO:5所述序列的至少50个连续碱基对的至少一个片段，并在玉米中具有启动子活性，c)序列，其包含与SEQIDNO:5所述序列具有至少60。/。同一性的序列，并在玉米中具有启动子法性，d)序列，其包含与SEQIDNO:5所述序列杂交的序列，并在玉米中具有启动子活性。SEQIDNO:5所述的序列是玉米泛素启动子的核心启动子。在一个优选的实施方案中，不仅使用启动子区作为转录调节序列，而且使用5，-非翻译区和/或内含子。更优选使用跨越启动子、5，-非翻译区和玉米泛素基因的第一个内含子的区域，进一步更优选SEQIDNO:6所述区域。因此，在另一优选的实施方案中，本发明方法中使用的泛素启动子选自a)包含SEQIDNO:6所述序列的序列，和b)序列，其包含SEQIDNO:6所述序列的至少50个连续碱基对的至少一个片段，并在玉米中具有启动子活性，c)序列，其与SEQIDNO:6所述序列具有至少60%的同一性，并在玉米中具有启动子活性，d)序列，其包含与SEQIDNO:6所述序列杂交的序列，并在玉米中具有启动子活性。在本发明一个优选的实施方案中，使用约3mM到约15mM的D-丙氨酸，或约7mM到约30mM的D-丝氨酸进行步骤b)的选择。去分化条件下的总选择时间从约3周到约4周。更优选地，分两步进行步骤b)的选择，使用约5到20天的第一选择步骤，然后将存活的细胞或组织转移至第二选择性培养基上再选择5到20天，所述第二选择性培养基与所述第一选择性培养基具有基本相同的组成。可使用多种方法将本发明的DNA构建体引入玉米植物中。优选地，所述DNA构建体的引入由选自以下的方法介导才艮瘤菌科(Rhizobiaceae)介导的转化和粒子轰击介导的转化。更优选地，转化由选自下列的根瘤菌科细菌介导卸甲的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛才艮农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)细菌菌林。在另一优选的实施方案中，土传细菌是毛根农杆菌菌林K599(NCPPB2659)的卸甲菌林变体。这类菌林描述于2004年9月2日提交的美国临时专利申请No.60/606789中，其在本文完整引入作为参考。在本发明一个优选的实施方案中，本发明的方法包括以下步骤a.分离玉米植物的不成熟胚，和b.将所述分离的不成熟胚与包含至少一个转基因T-DNA且属于根瘤菌科属的细菌共培养，所述不成熟胚未进行去分化处理，所述T-DNA包含i)至少一个第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，ii)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状，以及c.将共培养的不成熟胚转移至恢复培养基，所述恢复培养基缺乏毒害植物的有效量的D-丝氨酸或D-丙氨酸，和d.诱导胚性愈伤组织形成，并在培养基上选择转基因愈伤组织，所述培养基包含i.有效量的至少一种生长素化合物，和ii.总浓度从约1mM到100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，以及e.从所述转基因愈伤组织再生并选择含有转基因T-DNA的植物。在所述优选的方法中，使用约3mM到约15mM的D-丙氨酸或约7mM到约30mM的D-丝氨酸进行步骤d)的选择。更优选地，分两步进行步骤d)的选择，使用约5到20天的第一选择步骤，然后将存活的细胞或组织转移至第二选择性培养基上再选择5到20天,所述第二选择性培养基与所述第一选择性培养基具有基4^目同的组成。在所述优选的方法中，步骤c)的恢复培养基优选包含i.有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻止土传细菌的生长，和ii.从约1g/1到约10g/l浓度的L-脯氨酸，和iii.从约1jiM到约50pM浓度的硝酸银，iv.有效量的至少一种生长素化合物。在步骤c)的所述优选恢复培养基中，有效量的生长素化合物优选相当于约0.2mg/l到约6mg/1浓度的2，4-D。优选地，共培养使用的培养基包含从约1jtM到约10nM的硝酸银和/或(优选"和")从约50mg/L到约1,000mg/L的L-半胱氨酸。实际上任何玉米植物可以作为耙材料的来源用于转化。优选所述玉米植物、不成熟胚、细胞或组织选自下述玉米植物近交、杂种、近交之间的Fl、近交和杂种之间的Fl、近交和自然传粉变种之间的Fl、市售Fl变种、前述变种和前述任何后代之间杂交或自花传粉的任何F2。更优选地，所述玉米细胞或组织或所述不成熟胚分离自(HilIAxA188)杂种与近交系的杂交，所述近交系选自其代表性种子已以专利保藏号(PatentD印ositDesignation)PTA國6170和PTA國6171保藏于AmericanTypeCultureCollection(美国典型培养物保藏中心)的近交系。本发明的方法，特别是与D-氨基酸氧化酶一起使用时，可以与标记切除技术有利地结合，所述技术利用D-氨基酸氧化酶的二元功能特性。因此，本发明的一个实施方案涉及方法，所述方法包括步骤i)用第一DNA构建体转化玉米植物，所述第一DNA构建体包含a)至少一个第一表达构建体，所述第一表达构建体包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码D-氨基酸氧化酶，其中所述第一表达盒侧接允许特异缺失所述第一表达盒的序列，和b)至少一个第二表达盒，所述表达盒适合赋予所述植物有农业价值的性状，其中所述第二表达盒不位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间，和ii)用毒害植物浓度的第一化合物处理步骤i)的所述经转化玉米植物细胞，并选择其基因组中包含所述第一DNA构建体的植物细胞，所述第一化合物选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物，所述第一DNA构建体通过表达所述D-氨基酸氧化酶赋予所述经转化的植物细胞针对所述第一化合物的抗性，和iii)诱导从所述经转化植物细胞的基因组中缺失所述第一表达盒，并用对仍然包含所述第一表达盒的植物细胞有毒的浓度的第二化合物处理所述植物细胞，从而选择包含所述第二表达盒但是缺乏所述第一表达盒的植物细胞，所述第二化合物选自D-异亮氨酸、D-缬氨酸及其衍生物。优选泛素启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。本发明的另一实施方案涉及重组表达构建体，所述重組表达构建体包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶，其中所述启动子相对于所述酶编码序列是异源的。优选泛素启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。本发明的另一实施方案还涉及DNA构建体，所述DNA构建体包含i)至少一个第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，ii)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状。优选地，泛素启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。优选所述DNA构建体包含允许标记缺失的特征，优选所述构建体包含a)第一表达盒，其包含与泛素启动子有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其中所述第一表达盒侧接允许特异缺失所述第一表达盒的序列，和b)至少一个第二表达盒，所述表达盒适合赋予所述植物有农业价值的性状，其中所述第二表达盒不位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间。更优选地，允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列选自下述序列a)以下述方式排列的针对序列特异性重组酶的重组位点所述侧翼重组位点之间的重组导致之间的序列从基因组中缺失，和b)同源性序列A和A，，其具有足够的长度和同源性从而确保A和A，之间的同源重组，并具有方向，A和A，之间重组时所述方向会导致之间的序列从基因组中缺失。进一步更优选地，所述构建体(用于标记缺失)包含针对序列特异性核酸酶的至少一个识别位点，所述位点位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间。本发明的其他实施方案涉及toa载体，其包含本发明任何表达构建体或DNA构建体，含有本发明表达构建体、DNA构建体或载体的转基因细胞或非人生物。优选所述转基因细胞或非人生物是植物细胞和/或所迷生物是植物，更优选是玉米植物细胞和/或玉米植物。因此本发明的另一实施方案涉及转基因的、能育的玉米植物，其包含稳定整合进其基因组中的DNA构建体，所述DNA构建体包含a)至少一个第一表达构建体，其包含启动子和与其有效连接的核^列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，b)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状。优选地，用于转化的玉米植物通过将(HilIAxA188)杂种与近交系杂交获得，所述近交系选自其代表性种子已以专利保藏号PTA-6170和PTA-6171保藏于美国典型培养物保藏中心的近交系。优选泛素启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。本发明的其他实施方案涉及本发明玉米植物的后代植物，从任何上述本发明玉米植物生产的杂种和近交植物，和所述玉米植物的部分。优选的部分选自组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、种子、小孢子和营养性部分。本发明的方法和组合物可有利地用于基因叠加方法中(即用于连续多次转化)。因此，本发明的另一实施方案涉及至少两个DNA构建体连续转化进玉米植物的方法，所述方法包括步骤a)用第一构建体转化，所述构建体至少包含一个表达构建体，所述表达构建体包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶，和b)用第二构建体转化，所述构建体包含第二选择标记基因，所述第二选择标记基因不能赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。优选所述第二标记基因赋予针对至少一种化合物的抗性，所述化合物选自phosphinotricin、N-膦酰甲基甘氨酸、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂。更优选标记基因选自XI12ahas突变基因和XA17ahas突变基因。本发明还包括通过这类方法提供的玉米植物。因此，另一实施方案涉及玉米才直物，所述玉米植物包含a)第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，b)用于选择标记基因的第二表达构建体，其不赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。另外，下文提供的dsdA和dao基因也可用于连续转化。因此，本发明的另一实施方案涉及用于将至少两个DNA构建体连续转化进玉米植物的方法，所述方法包括步骤a)用第一构建体转化并用D-丝氨酸选择，所述构建体包含表达构建体，所述表达构建体包含植物启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码dsdA酶，和b)用第二构建体转化并用D-丙氨酸选择，所述构建体包含表达构建体，所述表达构建体包含植物启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核^f列编码dao酶。本发明的其他目标涉及本发明玉米植物的后代植物，由所述后代植物生产的杂种植物和近交植物，和前述玉米植物的部分。优选的部分选自组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、种子、小孢子和营养性部分。附图描述图1AD-丙氨酸抑制切开的玉米不成熟胚萌发的作用。图1BD-丝氨酸抑制切开的玉米不成熟胚萌发的作用。一般定义国际专利申请WO03/004659(RECOMBINATIONSYSTEMSANDAMETHODFORREMOVINGNUCLEICACIDSEQUENCESFROMTHEGENOMEOFEUKARYOTICORGANISMS)、WO03/060133(SELECTIVEPLANTGROWTHUSINGDAMINOACIDS)、国际专利申请PCT/EP2005/002735、国际专利申请PCT/EP2005/002734、2004年9月23日提交的US临时专利申请No.60/612,432中所使用和描述的教导、方法、序列等引入本文作为参考。应当理解本发明不限于如此所述的任何具体的方法、方案、细胞系、植物种或属、构建体和试剂。还应当理解本文使用的命名法仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求书限制。必须注意本文中和所附的权利要求书中所使用的单数形式包括复数含义，除非上下文以其他方式明确指出。因此，例如关于"载体"是指一种或多种载体，并包括本领域技术人员已知的其等价物，等等。术语"约"在本文中使用是指近似地、粗略地、左右或在范围内。当术语"约"与数值范围结合使用时，其通过扩大所公开数值的上限和下限修饰该范围。通常，术语"约"在本文中用于修饰所述值之上或之下的数值，变-化为之上或之下(高于或低于)百分之二十，优选百分之十，更优选百分之五。如本文所用的，词语"或"是指具体列表中任一成员，也包括该列表成员的任意组合。"有农业价值的性状，，包括植物生物中的任何表型，所i^型对于食物生产或食品(包括植物部分和植物产品)是有用的或有利的。非食物农产品如纸等也包括在内。有农业价值性状的部分列表包括抗虫性，活力，发育时间(收获时间)，提高的营养含量，新颖的生长模式、味或颜色，盐、热、旱和冷耐受性等等。优选地，有农业价值的性状不包括可选择标记基因(例如编码除草剂抗性或抗生素抗性的基因，其仅用于便于检测或选择所转化的细胞)、导致产生植物激素的激素生物合成基因(例如仅用于选择的生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)或报道基因(例如萤光素酶、葡糖酪酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)等等)。这类有农业价值的重要性状可包括改善的抗虫性(例如Melchers2000)，活力，发育时间(收获时间)，提高的营养含量，新颖的生长模式、味或颜色，盐、热、旱和冷耐受性(例如Sakamoto2000;Saijo2000;Yeo2000;Cushman2000)等等。技术人员会理解存在大量多核苷酸，从它们中选择来赋予这些有农业价值的性状和其他有农业价值的性状。本文使用术语"JL^酸序列"是指一系列代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词语。氨基酸在本文可以通过它们通常的已知三字母符号或由IUPAC國IUBBiochemicalNomenclatureCommission(IUPAC画IUB生物化学命名委员会)推荐的单字母符号来表示。类似地，核苷酸可以通过它们通常接受的单字母代码来表示。本文使用的缩写是是氩基酸的常规单字母代码A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸盐、谷氨酸；F,苯丙氨酸；G,甘氨酸；H,组氨酸；I，异亮氨酸；K,赖氨酸；L,亮氨酸；M，甲硫氨酸；N,天冬酰胺；P,脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R,精氨酸；S,丝氨酸；T,苏氨酸；V,缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z,谷氨酰胺或谷氨酸(参阅L.Stryer，Biochemistry,1988，W.H.FreemanandCompany,NewYork)。本文在^J^酸序列中使用字母"x"可以表示任何氨基酸残基。术语"核酸，，是指单链或双链、有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，及其多聚体或杂交体。如本文所用的，短语"核酸序列"是指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词语的连续列表。在一个实施方案中，核酸可以是"探针"，其为相对短的核酸，通常少于100个核苷酸长。核酸探针通常从约50个核苷酸长到约10个核苷酸长。核酸的"靶区"是指被鉴定为感兴趣的核酸部分。核酸的"编码区"是指当位于适当调节序列调控下时以序列特异的方式,皮转录和翻译，以产生特定多肽或蛋白质的核酸部分。编码区被指为编码此类多肽或蛋白质。除非另有说明，具体的核酸序列也暗含其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语"核酸"在本文中与"基因"、"cDNA"、"mRNA"、"寡核苷酸"和"多核苷酸"可互换使用。术语"目的核苷酸序列"是指任何核苷酸序列，其操作可以被本领域普通技术人员认为是对任何原因所期望的(例如赋予改良的品质)。这类核苷^列包括，但不限于结构基因(例如报道基因、选择标记基因、癌基因、抗药性基因、生长因子等)的编码序列，和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列(例如启动子序列、多腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。目的核酸序列可以优选编码有农业价值的性状。术语"反义，，理解为是指具有与靶序列互补的序列的核酸，例如信使RNA(mRNA)序列，其表达的封闭被认为是由与耙序列杂交引起的。术语"有义"理解为是指具有与耙序列同源或相同的序列的核酸，例如与蛋白质转录因子结合的序列和参与给定基因表达的序列。根据优选的实施方案，核酸包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。本文使用术语"互补的，，或"互补性"参考与碱基配对原则相关的核苷酸序列^f吏用的。例如。序列5'-AGT-3'与序列5，-ACT-3，互补。互补性可以是"部分"或"全部"的。"部分"互补性是根据碱基配对原则其中一个或多个核酸碱基不匹配。核酸之间的"全部"或"完全"互补性是指按照碱基配对原则其中各个和每个核酸碱基与另一碱基匹配。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有明显的作用。本文使用的核酸序列的"互补序列"是指其核酸与所述核酸序列的核酸显示完全互补性的核苷酸序列。术语"基因组"或"基因组DNA"是指宿主生物的可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包括核DNA(也称作染色体DNA)，还包括质体(例如叶绿体)和其他细胞器(例如线粒体)的DNA。优选地，术语基因组或基因组DNA是指核的染色体DNA。术语"染色体DNA"或"染色体DNA序列"理解为与细胞周期状态无关的细胞核基因组DNA。因此，染色体DNA可以被组织为染色体或染色单体，它们可以是浓缩的或解螺旋的。进入染色体DNA的插入片段可以通过本领域已知的多种方法证明和分析，例如聚合酶链式反应(PCR)分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。优选地，术语"分离的"涉及核酸使用时(如在"分离的核酸序列"中)是指从其天然来源中通常与其结合的至少一个杂质核酸中被鉴定并分离的核酸序列。分离的核酸是以与其天然存在的形式或环境不同的形式或环境中存在的核酸。相反，未分离的核酸是以其天然存在的状态被发现的核酸，如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(例如基因)被发现在宿主细胞染色体中与邻近的基因接近；RNA序列(如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)被l现在细胞中是与大量其他mRNA的混合物，所述其他mRNA编码大量蛋白质。然而，通过举例的方式，包含SEQIDNO:l的分离的核酸序列包括细胞中通常包含SEQIDNO:l的这类核酸序列，其中所述核酸序列位于与天然细胞中不同的染色体内或染色体外位点，或者另外侧接是与天然发现的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链的形式存在。当使用分离的核i^f列表达蛋白质时，核i^f列最少可包含至少一部分有义或编码链(即核酸序列可以是单链的)。或者，其可包含有义和反义链二者(即核酸序列可以是双链的)。本文使用术语"纯化的，，是指从其天然环境中取出的分离的或独立的分子(其为核酸或^J^^列)。因此"分离的核酸序列"是纯化的核,歹'J。"基本纯化的"分子是指至少60%不含，优选至少75%不含，更优选至少90%不含与它们天然结合的其他成分。"多核苷酸构建体"是指至少部分通过重组方法产生的核酸。术语"DNA构建体"是指由脱氧核糖核苷酸组成的多核苷酸构建体。构建体可以是单链的或优选是双链的。构建体可以是环状或线性的。技术人员熟知获得DNA构建体之一的多种方法。可通过例如Maniatis1989、Silhavy1984和Ausubel1987中所述的常规重组和克隆技术制备构建体。就生物、多肽或核酸序列而言，术语"野生型"、"天然"或"天然来源的"是指所述生物是天然存在的，或可来自至少一种天然存在的未纟iLA改变、突变或以其他方式操作的生物。术语"外源基因"是指通过实验操作被引入细胞基因组中的任何核酸(例如基因序列)，其可包括所述细胞中存在的基因序列，只要被引入的基因相对于天然存在的基因而言含有一些修饰(例如点突变、可选择标记的存在等)即可。术语"异源核酸序列"或"异源DNA"可交换使用，是指与另一核酸序列连接或被操作而成为连接的核苷酸序列，所述另一核酸序列与所述核苷酸序列天然不相连或天然中在不同位置相连。异源DNA对其被引入的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞。尽管并非必须，但是通常这类异源DNA编码下述RNA和蛋白质，所述RNA和蛋白质通常不由其被表达进入其中的细胞产生。在以下情况下认为启动子、转录调节序列或其他遗传元件相对于另一序列(例如编码标记序列或am农业相关性状)是"异源的"即如果所述两个序列在其天然环境中不结合或不同结合的有效连接。优选地，所述序列在其天然环境中不有效连接(即来自不同的基因)。最优选所述调节序列与在其天然环境中不与其相邻的核酸共价连接或相邻。本文使用术语"转基因"是指任何核^列，其被引入细胞基因组中或通过人为实验操作被操作。优选所述序列产生与天然存在的生物不同的基因组(例如如果对所述生物是内源的，则所述序列被引入与其天然位点不同的位点，或其拷贝数被提高或降低)。转基因可以是"内源DNA序列"、"外源DNA序列"(例如外源基因)或"异源DNA序列"。术语"内源DNA序列，，是指核苷酸序列，所述核苷酸序列在其被引入的细胞中天然存在，只要其相对于天然存在的序列不含有一些修饰(例如点突变、可选择标记基因的存在等)即可。关于细胞或生物(例如涉及玉米植物或植物细胞时)使用术语"转基因的"或"重组的"是指下述细胞或生物，其含有转基因或其基因组通过引入转基因被改变。转基因生物或组织可包含一个或多个转基因细胞。优选生物或组织基本上由转基因细胞组成(即所述生物或组织中多于80%，优选卯%，更优选95%,最优选99%的细胞是转基因的)。"重组多肽"是在序列上与天然存在的多肽有至少一个氨基酸残基差异的非天然存在多肽。用于生产所述重组多肽和/或核酸的优选方法可包括直接或非直接i秀变、DNA混编或循环重组(recursiverecombination)的其他方法。关于核酸使用术语"同源性"或"同一性"是指互补性程度。两个核酸之间的同源性或同一性理解为表示在各种情况下贯穿序列整个长度的核^列同一性，其通过比较计算，所述比较借助于程序算法GAP(WisconsinPackageVersion10.0,UniversityofWisconsin,GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,USA),参数如下设定空位权重12长度权重4平均匹配2,912平均错配:-2，003例如，核酸水平上与序列SEQIDNO:1具有至少95%同源性(或同一性)的序列理解为表示这样的序列，即使用上述参数设定通过上述算法与序列SEQIDNO:1比较时，该序列具有至少95%的同源性。可存在部分同源性(即少于100%的部分同一性)或完全同源性(即100%的完全同一性)。本文使用术语"杂交"包括"使核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何方法"(Coombs1994)。杂交和杂交强度(即核酸之间的结合强度)受这类因素影响，如核酸之间的互补性程度、所涉及条件的严格、所形成杂交物的Tm，和核酸中的G:C比例。本文使用术语"Tm"是指"解链温度"。解链温度是一群双链核酸分子的一半解离为单链的温度。计算核酸Tm的等式是本领域公知的。如标准参考文献所指出的，当核酸处于1MNaCl的含水溶液中时，Tm值的简单估计可以通过等式Tm=81.5+0.41(%G+C)来计算(参阅例如NucleicAcidHybridization(1985)中，Anderson和Young，QuantitativeFilterHybridization).其他的参考文献包括更复杂的计算，其将结构以及序列特性计入Tm的计算中。高严格洗涤条件的实例是72。C下0.15MNaCl中15分钟。严格洗涤条件的实例是65°C下0.2xSSC中洗涤15分钟(参阅Sambrook下文中SSC緩冲液的描述)。通常，高严格洗涤之前是低严格洗涤，以去除背景探针信号。用于例如多于100个核苷酸的双链体的中严格洗涤的实例是45'C下lxSSC中15分钟。用于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是40。C下4xSSC到6xSSC中15分钟。对短探针(例如约10到50核苷酸)而言，严格条件通常涉及pH7.0到8.3下少于约1.5M的盐浓度，更优选约0.01到1.0M的Na离子浓度(或其他盐)，温度一般为至少约30°C，对长揮:针(例如>50个核苷酸)而言至少约60'C。严格条件也可通过添加去稳定剂如甲酰胺来达成。一般地，在具体的杂交测定中信噪比是对无关探针所观察到的信噪比的2倍(或更高)表示检测到特异杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸编码的蛋白质基本同一，则它们仍然是基本同一的。这发生于例如使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个拷贝的核酸时。选择非常严格的条件为等于具体探针的Tm。在Southern或Norhtern印迹中的滤纸上，用于具有大于100个互补残基的互补核酸杂交的高度严格条件的实例是50%甲酰胺，例如在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中37。C下杂交，和在60到65。C下用O.lxSSC洗涤。示范性的低严格条件包括用30%到35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠)的緩冲溶液在37。C下杂交，和在50。C到55。C下在lx到2xSSC(20xSSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示范性的中严格条件包括在40%到45。/。的甲酰胺、1.0MNaCl、l。/oSDS中在37。C下杂交，和在0.5x到lxSSC中在55。C到60'C下洗涤。关于杂交条件使用术语"等价的"，即涉及目的杂交条件时是指杂交条件和目的杂交条件导致具有相同同源性百分比(％)范围的核酸序列杂交。例如，如果目的杂交条件导致第一核酸序列与其他核酸序列(其对所述第一核酸序列具有80%到90%的同源性)杂交，则当另一杂交条件也导致所述第一核酸序列与其他核酸序列(其对所述第一核酸序列具有80%到卯%的同源性)杂交时，将另一杂交条件称作与所述目的杂交条件是等价的。关于核酸杂交使用时，本领域熟知可以使用大量等价的条件来包括低严格或高严格条件；考虑下述因素，如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靼标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或被固定等)和盐与其他成分的浓度(例如存在或不存在甲酰胺、疏酸葡聚糖、聚乙二醇)，且可以改变杂交溶液来产生与上述条件不同但是等价的低严格或高严格杂交条件。本领域技术人员已知尽管优选更高的严格性来降低或消除非特异性结合，但是可优选更低的严格性来检测具有不同同源性的更大量的核酸序列。术语"基因"是指有效连接到适当调节序列的编码区，所述调节序列能够以一些方式调节多肽的表达。基因包括编码区(开放阅读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA非翻译调节区(例如启动子、增强子、抑制子等)，以及根据需要，包括单个编码区(即外显子)之间的插入序列(即内含子)。如本文所用的术语"结构基因"旨在表示被转录为mRNA，然后翻译为由特异多肽表征的M酸序列的DNA序列。当涉及结构基因4吏用时，如本文所用的术语"编码区"是指编码新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列，所述新生多肽是mRNA分子翻译的结果。在真核生物中，编码区界限为5，侧的核苷酸三联体"ATG"(其编码起始子甲硫氨酸)和3，侧定义为终止密码子的三个三联体(即TAA、TAG、TGA)之一。除含有内含子之外，基因的基因组形式也可包含位于序列5'和3，两端的序列，其存在于RNA转录物中。这些序列被称为"侧翼"序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的未翻译序列的5，或3，)。5，侧翼区可含有调控或影响基因转录的调节序列，如启动子和增强子。3'侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。术语"多肽"、"肽"、"寡肽"、"多肽"、"基因产物"、"表达产物"和"蛋白质"在本文可互换使用，是指连续氨基酸残基的多聚体或寡聚体。如本文所用的术语"分离的"是指材料从其最初环境中被取出。例如，存在于生活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽未被分离，但是从天然体系中一些或全部共存材料中分离的相同多核苷酸或多肽是净皮分离的。这类分，只要这类载体或组合物不是其最初环境的部分，就应当是分离的。术语"遗传修饰的生物"或"GMO"是指包含转基因DNA的任何生物。示范性的生物包括植物、动物和微生物。本文使用术语"一个细胞"或"植物细胞"是指单个细胞。术语"多个细胞，，是指细胞群体。群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。类似地，群体可包含多于一种细胞类型。在本发明中，不限制细胞群体可包含的细胞类型数。细胞可以是经同步化的或未经同步化的。本发明含义中的植物细胞可以是分离的(例如在悬浮液培养物中)或包含在植物组织、植物器官或任何发育阶段的植物中。涉及植物的术语"器官，，(或"植物器官，，)是指植物的部分，并且可以包括(但是应当不限于)例如才艮、果实、枝条、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。涉及植物的术语"组织"(或"植物组织")是指多种植物细胞的排列，包括植物的分化和未分化组织。植物組织可构成植物器官的部分(例如植物叶的表皮)，但是也可构成肿瘤组织(例如愈伤组织)和多种类型的培养中细胞(例如单细胞、原生质体、胚胎、愈伤组织、原球茎样体等)。植物组织可以在植物中，在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。本文使用术语"植物"是指一大批植物细胞，其大量分化为存在于植物发育任何阶段的结构。这类结构包括一种或多种植物器官，包括但不限于果实、枝条、茎、叶、花瓣等。术语"染色体DNA"或"染色体DNA序列"理解为与细胞周期状态无关的细胞核基因组DNA。因此，染色体DNA可以被组织为染色体或染色单体，它们可以是浓缩的或解螺旋的。进入染色体DNA的插入片段可以通过本领域已知的多种方法证明和分析，例如PCR分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。如本文所用的术语"结构基因"旨在表示被转录为mRNA，然后翻译为由特异多肽表征的氨基酸序列的DNA序列。术语"表达"是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录为mRNA,和任选地涉及mRNA随后翻译为一种或多种多肽。如本文所用的术语"表达盒"或"表达构建体"旨在表示待表达的任何核酸序列与启动子序列和任选地额外元件(例如终止子和/或多聚腺苷酸化序列)有效连接的组合，所述额外元件促进所述核酸序列的表达。本文使用"启动子"、"启动子元件"或"启动子序列"是指核苷酸序列5，端的核苷酸序列，其指导转录的起始(即能够调控核苷酸序列转录为mRNA)。启动子通常(但不必须)位于其调控转录为mRNA的目的核苷酸序列的5，(即上游)(例如接近结构基因的转录起始位点)，并为RNA聚合酶和用于起始转录的其他转录因子提供特异结合的位点。启动子序列是必需的，但是往往不足以操纵下游基因的表达。一般地，真核生物启动子包括与转录起始(cap)位点5，约10-30bp的连续5'-TATAAT-3'(TATA)框同源的特征性DNA序列，所述转录起始位点通常被计数为+1。Cap位点3，的碱基被给予正数，而cap位点5，的碱基得到负数，反映了它们与cap位点的距离。另一启动子成分CAAT框通常存在于TATA框的5，约30到70bp处，并与规范形式的5'-CCAAT-3，具有同源性(Breathnach1981)。在植物中，CAAT框有时被已知为AGGA框的序列代替，所述AGGA框是具有对称侧接于三联体G(或T)NG的腺嘌呤残基的区域(Messing1983)。对转录具有调节影响的其他序列可以存在于启动子区中，或从cap位点5，延伸1000bp远或更多。关于启动子使用术语"组成型的"是指该启动子能够在不存在刺激(例如热激、化学品、光等)时指导与其有效连接的核,列的转录。一般地，组成型启动子基本上能够在任何细胞和任何组织中指导转基因的表达。调节调控是指通过基本(但不仅仅)位于转录起始位点上游(5，)的DNA序列元件诱导的对基因表达的调整。调节可导致对环境刺激的全或无应答，或其可导致基因表达水平的变化。在本发明中，热激调节元件响应突然的温度提高而发挥作用，瞬时提高下游基因表达水平。多腺苷酸化信号是指能够影响mRNA加工的任何核酸序列，其通常表征为mRNA前体3，端多聚腺苷酸束的添加。多腺苷酸化信号DNA区段自身可以是来自若干来源(天然存在或合成的)的区段的组合物，并可以来自基因组DNA或RNA衍生的cDNA。尽管距离变异、部分"连读"和多重串联规范序列并不少有，但是多腺苷酸化信号通常由对规范形式5'-AATAA-3'同源性的存在来识别(Messing1983)。应当明白规范的"多腺苷酸化信号，，事实上本身可引起转录终止而不是多腺苷酸化(Montell1983)。热激元件是指DNA序列，其响应突然的温度上升而调节基因表达。看到该应答是下游基因表达水平的突然但瞬时的提高。对热激基因的最初工作用果蝇(Drosophila)进行，但是包括植物的许多其他物种(Barnett1980)显示对胁迫的类似应答。在果蝇中，描述了热激元件的必需基本成分为具有共有序列5'-CTGGAATNTTCTAGA-3'(其中N=A、T、C或G)，并可位于转录起始位点上游残基-66到-47bp之间的区域(Pelham1982)。该共有序列的化学合成寡核苷酸拷贝可代替天然序列来给予热激可诱导性。前导序列是指下述DNA序列，其包含位于转录起始位点和翻译起始位点之间的约100个核苷酸。具体而言，前导序列是指定核糖体结合位点的区域。内含子或间插序列在该工作中是指下述DNA序列区域，它们与编码序列(外显子)一起被转录，但是随后在成熟mRNA的形成中被去除。内含子可以发生于^L转录序列中任何地方-于相同或不同基因的编码序列之间、位于基因编码序列内(中断并分裂其氨基酸序列)，和位于启动子区内(翻译起始位点5，)。初级转录物中的内含子被剪切，编码序列同时并精确地被连接，形成成熟的mRNA。内含子和外显子的接头处形成剪接位点。内含子的g序列从GU开始，以AG结束。在许多高等真核生物中发现了相同的剪接信号。术语"有效地连接，，或"有效地连接的"应当理解为表示例如调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列，以及根据需要其他调节元件(如例如终止子)以下述方式顺序排列各调节元件能够实现其预期的功能来允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达。表达可根据与有义和反义RNA相关的核酸序列的排列而产生。为此，不必须要求化学意义上的直接连接。遗传调控序列(例如增强子序列)也可对来自远处位置的靶序列或实际上来自其他DNA分子的乾序列发挥其作用。优选的排列为下述排列，所述排列中待重组表达的核酸序列位于作用为启动子的的序列之后，使得两个序列彼此共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选为少于200碱基对，特别优选少于100碱基对，非常特别优选少于50碱基对。有效的连接和表达盒可以借助于常规重组和克隆技术(例如如Maniatis1989;Silhavy1984;Ausubel1987;Gelvin1990中所述)来产生。然而，也可将其他序列(例如作用为限制性酶特异切割位点接头的序列)置于两个序列之间。序列的插入也可导致融合蛋白质的表达。优选，由启动子和待表达核酸序列连接组成的表达盒可以以整合的载体形式存在，并可以通过例如转化被插入植物基因组。本文使用术语"转化"是指将遗传材料(例如转基因)引入细胞。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语"瞬时转化，，或"瞬时转化的"是指将一种或多种转基因引入细胞中而不将转基因整合进宿主细胞的基因组中。瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)来检测，该方法检测一种或多种转基因所编码多肽的存在。或者，如本文所述，瞬时转化可通过检测转基因(例如uidA基因)所编码的蛋白质(例如P-葡糖醛酸糖苷酶)活性来检测，(例如通过X-gluc染色的GUS酶活性组织化学测定法，其在存在GUS酶活性时给出蓝色沉淀物；和使用GUS-Light试剂盒(Tropix)的GUS酶活性化学发光测定法)。术语"瞬时转化物"是指已瞬时整合了一种或多种转基因的细胞。相反，术语"稳定转化"或"稳定转化的"是指将一种或多种转基因引入并整合进细胞的基因组中，优选引起染色体整合和通过减数分裂稳定遗传。可通过细胞的基因组DNA与下述核酸序列的Southern印迹杂交来检测细胞的稳定转化，所述核酸序列能够与所述一种或多种转基因结合。或者，也可通过细胞基因组DNA的聚合酶链式反应扩增转基因序列来检测细胞的稳定转化。术语"稳定转化体"是指下述细胞，所述细胞将一种或多种转基因稳定地整合进基因组DNA(包括质体和细胞核的DNA)中，优选整合进细胞核的染色体DNA中。因此，稳定转化体与瞬时转化体的区别在于尽管来自稳定转化体的基因组DNA含有一种或多种转基因，但是来自瞬时转化体的基因组DNA不含有转基因。转化也包括将遗传材料以参与表染色体复制(epichromosomalreplication)和基因表达的植物病毒载体的形式引入植物细胞，所述植物病毒载体可以表现出与减数分裂稳定性相关的不同性质。优选术语"转化"包括将遗传材料引入植物细胞，导致染色体整合和通过减数分裂稳定遗传。涉及细菌的术语"感染"是指将靶生物样品(例如细胞、组织等)与细菌在下述条件下共孵育，所述条件使得细菌中所含的核酸序列被引入靶生物样品的一个或多个细胞中。术语"农杆菌"是指土传的、革兰氏阴性的、棒状致植物病的细菌，其引起冠瘿。术语"农杆菌"包括，但不限于根瘤农杆菌(其通常在被感染的植物中引起冠瘿)，和毛根农杆菌(其通常在被感染的植物中引起发根病)。用农杆菌感染植物细胞通常引起被感染细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，引起胭脂碱产生的农杆菌菌林(例如菌林LBA4301、C58、A208)被称作"胭脂碱型"农杆菌；引起章鱼碱产生的农杆菌菌抹(例如菌林LBA4404、Ach5、B6)被称作"章鱼碱型"农杆菌；引起农杆碱产生的农杆菌菌林(例如菌林EHA105、EHAIOI、A281)被称作"农杆碱型"农杆菌。术语"轰击"和"生物射弹轰击，，是指将粒子加速冲向靶生物样品(例如细胞、组织等)，以影响耙生物样品细胞的细胞膜创伤和/或使粒子进入乾生物样品的过程。生物射弹轰击的方法是本领域已知的(例如US5，584，807,其内容并入本文作为参考)，并可商业获得(例如氦气驱动的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad))。关于植物组织使用术语"微创"是指向组织中引入微观创伤。微创可以通过例如本文所述的粒子轰击来达成。可以通过在标准(即根据与外源DNA接触的细胞数量、经递送的DNA数量、DNA递送类型和条件、一般培养条件等经标准化或规格化的)实验测量本文所4吏用的"转化效率"或"转化频率"。例如，当使用经分离的不成熟胚作为转化起始材料时，转化的频率可以,i^示为每100个被转化的分离的不成熟胚所获得的转基因植物林系数量。发明详述本发明的第一个实施方案涉及用于产生转基因玉米植物的方法，包括步骤a.向玉米细胞或组织中引入DNA构建体，所述DNA构建体包含i)至少一个第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，ii)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状，和b.在选择性培养基上将步骤a)所述玉米细胞或组织培养至少5天的时间段，所述培养基包含总浓度约1mM到100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物，和c.将步骤b)的所述玉米细胞或组织转移至再生培养基并再生和选择含有所述DNA构建体的玉米植物。本发明的重要特征是泛素启动子(优选玉米泛素启动子)能有效驱动D-丙氨酸和/或D-丝氨酸代谢酶基因的表达。泛素启动子的惊人用途导致与单子叶植物中通常使用的其他启动子相比有持续更高的转化效率，所述其他启动子例如玉米ahas启动子(U.S.专利No.5,750,866)或ScBV启动子(U.S.专利号6，489，462)。与这些启动子相比，使用泛素启动子的转化效率更高(在一些情况下至少高100%)和/或应用更广泛，尽管这些启动子被描述为本领域的强组成型启动子。泛素启动子的这一惊人优秀表现的原因是未知的。然而，已知最佳选择需要选择标记在正确的时间并针对正确的浓度(足够高以确保有效选择，但是不会过高，以阻止对细胞的可能负面影响)在靶组织的相关细胞(其随后去分化并再生为转基因植物)中表达。特别地，玉米泛素启动子的优秀功能和效率也可指示玉米转基因细胞需要具有足够量的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸代谢斷例如DSDA或DAO蛋白质)从而在它们承受的选择压力下存活，所述酶对玉米是外源(非天然)的。这些效应可以是启动子和/或标记依赖性的，从而启动子和标记的某些组合优于其他。另外，泛素启动子似乎对D-氨基酸代谢标记基因序列具有更高的适应性。其他启动子有时与一种特定的标记一起作用非常好，但是与另一种一起则差得多。因此泛素启动子可以用作标准启动子来驱动玉米中D-氨基酸代谢酶的表达。通过使用玉米启动子可达成高的转化效率，其与其他已经建立的选择体系(例如ahas-选择体系)相当。本文在来自细菌或酵母的序列之后使用标记，其通常存在于人和动物食物或饲料中。在优选的实施方案中，本文提供的标记和方法允许容易地去除标记序列。另外，本文提供用于玉米的详细的最优化的转化方案，其允许工业规模的有效转化。通过本发明方法获得的植物是能育和表型正常的。在杂种和近交系中转化均正常进行。我们证明能够将选择标记dsdA(初级)和daol(次级)或ahas(初级)和dsdA(次级)叠加，这表明ahas体系与D-氨基酸选择体系的兼容性。1.本发明的DNA构建体本发明的另一实施方案涉及DNA构建体，其包含i)至少一个第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酵，ii)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状。泛素启动子和/或能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶在下文详细定义。1.1本发明的第一表达构建体本发明的一个实施方案涉及重组表达构建体，其包含启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶，其中所述启动子相对于所述酶编码序列是异源的。泛素启动子和/或能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶在下文详细定义。1.1.1能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶本领域技术人员知道适合代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的大量序列。术语"能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶"优选表示酶，其以下述活性转化和/或代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，所述活性是转化相应L-氨基酸(即D-丙氨酸和/或D-丝氨酸)和——更优选地——任何其他D-和/或L-或非手性氨基酸活性的至少两倍(至少高出100%)，优选至少三倍，更优选至少五倍，进一步更优选至少10倍，最优选至少50倍或100倍。优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(D-丝氨酸脱水酶；EC4.3.1.18;以前为EC4.2.1.14)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)和D-丙氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.21)。更优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(D-丝氨酸脱水酶；EC4.3.1.18;以前为EC4.2.1.14)和D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)。术语"D-丝氨酸脱氨酶，，(D-丝氨酸脱水酶；EC4.3.1.18;正式的EC4.2.1.14)是指催化D-丝氨酸转化为丙酮酸盐和氨的酶。被催化的反应很可能涉及最初的水消除(因此酶的最初分类为EC4.2.1.14)，随后是伴随C-N键断裂的产物异构化和水解。合适酶的实例参阅http:〃www.expasy.org/enzyme/4.3.1.18.术语"D-丙氨酸转氨酶"(EC2.6.1.21)是指催化D-丙氨酸与2-酮戊二酸反应生成丙酮酸盐和D-谷氨酸盐的酶。D-谷氨酸盐比D-丙氨酸对植物的毒性小得多。http:〃www.expasy.org/enzyme/2.6.1.21.术语D-^J^酸氧化酶(EC1.4.3.3;缩写DAAO、DAMOX或DAO)是指将D-氨基酸转化为2-含氧酸的酶，优选使用氧(02)作为底物并产生过氧化氢(H202)作为副产品(Dixon1965a，b，c;Massey1961;Meister1963)。DAAO可由NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(IUBMB)(国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会)用EC(EnzymeCommission(酶学委员会))编号EC1.4.3.3来描述。一般地，EC1.4.3.3.类的DAAO酶是FAD黄素酶，其催化中性和碱性D-氩基酸氧化为它们相应的酮酸。DAAO在真菌和脊推动物中祐束征和测序，其中已知它们位于过氧化物酶体中。在DAAO中，保守的组氨酸已显示对酶的催化活性是重要的(Miyano1991)。在本发明优选的实施方案中，DAAO是指包含以下共有基序的蛋白质[LIVM-[LIVM-H*-[NHA-Y-G-x-[GSA-GSA-x-G-x5-G-x-A其中括号中给出的氨基酸残基代表各自位置上的备选残基，x表示任何氨基酸残基，指数数字表示连续氨基酸残基的各自数量。个体氨基酸残基的缩写如上所述具有它们的标准IUPAC含义。D-氨基酸氧化酶(EC号1.4.3.3)可以从多种生物中被分离，包括但不限于猪、人、大鼠、酵母、细菌或真菌。实例生物为热带假丝酵母(Candidatropicalis)、三角酵母(Trigonopsisvariabilis)、粗較脉抱菌(Neurosporacrassa)、小球藻(Chlorellavulgaris)和瘦弱红酵母。合适的D-氨基酸代谢多肽可以是真核生物的酶，例如来自酵母(例如瘦弱红酵母)、真菌或动物，或其可以是原核生物的酶，例如来自细菌如大肠杆菌。合适酶的实例参阅http:〃www.expasy.org/enzyme/1.4.3.3.代谢D-氨基酸的合适多肽的实例显示在表1中。编码所述酶的核^列可得自数据库(例如在Genbank登录号U60066、A56901、AF003339、Z71657、AF003340、U63139、D00809、Z50019、NC_003421、AL939129、AB042032下)。如上文所述，来自若干不同物种的DAAO已^L表征并显示在底物亲和性上有轻孩i差异(Gabler2000),但是它们一般显示广泛的底物特异性，使所有D-氨基酸氧化脱氨。表l:适用于代谢D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的酶。特别优选的酶以黑体字母表示酵EC编号实例来源生物底物D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶(D-Serineammonialyase,D-Serinedeaminiase))EC4.3丄18(最初为EC4.2.1.14)P54555枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)P00926大肠杆菌DSDAQ9KL72霍乱弧菌(Vibriocholera)VCA0875Q9KC12耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)D-SerD-ThrD-别苏氨酸(D-allothreonine)D-氨基酸氧化酶EC1.4.3.3JX0152腐皮镰孢(Fusariumsolani)001739线虫(Caenorhabditiselegans)033145麻风分支杆菌(Mycobacteriumleprae)AAO.035078褐鼠(Rattusnorvegicus)(大鼠)045307线虫P00371野猪(Susscrofa)(猪)P14920智人(Homosapiens)(人)PI4920智人(人)PI8894小鼠(Musmusculus)(小鼠)P22942兔(Oryctolaguscuniculus)(兔)P24552腐皮镰孢(subsp.pisi)(Nectriahaematococca)P80324红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)(酵母)(瘦弱红酵母)Q19564线虫Q28382野猪(猪)Q7SFW4粗糙脉孢菌Q7Z312智人(人)Q82MI8除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)Q8P4M9野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)Q8PG95地毯草黄单胞菌大多数D-氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>本文上下文中特别优选的是来自酵母瘦弱红酵母(红冬孢酵母)的daol基因(EC:1.4.3.3:GenBank登录号U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC:4.3.1.18;GenBank登录号:J01603)。daol基因特别有优势，因为其可用作二元功能标记(参阅国际专利申请PCT/EP2005/002734)。合适的D-IL^酸代谢酶也包括上文所列多肽的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因。合适的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因是保持如上所述的D-H&酸代谢酶功能特征的那些。对序列而言，产生突变体、变体或衍生物的改变可以是核酸中一个或多个核普酸的一个或多个添加、插入、缺失或取代，这导致所编码的多肽中一个或多个氨基酸的添加、插入、缺失或取代。当然，也包括不引起所编码的氨基,列改变的核酸改变。对本发明的方法而言更优选能够代谢D-丝氨酸的酶选自i)如SEQIDNO:2所述的大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶，和ii)与SEQIDNO:2编码的序列具有相同酶活性和至少80%同一性(优选至少85%，更优选至少卯％，进一步更优选至少95%，最优选至少98%)的酶，和iii)由能够与SEQIDNO:1所述序列的互补序列杂交的核酸序列编码的酶，其中在含有从约1mM到100mM浓度(更优选从约5mM到约50mM，进一步更优选从约7mM到约30mM,最优选约10到20mM)D-丝氨酸的培养基上进行选择。本文上下文中，D-丝氨酸脱氨酶的"相同活性"是指代谢D-丝氨酸(优选作为最优选底物)的能力。代谢是指上文所述的裂解酶反应。在iii)中杂交优选表示在低严格条件(用30%到35%甲酰胺的緩冲溶液、1MNaCl、1%SDS在37。C下杂交，和在lx到2xSSC中在50到55。C洗涤)下杂交，更优选中严格条件(在40%到45%的甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中在37。C下杂交，并在0.5x到lxSSC中在55到60。C下洗涤)，最优选非常严格条件(在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中37。C下杂交，并在O.lxSSC中60。C到65。C中洗涤)。对本发明方法而言，还更优选能够代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选白i)如SEQIDNO:4编码的瘦弱红酵母D-氮基酸氧化酶，和ii)酶，其与SEQIDNO:4编码的序列具有相同的酶活性和至少80%(优选至少85%，更优选至少90%,进一步更优选至少95%,最优选至少98%)同一性，和iii)酶，其由能够与SEQIDNO:3所述序列的互补序列杂交的核,列编码，并且其中在含有总浓度从约1mM到100mM(更优选从约2mM到约50mM，进一步更优选从约3mM到约20mM,最优选约5到15mM)的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸培养基上进行选择。所述序列的突变体和衍生物也可包括酶，所述酶在一种或多种特性(Ki、底物特异性等)上被改进，但是仍然包含涉及D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的代谢活性。这类序列和蛋白质也包括来自诱变和重组方法(如DNA改组)的序列和蛋白质。使用这类方法可将一种或多种不同的编码序列操作产生新的多肽，所述多肽具有所期望的性质。以此种方式从一群相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸文库，所W目关的序列多核苷酸包含具有显著序列同一性的序列区并可以在体外或体内同源重组。编码候选酶的多核苷酸可以例如用DNA改组方案被调整。DNA改组氏一种方法，其快速、容易和有效地向DNA分子中(优选随机地)引入突变或重排，或在两个或多个DNA分子之间(优选随机地)产生DNA序列交换。得自DNA改组的DNA分子是改组的DNA分子，其是来自至少一个才莫板DNA分子的非天然存在的DNA分子。改组的DNA编码相对于模板DNA所编码的酶而言被修饰的酶，并优选具有相对于模板DNA所编码的酶而言被改变的生物活性。DNA改组可以以递归重组和突变的方法为基础，通it^目关基因库的随机片段进行，随后通过类聚合酶链式反应的方法将所述片段重新组装。参阅例如Stemmer1994a，b;Crameri1997;Moore1997;Zhang1997;Crameri1998;US5，605，793、US5，837，458、US5,830,721和US5，811,238。得到的由^f皮改组DNA编码的dsdA-或dao-样酶具有与所述酶原始版本不同的氨基酸序列。示范性的序列同一性范围如上所述。本文上下文中，D-氨基酸氧化酶的"相同活性"是指代谢广镨D-氨基酸(优选至少D-丝氨酸和/或D-丙氨酸)的能力。代谢是指上文所述的氧化酶反应。在iii)中杂交优选表示在低严格条件(用30%到35%甲酰胺的緩沖溶液、1MNaCl、1%SDS在37。C下杂交，和在lx到2xSSC中在50到55。C洗涤)下杂交，更优选中严格条件(在40%到45%的甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中在37'C下杂交，并在0.5x到lxSSC中在55到60。C下洗涤)，最优选非常严格条件(在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中37°C下杂交，并在O.lxSSC中60。C到65。C下洗涤)。优选在下文详细描述了用于选择的浓度和时间。优选使用约3到约15mMD-丙氨酸或约7到约30mMD-丝氨酸进行选择。去分化条件下的总选择时间优选从约3周到4周。本发明的D-氨基酸代谢酶可以在植物细胞的细胞溶胶、过氧化物酶体或其他细胞内区室中被表达。D-氨基酸代谢酶的区室化可通过将编码DAAO多肽的核酸序列与编码转运肽的序列融合产生融合蛋白来达成。无这类转运肽的表达的基因产物通常在细胞溶胶中蓄积。1.1.2泛素启动子D-丙氨酸和/或D-丝氨酸代谢酶与泛素启动子(优选植物泛素启动子，更优选单子叶植物泛素启动子，进一步更优选玉米泛素启动子)偶联。本文使用术语"泛素启动子"是指泛素或泛素样基因起始密码子或作图的转录起始位点上游多至5000个^对(bp)的基因组DNA区域。泛素是存在于所有真核生物细胞中的多量的76氨基酸多肽。存在编码泛素的若干不同基因，它们氨基酸水平上的同源性相当高。例如，人和小鼠具有许多不同的泛素编码基因，每个位于不同的染色体基因座上。功能上所有的泛素基因是细胞的泛素依赖性蛋白水解机制的关键成员。每个泛素基因与驱动其表达的启动子相结合。泛素启动子是泛素或泛素样基因的起始密码子或作图的转录起始位点上游多至5,000bp的基因组DNA区域。术语"植物泛素调节体系，，是指植物(优选玉米)泛素基因翻译起始位点5，的约2kb核苷酸序列，并包括指导转录起始、调节转录、调控表达水平、诱导胁迫基因和增强胁迫应答表达的序列。包含启动子和调节功能的调节体系是提供基因表达的调节控制或调整的DNA序列。多种植物泛素基因及其启动子已被描述(Callis1989，1990)。描述了来自双子叶植物如马铃薯(Garbarino1992)、烟草(Genschick1994)、番痴(Hoffman1991)、芫荽(parsely)(Kawalleck1993;WO03/102198,引入本文作为参考)、拟南芥(Callis1990;Holtorf1995;UBQ8，GenBank登录号NM—111814;UBQ1，GenBank登录号NM—115119;UBQ5，GenBank登录号NM—116090)的启动子。因此，本发明的泛素启动子是一个DNA片段(优选约2kb长)，所述DNA片段含有植物泛素调节体系，其中所述调节体系含有启动子(包含转录起始位点)，和优选的位于所述转录起始位点5，的一个或多个热激元件，和优选的位于所述转录起始位点3，的内含子，其中所述调节体系能够在玉米中调节表达。优选表达是组成型和诱导型的基因表达，从而所述基因表达的约三分之一。优选泛素启动子来自单子叶植物。描述了玉米(Christensen1992，1996,TransgenicRes5:213-218)、稻(RUBQ1、RUBQ2、RUBQ3和RUBQ4;来自RUBQ1和RUBQ2的启动子适用于组成型表达；US6,528,701)的这类启动子。最优选的是U.S.专利号5，614，399、5,510,474、6,020,190、6,054,574和6,068,994中描述的来自玉米的泛素启动子。启动子调节含有7个串联重复的玉米多聚泛素基因的表达。该玉米泛素基因的表达在25。C下是组成型的，并被42。C的热激诱导。启动子成功地用于若干单子叶植物(Christensen1996)。在玉米ubil启动子区域中，发现TATA框位于位置-30,发现两个重叠的热歸列5'誦CTGGTCCCCTCCGA-3'和CTCGAGATTCCGCT-3'位于位置-214和-204。启动子区域中未发现规范的CCAAT和GC框，但是序列5-CACGGCA-3'(功能未知)在启动子区域的位置-236、-122、-96和-91出现四次(Christensen1992)。描述了玉米Ubi-l和Ubi-2的启动子及其表达模式(US6,054574;Christensen1992)。更优选泛素启动子选自a)包含SEQIDNO:5所述序列的序列，和b)序列，其包含SEQIDNO:5所述序列的至少50个(优选至少100个，更优选至少250个，进一步更优选至少500个，最优选至少1000个)连续碱基对的至少一个片段，并在玉米中具有启动子活性，c)序列，其与SEQIDNO:5所述序列具有至少60%(优选至少70%，更优选至少80%，进一步更优选至少90%，最优选至少95%)的同一性，并在玉米中具有启动子活性，d)序列，其包含与SEQIDNO:5所述序列杂交的序列，并在玉米中具有启动子活性。在玉米中的"启动子活性，，是指在玉米植物或来自玉米植物的至少一个细胞或组织中实现有效连接的核酸序列转录的能力。优选其表示允许在大部分组织和大部分发育阶段表达的组成型转录活性。可以存在但不必需与玉米泛素启动子活性相关的热激元件。在d)中杂交表示在低严格条件(用30%到35%甲酰胺的緩冲溶液、1MNaCl、1%SDS在37。C下杂交，和在lx到2xSSC中在50到55。C洗涤)下杂交，更优选在中严格条件(在40%到45%的曱酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中在37。C下杂交，并在0.5x到lxSSC中在55到60。C下洗涤)，最优选在非常严格条件(在50%甲酰胺、1MNaCl、1。/。SDS中37。C下杂交，并在O.lxSSC中60。C到65。C下洗涤)。SEQIDNO:5所述序列是玉米泛素启动子的核心启动子。在一个优选的实施方案中，不仅使用启动子区作为转录调节序列，而且使用5，-非翻译区和/或内含子。优选与内含子一起，更优选与表达增强内含子一起使用泛素启动子。这类内含子可以是ubil基因的天然内含子1(MubGl在其5，非翻译区含有1004-碱基对(bp)的内含子；Liu1995)。更优选泛素启动子体系的特征在于约2kb的长度，还以从所述DNA片段5，大部分元件开始朝向3，端进行的顺序包含(a)—个或多个热激元件，所述元件可重叠或不重叠；(b)包含转录起始位点的启动子；和(c)长度约lkb的内含子。更优选使用跨越玉米泛素基因启动子、5，非翻译区和第一内含子的区域，进一步更优选使用SEQIDNO:6所述区域。因此在另一优选的实施方案中，本发明方法中使用的泛素启动子选自a)包含SEQIDNO:6所述序列的序列，和b)序列，其包含SEQIDNO:6所述序列的至少50个(优选至少100个，更优选至少250个，进一步更优选至少500个，最优选至少1000个)连续碱基对的至少一个片段，并在玉米中具有启动子活性，c)序列，其与SEQIDNO:6所述序列具有至少60%(优选至少70%，更优选至少80%,进一步更优选至少卯％，最优选至少95%)的同一性，并在玉米中具有启动子活性，d)序列，其包含与SEQIDNO:6所述序列杂交的序列，并在玉米中具有启动子活性。在d)中杂交优选表示在低严格条件(用30%到35%甲酰胺的緩冲溶液、1MNaCl、1%SDS在37。C下杂交，和在lx到2xSSC中在50到55°C洗涤)下杂交，更优选中严格条件(在40%到45%的曱酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中在37。C下杂交，并在0,5x到lxSSC中在55到6(TC下洗涤)，最优选非常严格条件(在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中37。C下杂交，并在O.lxSSC中60。C到65。C下洗涤)。因此本发明使用的泛素启动子也可以是SEQIDNO:5或6所述启动子或其衍生物的片段。片段可包括SEQIDNO:5或6所述启动子的截短版本，其中非必需的序列被去除。缩短的启动子序列是高度有利的，因为它们更易于操作且有时其基因表达镨被最优化。制备缩短或截短启动子的一个有效的、定向的手段依赖于鉴定启动子序列中的假定调节元件。这可通过与已知的启动子序列比较来开始，所述启动子序列会以相似的组织特异或发育特异方式被表达。具有相似表达模式的启动子之间共享的序列是结合转录因子的可能候选者，因此是赋予表达模式的可能元件。可通过各假定的调节区的缺失分析，随后通过测定报道基因对各缺失构建体进行功能分析来验证这些假定的调节元件，所述报il基因与各构建体功能性结合。同样地，一旦提供了起始启动子序列，则可容易地制备起始启动子任意大量的不同缺失突变体。也可通过去除或缺失非必需序列而不缺失必需序列来获得(例如SEQIDNO:5或6所述的)泛素启动子的功能等价片段。可通过尝试法(trial-and-arrow)缺失突变，或在计算机芯片上使用启动子元件搜索程序实现体外实现将转录调节核苷酸序列缩小为其必需的转录介导的元件。启动子活性必需的区域通常证实为某些已知启动子元件的簇。这类分析可使用能够获得的计算机算法进行，如PLACE("PlantCis-actingRegulatoryDNAElements";Higo1999)、BIOBASE数据库"Transfac"(BiologischeDatenbankenGmbH,Braunschweig;Wingender2001)或PlantCARE数据库(Lescot2002)。优选地，本发明转录调节核苷酸序列之一的功能等价片段包含SEQIDNO:5或6所述转录调节核苷酸序列的至少100个碱基对，优选至少200个碱基对，更优选至少500个碱基对。更优选该片段从所述序列的3，端开始。特别优选的是转录调节核苷酸序列的等价片段，其通过缺失编码mRNA5，非翻译区的区域从而仅提供(未转录的)启动子区获得。5，非翻译区可通过本领域已知的方法(例如5，-RACE分析)容易地测定。因此，如SEQIDNO:5所述的核心启动子区是SEQIDNO:6所述序列的片段，其仍然包含5，非翻译区和内含子。4汙生物也可包含例如〗务饰的玉米启动子序列，其例如不包含两个重叠的热激元件。这类序列描述于例如US专利申请20030066108(WO01/18220)。1.1.3其他元件本发明的表达盒(或包含其的载体)除了泛素启动子外可还包含其他功能元件和遗传调控序列。术语"功能元件"或"遗传调控序列"应理解为广义的含义，是指对本发明表达盒的物质化或功能具有影响的所有序列。例如，遗传调控序列修饰转录和翻译。遗传调控序列已被描述(例如Goeddel1990;Gruber1993和其中所述参考文献)。优选，根据本发明的表达盒在核酸序列5，上游包含在植物中有功能的泛素启动子(例如编码D-氨基酸代谢酶)，在3，下游包含终止子序列和多聚腺苷酸化信号，并且适当时还包含常规的调节元件，每种情况下均与待表达的核酸序列有效地连接。遗传调控序列和功能元件还进一步包含基因的5'非翻译区、内含子或非编码3，区，如例如肌动蛋白-1内含子或Adhl-S内含子l、2和6(—般参考TheMaizeHandbook,第116章,Freeling和Walbot编,Springer,NewYork(1994))。已证明它们可在基因表达调节中起重^ft用。因此，已证明5，非翻译序列可以增强异源基因的瞬时表达。可提到的翻译增强子的实例为烟草花叶病毒5，前导序列(Gallie1987)等等。另外，它们可促进组织特异性(Rouster1998)。适合用作遗传调控序列的多聚腺苷酸化信号是植物多聚腺苷酸化信号，优选主要对应于来自根瘤农杆菌的T-DNA多聚腺苷酸化信号的那些多聚腺苷酸化。特别适合的终止子序列实例是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂氨酸合成酶)终止子。可包含在本发明载体中的功能元件包括i)复制起点，其确保本发明表达盒或载体在例如大肠杆菌中的复制。可提到的实例为ORI(DNA复制起点)、pBR322ori或P15Aori(Sambrook等MolecularCloning.ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)，ii)多克隆位点(MCS),其使得能够插入一个或多个核酸序列并促进所述插入,iii)使得同源重组、标记缺失或插入宿主生物基因组成为可能的序列。基于cre/lox(Sauer1998;Odell19卯；Dale1991)、FLP/FRT(Lysnik1993)或Ac/Ds体系(Wader1987;US5,225,341;Baker1987;Lawson1994)的方法适当时允许从宿主生物基因组中组织特异地和/或诱导型去除特异的DNA。在该语境中，调控序列可表示特异的侧接序列(例如lox序列)，其随后允许被去除(例如通过cre重组酶的手段)(也参阅国际专利申请PCT7EP2005/002734)，iv)元件(例如边界序列)，其使得植物细胞中农杆菌介导的转移可能用于转移或整合进植物基因组中，例如T-DNA或vir区的右边界或左边界。1.2.第二表达盒优选插入耙植物基因组中的DNA构建体至少包含一个第二表达盒，所述第二表达盒赋予玉米植物有农业价值的性状。这可通过表达选择标记、性状基因、反义RNA或双链RNA来达成。本领域技术人员知道大量序列，所述序列可用于本文语境中以例如提高食品和飼料的品质，产生化学品、精细化学品或药物(例如维生素、油、糖类；Dunwel12000),赋予对除草剂的抗性，或赋予雄性不育。另外，可促进生长，提高产量和增强对非生物和生物胁迫因素(例如真菌、病毒或昆虫)的抗性。可通过过量表达蛋白质或降低内源蛋白质的表达来赋予有利的性质，所述内源蛋白质表达的降低例如通过表达相应的反义(Sheehy1988;US4,801,340;Mol19卯)或双链RNA(Matzke2000;Fire1998;Waterhouse1998;WO99/32619;WO99/53050;WO00/68374;WO00/44914;WO00/44895;WO00/4卯35;WO00/63364)完成。为了表达这些序列，可使用适用于在玉米中表达基因的所有启动子。优选所述第二表达构建体不包含下述启动子，所述启动子与用于表达D-氨基酸代谢酶的启动子相同。例如，表达可以是组成型、诱导型或发育依赖性的。已知多种启动子用于在单子叶植物如玉米中表达，例如稻肌动蛋白启动子(McElroy19卯)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit1992;Atanassova1992)、来自小麦的富含脯氨酸的蛋白质启动子(WO91/13991)。进一步优选的启动子是在单子叶植物中允许种子特异表达的启动子，例如WO99/168卯中描述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或黑麦醇溶蛋白基因的启动子)2.本发明的转化和选择方法2.1植物材料的来源和制备多种植物材料可用于本文公开的转化方法。这类植物材料可包括但不限于例如叶、根或茎切片，不成熟胚，花粉，但是也包括植物细胞的愈伤组织、原生质体或悬液。优选植物材料为不成熟胚。材料可以被预处理(例如通过在转化前诱导去分化)或不预处理。用于转化的植物材料(例如不成熟胚)实际上可从任何玉米变种或档_物中获得或分离。优选用作转化材料来源的玉米植物来自近交、杂种、(优选不同)近交系之间的Fl、近交和杂种之间的Fl、近交和自然传粉变种之间的F1、市售F1变种、前述变种和前述任何后代之间杂交或自花传粉的任何F2。前述林系和杂交的雄性和雌性亲本的所有组合均包括在内。合适的玉米变体包括但不仅限于P3732、A188、H84、B37Ht、Mol7Ht、W117Ht、Oh43、H99、W64AHtrhm、Fl(A188xBlackMexicanSweet)、Fl(A188xB73Ht)、Fl(B73HtxA188)、Fl(H84xA188)、Fl(Mol7HtxA188)和F1(C103xA188)。可从保藏所如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和本领域已知用于种子材料的其他保藏所获得作为种子的这类变体。更优选，不成熟胚分离自Fl或F2(HilIAxA188)植物与近交系的杂交。玉米基因型HilIAxA188的Fl种子可以优选通过将HiIIA(雌性亲本)与近交系A188(雄性)杂交产生，并种植在温室中作为花粉供体。(HilIAxA188)的F2种子通过Fl(HilIAxA188)植物在温室或大田中的自花传粉产生，并种植在温室中作为花粉供体。用于同Fl或F2(HilIAxA188)植物杂交的最优选的近交系为选自以下的林系，所述林系的代表性种子已按照布达佩斯条约，以专利保藏号PTA-6170(林系BPS553的种子)和PTA-6171(株系BPS631的种子)保藏于美国典型培养物保藏中心(Manasses，VA20110-2209，美国)。BPS553x(H氾AxA188)或BPS631x(HilIAxA188)的杂种植物(或愈伤组织、组织、不成熟胚或其他植物材料)优选使用近交系BPS553或BPS631作为雌性亲本，Fl或F2(HilIAxA188)植物作为雄性亲本，在温室中产生。本领域已知为最佳可转化玉米材料之一的(HilIAxA188)不成熟胚(Ishida等1996，Frame等2002)相比，这些杂种不成熟胚已显示格外高的可转化性。来自(HilIAxA188)杂种和BPS553林系之间杂交的杂种不成熟胚的可转化性至少是(HilIAxA188)胚效率的两倍(比较参见下文实施例7)。因此，上述杂交是用于玉米转化的更好材料。所述近交系已按照布达佩斯条约，以专利4呆藏号PTA-6170(林系BPS553的种子)和PTA-6171(抹系BPS631的种子)保藏于美国典型培养物保藏中心(Manasses,VA20110-2209，美国)。本发明的其他目的涉及所述玉米植物的后代(例如近交系)、从所述后代产生的近交或杂种植物，和前述植物的部分。这类部分可包括但不仅限于组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、种子、小孢子和营养性部分。用于分离不成熟胚的玉米植物如本领域已知地培养和传粉，优选如下文实施例中所述。在本发明一个优选的实施方案中，本发明的方法包括以下步骤a.分离玉米植物的不成熟胚，和b.将所述分离的不成熟胚与包含至少一个转基因T-DNA且属于根瘤菌科属的细菌共培养，所述不成熟胚未进行去分化处理，所述T-DNA包含i)至少一个第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，ii)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状，和C.将共培养的不成熟胚转移至恢复培养基，所述恢复培养基缺乏毒害植物有效量的D-丝氨酸或D-丙氨酸，和d.诱导胚性愈伤组织形成，并在培养基上选择转基因愈伤组织，所述培养基包含i.有效量的至少一种生长素化合物，和ii.总浓度从约1mM到100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，和e.从所述转基因愈伤组织再生并选择植物，所述植物含有转基因T-DNA。本文所用的术语"不成熟胚"是指处于传粉后早期发育和成熟阶段的不成熟种子的胚。待用本发明方法处理的不成熟胚的发育阶段不受限制，所收集的胚可以处于传粉后的任何阶段。优选的胚是在受精后不少于2天收集的胚。还优选的是能够诱导去分化愈伤组织的不成熟胚的盾片，所述愈伤组织在用下文所述方法转化后具有再生正常植物的能力。在优选的实施方案中，不成熟胚是处于传粉后不少于2天阶段的胚。更优选，不成熟胚分离自在传粉后(DAP)7到14天(优选8到11天)收集的玉米植物的穗(优选长出的第一个穗)。收集的确切时间根据生长条件和玉米变种而变化。不成熟胚的尺寸是它们发育阶段的良好标志。用于转化的不成熟胚的最佳长度为约1到1.6mm，包括盾片的长度。胚应当是半透明的，而不是不透明的。在本发明优选的实施方案中，将不成熟胚分离并直接置于固化的共培养培养基表面上，不经额外的洗涤步骤。尽管本领域所述方法均包括若干制备和洗涤步骤，但是在所述显著节约时间和成本的改良中这些步骤均被省略。在本发明中，农杆菌感染步骤在共培养培养基上发生，而不是本领域已知的在含农杆菌悬液细胞的管中发生。优选，将不成熟胚进行转化(共培养)，不经去分化预处理。可任选用细胞壁降解酶或损伤(例如用解剖刀切割或用针穿空)处理不成熟胚。然而在本发明优选的实施方案中，该降解或损伤步骤不是必需的并被省略。术语"去分化"、"去分化处理"或"去分化预处理"是指通过在去分化培养基上培养植物组织已分化细胞获得细胞簇(例如愈伤组织)的过程，所述细胞簇显示无组织的生长。更具体地，本文所用的术语"去分化"旨在表示在植物体范围内不具有具体功能的快速分裂细胞的形成过程。就发育为不同植物组织的能力而言，这些细胞通常具有提高的潜能。优选，该术语旨在表示分化的或特化的组织回复为更多能或全能的(例如胚性的)形式。去分化可以导致植物组织的程序重编(首先回复为未分化的、未特化的细胞，然后进入新的和不同的路径)。本文所用的术语"全能性"旨在表示含有形成完整植物所需的所有遗传和/或细胞信息的植物细胞。可以通过某些植物生长调节剂(例如生长素和/或细胞分裂素化合物)，特别是通过其某些组合和/或浓度来引发去分化。2.2转化步骤2.2.1—般技术可使用载体将才艮据本发明的DNA构建体有利地引入细胞，所述DNA构建体被插入所述载体。载体的实例可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒、逆转录病毒或农杆菌。在有利的实施方案中，通过质粒载体的手段将表达盒引入。优选的载体是能够将表达盒稳定整合进宿主基因组中的载体。DNA构建体可通过任意本领域技术人员已知的若千手段被引入靶植物细胞和/或生物中，该过程被称作转化(也参阅Keown1990)。适用于玉米的多种转化方法已4皮描述。例如可使用射弹方法(如DNA粒子轰击)将DNA构建体直接引入植物细胞，或可使用如细胞的电穿孔或显微注射技术将DNA构建体引入。粒子介导的转化技术(也称作"生物射弹，，)描述于例如EP-A1270,356;US5，100，792，EP國A國444882，EP誦A國434616;Klein1987;Vasil1993和Becker1994。这些方法涉及通过小粒子穿透细胞，其中小珠或粒子基质中或表面上带有核酸。生物射弹PDS-1000基因枪(Biorad，Hercules,CA)使用氦压将包被了DNA的金或钨微载体加速冲向靶细胞。该方法可用于来自生物(包括植物)的广泛组织和细胞。其他转化方法也是本领域人员已知的。其他技术包括显微注射(WO92/09696，WO94/00583，EP-A331083,EP-A175966，Green1987)、聚乙二醇(PEG)介导的转化(Paszkowski1984;Lazzeri1995)、基于脂质体的基因递送(WO93/24640;Freeman1984)、电穿孔(EP-A290395，WO87/06614;Fromm1985;Shimamoto1992)。在将DNA注射或电穿孔进入植物细胞的情况下，待转化的DNA构建体不需要满足任何特定的要求(事实上可使用"棵"的表达盒)。可使用简单的质粒，如pUC系列的质粒。除了(并且优选)这些"直接"转化技术之外，也可通过借助于土传细菌(如根瘤农杆菌或毛根农杆菌)的细菌感染进行转化。这些菌林含有质粒(Ti或Ri质粒)。该质粒的部分(称作T-DNA，转移的DNA)在农杆菌感染后被转移进植物并整合进植物细胞的基因组中。尽管农杆菌介导的转化最初是针对双子叶植物而开发的，但是其被用于单子叶植物的转化方法(Hiei1994)。描述了用于稻、玉米、小麦、燕麦和大麦的转化(综述见Shimamotol994;Vasil等1992;Vain1995;Vasil1996;Wan&Lemaux1994)。对于农杆菌介导的植物转化而言，本发明的DNA构建体可与合适的T-DNA侧翼区结合，并被引入常规的根瘤农杆菌宿主载体中。当细胞被细菌感染时,根瘤农杆菌宿主的致病功能会指导转基因和邻近的标记基因(如果有的话)插入植物细胞DNA中。因此，本发明的DNA构建体优选被整合进适用于农杆菌介导的转化的特异质粒(进入穿梭质粒或中间载体或二元载体)中。如果例如使用Ti或Ri质粒用于转化，则至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但是大部分情况下是右边界和左边界作为侧翼区与待引入的表达盒连接。优选使用能够在大肠杆菌和农杆菌中复制的二元载体。它们可以被直接转化进农杆菌中(Holsters1978)。2.2.2农杆菌介导的转化(共培养)用于将T-DNA转移进入不成熟胚所使用的土传细菌可以是根瘤菌科(Rhizobiaceae)的任何种。根瘤菌科包括农杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium),异根瘤菌属(Allorhizobium)是该细菌科中的属并根据核糖体特征包括在变形菌纲(Proteobacteria)的ot-2亚纲中。该科的成员是需氧、革兰氏阴性的。细胞通常为棒状(0.6-1.0pm乘1.5-3.0pm)，单独或成对出现，无内生孢子，并能通过一到六根有缘毛的鞭毛活动。在含糖类培养基上生长时，通常产生可观的细胞外多糖黏质。特别优选的为根瘤菌科，如草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)、根瘤菌属NGR234种、根瘤菌属BR816种、根瘤菌属N33种、根瘤菌属GRH2种、黄豆中华根瘤菌(Sinorhizobiumsaheli)、Sinorhizobiumterangae、婉豆根瘤菌三叶草生物型(Rhizobiumleguminosarumbiovartrifolii)、豌豆根瘤菌蚕豆生物型(Rhizobmmleguminosarumbiovarviciae)、婉豆根瘤菌菜豆生物型(Rhizobiumleguminosarumbiovarphaseoli)、热带才艮瘤菌(Rhizobiumtropici)、菜豆才艮瘤菌(Rhizobiumetli)、山羊豆根瘤菌(Rhizobiumgalegae)、高卢根瘤菌(Rhizobiumgallicum)、贾氏根瘤菌(Rhizobiumgiardinii)、海南根瘤菌(Rhizobiumhainanense)、Rhizobiummongolense、羽扇豆根瘤菌(Rhizobiumlupini)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)、华癸中生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumciceri)、Mesorhizobiummediterraneium、天山中'艮生才艮瘤菌(Mesorhizobiumtianshanense)、Bradyrhizobiumelkanni、大豆'匱生才艮瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、iX宁'匱生才艮瘤菌(Bradyrhizobiumliaoningense)、氩瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)、AUobacteriumundicola、Phyllobacteriummyrsinacearum、根瘤农杆菌、放射形农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、毛根农杆菌、葡萄农軒菌(Agrobacteriumvitis)和悬钩子农軒菌(Agrobacteriumrubi)。还优选BroothaertsW等(2005)Nature433:629-633中描述的菌林和方法。农杆菌属、异根瘤菌属和根瘤菌属的单源性质和它们共同的表型属界限支持它们聚合为单一的属——^艮瘤菌属。农杆菌属菌抹(包括根瘤农杆菌和毛根农杆菌的分化)的分类和表征以及它们的多种冠瘿碱型种类是本领域公知的实践(参阅例如Laboratoryguideforidentificationofplantpathogenicbacteria,第三版.(2001)Schaad，Jones和Chun(编)ISBN0890542635;例如其中公开的Moore等的文章)。近期的分析证明根据其植物致病特征进行分类可能是不合理的。因此，使用基于基因组分析和比较(如16SrRNA测序；RFLP;R印-PCR等)的更先进的方法来阐明多种菌林的关系(参阅例如Young2003、Farrand2003、deBruijn1996、Vinuesa1998)。通过证明农杆菌菌林K599关系的两种方法得到的农杆菌属成员系统发生关系描述于Llob2003(图2)。本领域已知不仅是农杆菌，其他土传菌也能够介导T-DNA转移，只要它们具有Ti或Ri质粒的T-DNA转移的相关功能元件即可(Klein&Klein1953;Hooykaas1977;vanVeen1988)。优选所述土传细菌是农杆菌属的。本文所用的术语"农杆菌"是指土传的、革兰氏阴性的、棒状的植物致病细菌。根据比较性16SrDNA分析(Sawada1993，Young2003),农杆菌、根瘤农杆菌(同放射形农杆菌)、毛根农杆菌、悬钩子农杆菌和葡萄农杆菌的种与Allorhizobiumundicola—起形成含所有根瘤菌属物种的单源群。农杆菌是包含植物致病种的人造属。本文所用的术语Ti质粒是指下述质粒，所述质粒在农杆菌中能够复制，并且在被农杆菌感染的植物中天然是介导根癌的"有甲"形式。用农杆菌Ti质粒的天然、"有甲，，形式感染植物细胞通常导致被感染的细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，引起胭脂碱产生的农杆菌菌抹(例如菌林LBA4301、C58、A208)被称作"胭脂碱型"农杆菌；引起章鱼碱产生的农杆菌菌林(例如菌抹LBA4404、Ach5、B6)被称作"章鱼碱型"农杆菌；引起农杆碱产生的农杆菌菌林(例如菌林EHA105、EHA101、A281)被称作"农杆碱型，，农杆菌。卸曱Ti质粒理解为缺乏其根癌介导特征但是以其他方式提供植物感染功能的Ti质粒。优选，所述"卸甲"质粒的T-DNA区域以下述方式修饰除了边界序列外，没有功能性内部Ti序列可以被转移进植物基因组。在优选的实施方案(与二元载体体系使用时)中，缺失了整个T-DNA区(包括T-DNA边界)。本文所用的术语Ri质粒是指下述质粒，所述质粒在农杆菌中能够复制，并且在被农杆菌感染的植物中天然是介导发根病的"有甲"形式。用农杆菌Ri质粒的天然、"有甲"形式感染植物细胞通常引起被感染细胞产生冠瘿碱(由被转化植物细胞产生的特异"liJ4l衍生物，例如农杆碱、黄瓜碱、章鱼碱、mikimopine等)。毛根农杆菌菌林传统上以与根瘤农杆菌菌林相同的方式被区分为亚类。最常见的菌林是农杆碱型菌林(例如由Ri质粒pRi-A4所表征的)、甘露碱型菌林(例如由Ri质粒pRi8196所表征的)和黄瓜碱型菌抹(例如由Ri质粒pRi2659所表征的)。一些其他菌抹是mikimopine型的(例如由Ri质粒pRil723所表征的)。Mikimopine和黄瓜碱是立体异构体，但是在核苷酸水平上未发现pRi质粒间的同源性(Suzuki2001)。卸曱Ri质粒被理解为缺乏其发根病介导特征，但是以其他方式提供植物感染功能的Ri质粒。优选，所述"卸甲"Ri质粒的T-DNA区域以下述方式被修饰除了边界序列外，没有功能性内部Ri序列可以被转移进植物基因组。在优选的实施方案(当与二元载体体系使用时)中，缺失了整个T-DNA区(包括T-DNA边界)。根瘤农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri质粒分别带有负责植物遗传转化的基因(Kado1991)。载体以农杆菌Ti或Ri质粒为基础，并利用天然体系将DNA转移进入植物基因组。作为该高度发达寄生的一部分，农杆菌将其基因组信息的指定部分(T-DNA;侧翼为约25bp的重复，称作左边界和右边界)转移进植物细胞的染色体DNA(Z叩an2000)。通过所谓的vir基因(原始Ti质粒的部分)的组合作用介导了所述DNA转移。为了利用该天然体系，开发了缺乏原始肿瘤诱导基因的Ti质粒("卸曱载体")。在进一步的改良——所谓的"二元载体体系"——中，通过整合进入穿梭载体将T-DNA从Ti质粒的其他功能元件(例如vir基因)物理分离，这允许更容易地操作(EP-A120516;US4.940.838)。这些二元载体(除卸甲T-DNA及其边界序列夕卜)包含用于在农杆菌和大肠杆菌(E.coli)二者中复制的原核序列。农杆菌介导的转化的一个优点在于通常只有被边界包围的DNA被转移进基因组中，且优选只有一个拷贝被插入。农杆菌载体体系和用于农杆菌介导的基因转移的方法的描述是本领域已知的(Miki1993;Gruber1993;Moloney1989)。因此，对农杆菌介导的转化而言，遗传组合物(例如包含表达盒)被整合进特定的质粒(穿梭质粒或中间体质粒)中或二元载体中。如果要将Ti或Ri质粒用于转化，则至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界(但是大部分情况下是右边界和左边界)与要以侧翼区形式被引入的表达盒连接。优选使用二元载体。二元载体能够在大肠杆菌和农杆菌二者中复制。它们可包含选择性标记基因和侧翼被右和左T-DNA边界序列包围的接头或多聚接头(用于插入例如待转移的表达盒)。它们可以被直接转移进农杆菌(Holsters1978)。选择性标记基因允许选择经转化的农杆菌，并且是例如赋予卡那霉素抗性的nptll基因。在该情况下起宿主生物作用的农杆菌应当已经包含具有vir区的质粒。后者是将T-DNA转移至植物细胞所需的。以这种方式转化的农杆菌可用于转化植物细胞。T-DNA用于转化植物细胞的用途已被深入地研究并描述(EP120516;Hoekema1985;An1985)。常见的二元载体是以"广宿主泛围"质粒为基础的，如来自P型质粒RK2的pRK252(Bevan1984)或pTJS75(Watson1985)。大部分这类载体是pBIN19(Bevanl984)的衍生物。多种二元载体是已知的，其中一些可以商业获得，例如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories,Inc.美国)。其他的载体是才艮据尺寸和操作进行了改良的(例如pPZP;Hajdukiewicz1994)。改良的载体体系也描述于WO02/00900。优选土传细菌是属于农杆菌科的细菌，更优选属于卸曱根瘤农杆菌或毛根农杆菌菌林。在优选的实施方案中，用于本发明实践的农杆菌菌林包括章鱼碱菌林(例如LBA4404)或农杆碱菌林(例如EHA101或EHA105)。用于DNA转移的合适根瘤农杆菌菌林是例如EHA101pEHA101(Hood1986)、EHA105[pEHA105(Li1992)、LBA440pAL4404(Hoekema1983)、C58Cl[pMP90j(Koncz&Schell1986)和C58Cl[pGV2260(Deblaere1985)。其他合适的菌林是根瘤农杆菌C58——一种胭脂碱菌林。其他合适的菌林是根瘤农杆菌C58Cl(VanLarebeke1974)、A136(Watson1975)或LBA4011(Klapwijk1980)。在另一优选的实施方案中，土传细菌是毛根农杆菌菌株K599的卸甲菌林变体(NCPPB2659)。这类菌株描述于2004年9月2日提交的美国临时申请申请No.60/606789,其在本文引用作为参考。优选，这些菌林包含Ti或Ri质粒的卸甲质粒变体，其提供将T-DNA转移进入植物细胞所需的功能(例如vir基因)。在优选的实施方案中，用于转化植物组织的农杆菌菌林含有L，L-琥珀碱型Ti质粒(优选卸曱的，例如pEHA101)，所述植物组织用植物酚化合物预培养。在另一优选的实施方案中，用于转化植物组织的农杆菌菌抹含有章鱼碱型Ti质粒(优选卸甲的，例如pAL4404),所述植物组织用植物酚化合物预培养。一般地，当使用章鱼碱型Ti质粒或辅助质粒时，优选virF基因被缺失或灭活(Jarschow1991)。本发明的方法也可与特定的农杆菌菌林结合使用以进一步提高转化效率，如下述农杆菌菌林，所述农杆菌菌抹中因为存在突变或嵌合的virA或virG基因而改变了vir基因表达和/或其诱导(例如Hansen1994;Chen和Winans1991;Scheeren-Groot，1994)。优选为根瘤农杆菌菌抹LBA4404(Hiei1994)与超毒性质粒的进一步结合。优选这些是基于pTOK246的载体(Ishida1996)。二元载体或任何其他载体可通过常见的DNA重组技术修饰，在大肠杆菌中扩增，并通过例如电穿孔或其他转化技术(Mozo1991)引入农杆菌。优选以与Ishida(Ishida1996)中描述相似的方式培养并使用农杆菌。含载体的农杆菌菌株可例如在补充有合适抗生素(例如50mg/1壮观霉素)的YP培养基(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/lNaCl、15g/l琼脂，pH6,8)上生长3天。用接种环从固体培养基上收集细菌并将其重悬。在本发明优选的实施方案中，通过使用冻存于-80。C的等分式样开始农杆菌培养。通过农杆菌转化不成熟胚可以通过仅将不成熟胚与农杆菌接触完成。用于感染和共培养的农杆菌浓度可能需要变化。例如，制备具有约105到1011,优选106到101()，更优选约l()S细胞或cfu/ml种群密度的农杆菌细胞悬液，将不成熟胚浸没入该悬液中大约3到IO分钟。然后将得到的不成熟胚在固体培养基上与农杆菌一同培养数天。在用于感染和共培养步骤的另一优选实施方案中，将共培养或感染培养基中的土传细菌(例如农杆菌)的悬液直接应用于每个胚，去除覆盖胚的多余液体量。可通过多种方式进行去除，优选通过晾干或吸干。这是省力省时的，并且降低由多余农杆菌使用造成的非故意的农杆菌介导的损伤。在优选的实施方案中，使用从约lpl到约10pl的土传细菌(例如农杆菌)悬液。优选，用农杆菌直接在共培养基上感染不成熟胚。优选，使用106到1011cfu/ml浓度的细菌。为了用农杆菌处理分离的不成熟胚，将细菌重悬于植物适用的共培养培养基中。向共培养培养基中补充乙烯抑制剂(例如硝酸银)、吸收酚的化合物(如聚乙烯吡咯烷酮，Perl1996)或抗氧化剂(例如硫醇化合物如二硫苏糖醇、L-半胱氨酸，01hoft2001)可进一步促进农杆菌介导的转化的效率，补充的所述化合物能够降低由植物防御反应(如酚氧化)引起的组织坏死。在另一优选的实施方案中，共培*养基由至少一种硫醇基化合物组成，所述硫醇基化合物优选选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和L-半胱氨酸。优选浓度在约1mM和10mM的L-半胱氨酸之间，0.1mM到5mM的DTT和/或0.1mM到5mM的硫代硫酸钠。优选，共培养中使用的培养基包含从约1jtM到约10的硝酸银和/或(优选"和")从约50mg/L到约1,000mg/L的L-半胱氨酸。这导致不成熟胚针对农杆菌介导的损伤(例如i秀导的坏死)易损性高度降低，并高度提高整体转化效率。可使用从数小时到7天的共培养周期范围。农杆菌与分离的不成熟胚一起共培养通常进行从约12小时到约5天，优选从约1天到约3天。在本发明的改良实施方案中，可在农杆菌共培养之前或期间用酚化合物处理分离的不成熟胚和/或农杆菌。适用于本发明范围的"植物酚化合物"或"植物酚"是能够诱导正向趋化应答的经分离的取代酚分子，特别是在含Ti质粒的农杆菌属物种(特别是含Ti质粒的根瘤农杆菌)中能够诱导提高的vir基因表达的那些。测量对植物酚化合物趋化反应的方法已被描述(Ashby1988)，测量vir基因表达诱导的方法也是公知的(Stachel1985;Bolton1986)。农杆菌共培养期间的预处理和/或处理至少具有两个有益效应诱导Ti质粒或辅助质粒的vir基因(VanWordragen1992;Jacq1993;James1993;Guivarc'h1993),和增强外源DNA掺入进植物细胞基因组中的感受态。优选的植物酚化合物是在植物细胞伤口渗出物中发现的那些。最公知的植物酚化合物之一为乙酰丁香酮，其存在于多种植物的大量受伤和完整细胞中，虽然浓度不同。然而，乙酰丁香酮(3，5-二甲氧基-4-对羟基苯乙酮)不是能够诱导vir基因表达的唯一植物酚。其他实例为a-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(l，2-二羟基苯)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、p-二羟基甲酸(2,4-二羟基苯甲酸)、原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)、pyrrogallicacid(2，3，4-三羟基苯甲酸)、五倍子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)和香草醛(3-曱氧基-4-羟基苯曱醛)，和已知或预测能够在培养基中以相似结果代替乙酰丁香酮的酚化合物。在本文使用时，所述分子被称作植物酚化合物。率。另外，某些化合物如渗透保护剂(例如，优选以约700mg/L浓度的L-脯氨酸或甜菜碱)、植物激素(NAA等)、冠瘿碱或糖被添加时与植物酚化合物组合协同作用。在本发明的一个实施方案中，优选在分离的不成熟胚与农杆菌接触之前(例如数小时到一天)将植物酚化合物(特别是乙酰丁香酮)添加至培养基。在含植物酚化合物(如乙酰丁香酮)的培养基中孵育培养细胞的确切时间据认为不是关键性的，其仅受不成熟胚开始分化的时间限制。也相信培养基中植物酚化合物的浓度对用于整合性转化的感受态发育具有影响。培养基中植物酚化合物的最佳浓度范围可根据玉米变种(不成熟胚来自其中)而不同，但是预期约100jiM到700nM是适用于许多目的的浓度。然而，低至约25jnM的浓度可用于获得对转化效率的好影响。同样，预期高达约1000jiM的更高浓度会产生相似的影响。应用于其他植物酚化合物的相当浓度和最佳浓度可通过实验根据本发明容易地确立。要与经分离的不成熟胚共培养的农杆菌可以如本领域技术人员已知的用乙酰丁香酮或另一植物酚化合物预孵育，或从其培养基中分离后直接使用。用于根瘤农杆菌的特别适合的诱导条件已由Vernade等(1988)描述。农杆菌转化效率可以通过本领域已知的大量其他方法增强，例如真空渗入(WO00/58484)、热激和/或离心、添加硝酸银、超声处理法等。在本发明中观察到用农杆菌转化分离的不成熟胚的效率可以如下所述显著地提高将共培养培养基的pH保持在从5.4到6.4的范围内，优选5.6到6.2，特别优选5.8到6.0。在本发明的改良实施方案中，通过MES和磷酸氢钾緩冲液的组合介导pH稳定在该范围中。2.3恢复转化的细胞(即包含整合进宿主细胞DNA中的DNA的细胞)可从未转化的细胞中选择，优选使用本发明的选择方法。转移至恢复和/或选择性培养基之前，特别是在农杆菌介导的转化的情况下，可使用某些中间步骤。例如，可将共培养步骤剩余的任何农杆菌去除(例如通过洗涤步骤)。为了阻止所述细菌再生长，随后使用的恢复和/或选择性培养基优选包含适用于阻止农杆菌生长的杀菌剂(抗生素)。待使用的优选杀菌性抗生素为例如羧节青霉素(500mg/L)或特美汀TM(GlaxoSmithKline;替卡西林二钠和棒酸钾的混合物；0.8g特美汀TM含有50mg棒酸钾和750mg替卡西林)。化学上，替卡西林二钠是^(2-羧基-3，3-二曱基-7-氧代-4-硫代-1-氮杂二环[3.2.0庚-6-基)-3-疏代-苯丙酰胺酸二钠盐。化学上，棒酸钾是(Z)-(2R，5R)-3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂二环[3.2.0庚烷-2-羧酸钾。优选直接跟随转化步骤的步骤(例如共培养)不包含有效的、毒害植物量的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物(其随后用于转化)。因此，该步骤旨在允许转化的组织再生、促进农杆菌感染的胚中开始形成胚性愈伤组织，并杀死剩余的农杆菌细胞。因此，在本发明方法优选的实施方案中包括将转化的靶组织(例如共培养的不成熟胚)转移至(步骤c中使用的)恢复培养基上的步骤，所述培养基包含i.有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻抑土传细菌生长，和/或(优选"和")ii.浓度从约1g/1到约10g/l的L-脯氨酸，和/或(优选"和")iii.浓度从约1nM到约50的硝酸银。优选所述恢复培养基不包含有效的、毒害植物量的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物。恢复培养基还可包含有效量的至少一种植物生长调节物(例如有效量的至少一种生长素化合物)。因此，步骤c)的恢复培养基优选包含i.有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻抑土传细菌生长，和ii.浓度从约lg/l到约10g/l的L-脯氨酸，和iii.浓度从约1nM到约50nM的硝酸银，和iv.有效量的至少一种生长素化合物。优选的恢复培养基的实例在下文实施例(A-4或A-5)中给出。恢复阶段可持续约1天到约14天，优选约5天到约8天。优选，该时间段中盾片侧保持向上并且不能埋入培养基中。2.4选择恢复步骤后，将靶组织(例如不成熟胚)转移至选择性培养基上并培养。选择性培养基含有毒害植物的浓度(即终止或延迟未转化细胞生长的浓度)的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物。本文使用术语"毒害植物的"、"毒害植物性"或"毒害植物效应，，旨在表示对植物或植物细胞生理学的任何可测量的负面效应，其导致的症状包括(但不限于)例如降低或受损的生长、降低或受损的光合成、降低或受损的细胞分裂、降低或受损的再生(例如从细胞培养物、愈伤组织或枝条等再生成熟的植物)、降低或受损的生育力等。毒害植物性还可包括例如坏死或细胞凋亡的效应。在优选的实施方案中，导致与未用所述毒害植物化合物处理的植物相比，生长或再生性降低至少50%，优选至少80%,更优选至少卯％。用于选择的特异化合物根据所表达的标记蛋白质选择。例如在使用大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶的情况下，在含有D-丝氨酸的培养基上进行选择。在使用瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶的情况下，在含有D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行选择。使用D-氛基酸的事实不排除L-氛基酸结构或L-氩基酸的存在。对一些应用而言，(由于成本原因)可优选应用D-和L-氨基酸的外消旋混合物(或D-氨基酸含量富集的混合物)。优选D-氨基酸与相应L-对映异构体的比例为至少1:1，优选2:1，更优选5:1，最优选10:1或100:1。D-丙氨酸的使用具有下述优点可应用D-和L-丙氨酸的外消旋混合物而没有L-对映异构体的千扰效应或有害效应。因此，在改良的实施方案中，使用D/L國丙氨酸的外消旋混合物作为化合物。关于D-丙氨酸或D-丝氨酸的术语"衍生物"是指包含D-丙氨酸或D-丝氨酸各自的D-氨基酸结构，但是被化学修饰的化合物。本文使用术语"D-氨基酸结构，，(例如"D-丝氨酸结构，，)旨在包括D-氨基酸以及保持该化合物功能活性的D-氨基酸类似物、衍生物和拟态。本文使用术语"衍生物"也涉及D-丝氨酸或D-丙氨酸的形式，其中化合物上的一个或多个反应基团被衍生为取代基。使用的D-氨基酸可以被氨基端或羧基端修饰基团或被侧链修饰修饰。M端修饰基团可以是例如选自苯乙酰基、二苯乙酰基、三苯乙酰基、丁酰基、异丁酰基、己酰基、丙酰基、3-羟基丁酰基、4-羟基丁酰基、3羟基丙酰基、2，4-二羟基丁酰基、1-金刚烷羰基、4-曱戊酰基、2-羟基苯乙酰基、3-羟基苯乙酰基，4-羟基苯乙酰基、3，5-二羟基-2-萘曱酰基、3，7-二羟基-2-萘曱酰基、2-羟基肉桂酰基、3-羟基肉桂酰基、4-羟基肉桂酰基、氢肉桂酰基、4-曱酰肉桂酰基、3-羟基-4-甲氧肉桂酰基、4-羟基國3-甲氧肉桂酰基、2-g肉桂酰基、3，4，-二羟基氬肉桂酰基、3，4-二羟基肉桂酰基、反式-肉桂酰基、(士)-杏仁酰基、(±)-杏仁酰-(±)-杏仁酰基、乙醇酰基、3-甲酰苯甲跣基、4-曱酰苯甲酰基、2-曱酰苯氧乙酰基、8-曱酰-l-萘甲酰基、4-(羟甲基)苯曱酖基、3-羟基苯甲酰基、4-羟基苯曱酰基、5-乙内酰脲乙酰基、L-氢乳酰基、2,4-二羟基苯甲酰基、3-苯甲酰丙酰基、(±)-2，4-二羟基-3，3-二甲基丁酰基、DL-3-(4-羟苯基)乳酰基、3-(2-羟苯基)丙酰基、4-(2-羟苯基)丁酰基、D-3-苯基乳酰基、3-(4-羟苯基)丙酰基、L-3-苯基乳酰基、3-吡啶乙酰基、4-吡咬乙酰基、异烟酰基、4-会啉羧基、1-异会啉羧基和3-异全啉羧基。羧基端修饰基团可以是例如选自酰胺基、烷基酰胺基、芳基酰胺基和羟基。本文使用"衍生物"旨在包括模拟各D-氨基酸结构的化学结构并保持所述D-氨基酸结构功能特性的分子。设计氨基酸或肽类似物、衍生物和拟态的方法为本领域已知(例如参阅Farmer1980;Ball19卯；Morgan1989;Freidinger1989;Sawyer1995;Smith1995;Smith1994;Hirschman1993)。其他可能的修饰包括N-烷基(或芳基)取代，或主链交联以形成内酰胺结构和其他环状结构。其他衍生物包括C-端羟甲基衍生物、O修饰的衍生物(例如C端羟甲基二节醚)、N端修饰的衍生物(包括取代的酰胺，如烷基酰胺和酰阱)。另外，可使用包含除草剂化合物的D-氨基酸结构。这类化合物例如描述于US5,059,239，并可包括(但不应限于)N-苯曱酰基-]\-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸、N-苯甲酰基-]\-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸甲酯、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL丙氨酸乙酯、N-苯甲酰基隱N-(3國氯画4画氟苯基)-D-丙氨酸、N國苯甲酰基画N-(3-氯-4-氟苯基)画D國丙氨酸甲酯或N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸异丙酯。选择化合物可以与其他物质组合使用。就应用的目的而言，选择化合物也可以与配制领域常规使用的佐剂一起使用，从而以已知的方式被配制为例如可乳化的浓缩剂、可包衣的糊剂、可直接喷雾或稀释的溶液、稀释乳剂、可湿润的粉剂、可溶粉剂、粉尘、颗粒剂，还有包裹在例如多聚体物质中。使用待使用的化合物的性质，根据预期目的和主要环境选择应用方法，例如喷雾、雾化、粉尘化、分歉、包被或倾注。然而，更优选选择化合物直接用于培养基。优点是选择化合物的储存溶液可以在室温下制造并储藏4艮长时间而不丧失选择效率。选择化合物(即D-丙氨酸、D-丝氨酸、其衍生物或其任意组合)的最佳浓度可根据用于转化的靶组织而变化，但是通常(并优选用于不成熟胚转化时)D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的总浓度(即混合物情况下的总和)在约1mM到约100mM的范围内。例如使用大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶的情况下，在培养基上进行选择，所述培养基优选含有从约lmM到约100mM、更优选从约5mM到约50mM、进一步更优选从约7mM到约30mM、最优选从约10到20mM浓度的D-丝氨酸(例如掺入琼脂固化的MS培养平板)。在使用瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶的情况下，在培养基上进行选择，所述培养基优选含有总浓度从约1mM到100mM、更优选从约2mM到约50mM、进一步更优选从约3mM到约20mM、最优选从约5到15mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸(例如掺入琼脂固化的MS培养平板)。选择时间也可根据使用的靶组织和使用的再生方案变化。通常选择时间至少为5天。更特别地，去分化条件(即愈伤组织诱导)下的总选择时间为从约1天到约10周，优选3到7周，更优选3到4周。然而，优选去分化条件下的选择被使用不长于70天。在选择阶段之间，愈伤组织可被转移至新鲜的选择性培养基上一次或多次。对本文提供的特定方案而言，优选使用两个选择性培养基步骤(例如一次转移至新的选择性培养基)。优选分两步进行选择步骤，使用约5到20天的第一选择步骤，然后将存活的细胞或组织转移至第二选择性培养基上再选择5到20天，所述第二选择性培养基与所述第一选择性培养基具有基本相同的组成。然而，也可能应用单步骤选择。优选所述选择性培养基也是去分化培养基，其含有至少一种合适的植物生长调节剂用于诱导胚性愈伤组织形成。本文使用术语"植物生长调节剂，，(PGR)是指天然存在的或合成的(非天然存在的)化合物，其能够调节植物生长和发育。PGR可单独作用或彼此聚合作用或与其他化合物(例如糖、氨基酸)聚合作用。更具体地，用于胚性愈伤组织诱导和选择的培养基包含i.有效量的至少一种生长素化合物，和ii.有效量的选择剂，所述选择剂允许选择包含转基因细胞。另外，胚性愈伤鎮织诱导培养基可任选地包含有效量的至少一种抗生素，所述抗生素抑制或阻抑土传细菌(如上文定义)的生长。术语"生长素"或"生长素化合物"包括下述化合物，其刺激细胞伸长和分裂、维管组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生并且——在高浓度下——诱导去分化(愈伤组织形成)。最常见的天然存在生长素是吲哚乙酸(IAA),其在根和茎中被极性转运。合成生长素化合物在现代农业中被广泛使用。合成生长素化合物包括吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。用作单独生长素化合物作用时，优选使用约0.2mg/1到约6mg/1的浓度，更优选约0.3到约2mg/1，最优选约1.5mg/1的2,4-D。当使用其他生长素化合物或其组合时，以下述方式选择它们优选的组合去分化效应相当于将上文定义浓度的2，4-D用作单独生长素化合物时所达到的效应。因此，生长素化合物的有效量优选相当于约0.2mg/l到约6mg/1(更优选约0.3到约2mg/l，最优选约1.5mg/1)浓度的2,4-D。另外，可使用不同生长素的组合，例如2,4-D和百草枯(Picloram)的组合。优选，约0.5mg/l浓度的2，4-D可以与一种或多种其他类型的生长素化合物(例如浓度约1到约2mg/1的百草枯)组合用于促进胚性愈伤组织形成的质量/数量。培养基还可任选地补充有一种或多种额外的植物生长调节剂，如例如细胞分裂素化合物(例如6-节氨基嘌呤)和/或其他生长素化合物。这类化合物包括，但不仅限于IAA、NAA、IBA、细胞分裂素、生长素、细胞激动素(kinetin)、N-膦酰甲基甘氨酸和thiadiazorun。细胞分裂素化合物包括例如6-异戊烯腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/6-苄氨基嘌呤(BAP)。D-ll&酸代谢酶的存在不排除使用额外的标记。选捧(选择化合物的应用)可在去分化和选择阶段后结束。然而，优选也在随后的再生阶段(部分或贯穿全部)中，甚至在生根时应用选择。2.5再生可以以已知的方式诱导从去分化的细胞形成枝条和根。获得的枝条可以被种植和培养。可以培养通过任何以上转化技术获得的转化的植物细胞，来再生完整的植物，所述完整的植物具有转化的基因型从而具有预期的表型。这类再生技术依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素。描述了从培养的原生质体中再生植物(例如在Evans1983;Binding1985中)。再生也可得自植物愈伤组织、外植体、体细胞胚(Dandekar1989;McGranahan19卯)、器官或其部分。这类再生技术被一般描述(例如在Klee1987中)。其他可以获得的再生技术在Vasil1984和Weissbach1989中综述。去分化和选择阶段(如上所述)后，将得到的细胞(例如成熟胚性愈伤组织)转移至允许转基因小植抹转换的培养基上。优选这类培养基不包含导致去分化的浓度的生长素，如2，4-D。在优选的实施方案中，这类培养基可包含一种或多种选自以下的化合物i)细胞分裂素如玉米素，优选以约0.5到约10mg/L，更优选从约1.5到约5mg/L的浓度，ii)有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻抑土传细菌(如上所定义的)的生长，和iii)有效量的选择剂(例如D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物)，其允许选捧转基因细胞(例如包含转基因T-DNA)。优选将胚性愈伤组织在该培养基上孵育直到形成枝条，然后转移至生根培养基。这类孵育可耗时1到5周，优选2到3周。将再生的枝条或小植抹(即带根的枝条)转移至含生根培养基(例如配方A-8描述的培养基)的Phytatray或Magenta盒中，孵育直到发育成生根的小植林(通常1到4周，优选2周)。将生^f艮的幼苗转移至Metromix土壤并如本领域所述培养为成熟植物(见实施例)。在本发明优选的实施方案中，使用改良的步骤并将在平板上再生的小植株直接移植到温室中的MetroMix中，省略在生根盒中的步骤，从而节省时间和劳力。得到的植物可以以常规方式育种和杂交。应当培养两代或更多世代，从而确保基因组整合是稳定和遗传的。例如在开花阶段时，将转基因植物的雄花穗用棕色纸袋包装，防止花粉脱落。对转基因植物进行传粉。最好对转基因植物进行自花传粉。如果抽丝和开花不是同步的，则应当可用与转基因T。植物具有相同遗传背景的野生型花粉供体或受体植物，用于进行异花传粉。收集Ti种子、干燥并用足够的标签适当地保存在种子袋中。收集转基因L种子后，包括土壤和盆的To植物应当包装在高压灭菌袋中高压灭菌(双重装袋)。2.6产生后代转化、选择和再生转基因植物(其包含本发明的DNA构建体)后产生后代，其(因为切除启动子的活性)经受切除并且不包含标记序列和内切核酸酶的表达盒。可通过有性繁殖或无性繁殖产生后代。无性繁殖可通过以本领域公知的技术引入体胚胎发生来实现。优选通过有性繁殖/受精产生后代。受精可通过自交(自花传粉)或与其他转基因或非转基因植物杂交实现。本发明的转基因植物在本文中可作为母本或父本植物发挥作用。受精过程后将种子收集、萌发并培养为成熟的植物。经受切除过程的后代的分离和鉴定可在植物发育的任何阶段进行。用于所述鉴定的方法为本领域7>知，并包括例如PCR分析、Northern印迹、Southern印迹或表型筛选(例如使用阴性选择标记)。后代可包含一个或多个拷贝的具有农业价值的性状基因。优选分离仅含有一个拷贝所述性状基因的后代。还根据本发明的是来自上述转基因生物的细胞、细胞培养物、部分(例如在转基因植物生物的情况下为根、叶等)，和转基因繁殖材料(例如种子或果实)。可祐人或动物消耗的根据本发明的遗传修饰的植物也可用作食物或饲料，例如直接使用或在本身已知的加工后使用。在此，由于消费者的接受度以及产品的安全性考虑，删除例如在生成转基因植物时通常引入的对抗生素和/或除草剂的抗性。本发明的另一主题涉及本发明的上述转基因生物和来自它们的细胞、细胞培养物、部分(例如在转基因植物生物的情况下为根、叶等)和转基因繁殖材料(例如种子或果实)用于生产食品或饲料、药物或精细化学品的用途。其中由于消费者的接受度和产品安全的原因，删除例如对抗生素和/或除草剂的抗性是有利的。精细化学品理解为表示酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然和合成的香料、香味和着色剂。特别优选生育酚和生育三烯酚和类胡萝卜素的生产。通过技术人员已知的方法培养转化的宿主生物并从所述宿主生物或培养基中进^f亍分离。已描述(例如由Hood1999;Ma1999)药物(例如抗生素或疫苗)的生产。3.其他修饰3.1反选择和随后的标记缺失用于D-氨基酸代谢酶的第一表达构建体可优选的以以下方式构建，所述方式允许随后的标记缺失，特别是当所述酶是D-氨基酸氧化酶时，所述D-氨基酸氧化酶可用于阴性选择和反选择二者(即二元功能标记)。这类方法在(ADD)中详细描述，其被引入本文作为参考。就该目的而言，第一表达盒优选侧接允许所述第一表达盒特异缺失的序列。本发明的实施方案利用D-氩基酸氧化酶(DAAO)作为二元功能标记的特性，即用作允许(取决于使用的底物)阴性选择标记和反选择标记二者的标记。与像D-丝氨酸和D-丙氨酸的D-氨基酸(其对植物是高度植物毒性，并被D-氨基酸氧化酶"去毒，，)相反，D-缬氨酸和D-异亮氨酸对野生型植物没有毒性，但是被表达D-氨基酸氧化酶DAAO的植物转化为有毒化合物。DAAO表达减轻D-丝氨酸和D-丙氨酸毒性，但诱导代谢改变(所述改变4吏D-异亮氨酸和D-缬氨酸有毒)的发现证明该酶可在植物中提供底物依赖性的、二元功能的、可选择的标记。因此，本发明的另一实施方案涉及产生转基因玉米植物的方法，包括i)用第一DNA构建体转化玉米植物，所述第一DNA构建体包含a)至少一个第一表达构建体，所述第一表i^j建体包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码D-氨基酸氧化酶，其中所述第一表达盒侧接允许特异缺失所述第一表达盒的序列，和b)至少一个第二表达盒，所述表达盒适合赋予所述植物有农业价值的性状，其中所述第二表达盒不位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间，和ii)用毒害植物浓度的第一化合物处理步骤i)的所述经转化玉米植物细胞，并选择其基因组中包含所述第一DNA构建体的植物细胞，所述第一化合物选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物，所述第一DNA构建体通过表达所述D-氨基酸氧化酶赋予所述经转化的植物细胞针对所述第一化合物的抗性，和iii)诱导从所述经转化植物细胞的基因组中缺失所述第一表达盒，并用对仍然包含所述第一表达盒的植物细胞有毒浓度的第二化合物处理所述植物细胞，从而选择包含所述第二表达盒但是缺乏所述第一表达盒的植物细胞，所述笫二化合物选自D-异亮氨酸、D-缬氨酸及其衍生物。优选的泛素启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。优选第一表达盒的缺失可通过本领域已知的多种手段实现，包括但不限于一种或多种以下方法a)由序列特异的重组酶诱导的重组，其中所述第一表达盒侧接相应的重组位点，使得所述侧翼重组位点之间的重组导致中间的序列从基因组中缺失，b)在所述第一表达盒侧翼的同源性序列A和A，之间的同源重组，优200680027145.4说明书第60/100页引起)诱导，其中所述同源序列A和A，具有足够的长度和同源性，从而确保A和A，之间的同源重组，并具有方向，A和A，之间重组时所述方向会导致所述第一表达盒从基因组中被切除。本领域技术人员可获得多种手段将缺失/切除诱导机制与本发明的DNA构建体(其包含D-氨基酸氧化酶二元功能选择标记)组合。优选本发明方法中可使用的重组酶或内切核酸酶可通过选自以下的方法表达a)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异内切核酸酶的第二表达盒整合进所述DNA构建体中，优选与所述第一表达盒一起，所述第一表达盒侧接允许特异缺失的所述序列，b)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异内切核酸酶的第二表达盒整合进植物细胞或植物中，从而产生主要细胞系(mastercelllines)或细胞，所述植物细胞或植物被用作转化的耙材料，c)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异内切核酸酶的第二表达盒整合进独立的DNA构建体中，所述独立的DNA构建体借助于共转化与所述第一DNA构建体一起^f皮转化进所述植物细胞中，d)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异内切核酸酶的第二表达盒整合进植物细胞或植物中，所述植物细胞或植物随后与含有本发明DNA构建体的植物杂交。在另一优选的实施方案中，缺失/切除的机制可以以预防二元功能标记的过早缺失/切除的方式被诱导或激活。因此优选地，所优选使用的序列特异性重组酶或内切核酸酶的表达和/或活性可以蜂皮诱导和/或激活，优选通过选自以下的方法a)诱导型表达，其通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列与诱导型启动子有效连接进行，b)诱导型激活，其通过使用含有配体结合结构域的修饰的重組酶或内切核酸酶进行，其中所述<务饰的重组酶或内切核酸酶的活性可以通过下述化合物的处理被修饰，所述化合物对所述配体结合结构域具有结合活性。因此优选本发明的方法产生不含选择标记的植物细胞或植物。本发明的另一主题涉及DNA构建体，其适用于在本发明的方法中使用。本发明方法中使用的DNA构建体优选包含a)第一表达盒，所述第一表达盒包含与泛素启动子有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码D-氨基酸氧化酶，其中所述第一表达盒侧接允许特异缺失所述第一表达盒的序列，和b)至少一个第二表达盒，所ii^达盒适合赋予所述植物有农业价值的性状，其中所述第二表达盒不位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间。优选泛素启动子和D-氨基酸氧化酶序列如上文定义。为了确保标记缺失/切除，本发明DNA构建体中包含的D-氨基酸氧化酶的表达盒(第一表达构建体)以下述方式侧接序列特异性重组酶的重组位点所述侧翼重组位点之间诱导的重组导致所述第一表达盒从基因组中被缺失。优选允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列选自以下序列a)以下述方式排列的针对序列特异性重组酶的重组位点所述侧翼重组位点之间的重组导致之间的序列从基因组中缺失，和b)同源性序列A和A，，其具有足够的长度和同源性从而确保A和A，之间的同源重组，并具有方向，A和A，之间重组时所述方向会导致之间的序列从基因组中缺失。优选构建体包含针对序列特异性核酸酶的至少一个识别位点，所述位点位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间(特别是对于上文变体b而言)。本领域已知多种重组位点和相应的序列特异性重组酶，其可用于本发明的目的。本领域技术人员熟知多种用于重组诱导的核酸序列定点去除的体系。他们主要基于序列特异性重组酶的使用。描述了多种序列特异重组体系，例如噬菌体Pl的Cre/lox体系(Dalel991;Russell1992;Osborne1995)、酵母FLP/FRT体系(Kilby1995;Lyznik1996)、Mu噬菌体Gin重组酶、大肠杆菌Pin重组酶或质粒pSRl的R/RS体系(Onouchi1995;Sugita2000)。也可使用基于attP位点和噬菌体入重组酶的体系(Zubko2000)。适用于与本文所述方法组合〗吏用的其他方法描述于WO97/037012和WO02/10415中。在优选的实施方案中，二元标记序列的缺失/切除通过序列特异双链断裂i秀导的同源重组4皮缺失。基本的原则>^开于WO03/004659，引入本文作为参考。就该目的而言，第一表i^I建体(编码二元功能标记)侧接同源序列A和A，，其中所述同源序列具有足够的长度和同源性从而确保A和A，之间的同源重组，并具有方向，A和A，之间重组时所述方向会导致第一表达盒从基因组中切除。另外，所述同源序列侧接的序列还包含至少10>^^的至少一个识别序列，用于DNA双链断裂的定点诱导，所述诱导由序列特异的DNA双链断裂诱导酶引起，优选序列特异的DNA内切核酸酶，更优选回归内切核酸酶，最优选选自以下的内切核酸酶I-Scel、I-Ceul、I-Cpal、I-CpaII、I-CreI和I-ChuI或其带有配体结合结构域的嵌合体。内切核酸酶或重组酶的表达盒(包含与植物启动子有效连接的序列特异性重组酶或内切核酸酶)可以包括在本发明的DNA构建体中。优选所述第二表达盒与所述第一表达盒一起被所述允许特异缺失的序列侧接。在另一优选的实施方案中，所述序列特异性重组酶或内切核酸酶的表达和/或活性可以;故诱导和/或激活，用于避免二元功能标记在其仍需要作为阴性选择标记起作用的阶段中过早缺失/切除。优选诱导/激活可以通过选自以下的方法实现a)诱导型表达，其通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列与诱导型启动子有效连接，b)诱导型激活，其通过使用含有配体结合结构域的修饰的重组酶或内切核酸酶，其中所述^f务饰的重组酶或内切核酸酶的活性可以通过处理对所述配体结合结构域具有结合活性的化合物而修饰。本发明的其他实施方案涉及含有本发明DNA构建体的转基因载体。包含本发明DNA构建体或载体的转基因细胞或非人生物。优选所述细胞或非人生物是植物细胞或植物，优选是具有农业用途的植物。本发明使得能够通过高效率的、可精确预测的方式产生不含标记的转基因细胞或生物，优选植物。就反选择步骤(ii)而言，关于D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的化合物选择、浓度、应用方式的优选在上文描述于一般选择流程的背景中。就反选择步骤(iii)而言，化合物选自包含D-异亮氨酸或D-缬氨酸结构的化合物。更优选化合物选自D-异亮氨酸和D-缬氨酸。最优选用于反选择的化合物或组合物包含D-异亮氨酸。当通过细胞培养基应用(例如掺入琼脂固化的MS培养平板中)时，可以以约0.1mM到约100mM、优选约1mM到约50mM、更优选约10mM到约30mM的浓度4吏用D-异亮氨酸。当通过细胞培养基应用(例如掺入琼脂固化的MS培养平板中)时，可以以约I到约IOOmM、优选约5到50mM、更优选约15mM到约30mM的浓度l吏用D-缬氨酸。因此，-使用上述方法可能产生不含标记的玉米植物。本文关于细胞或生物使用术语"不含标记"或"不含选择标记，，旨在表示不能表达功能性选择标记蛋白质(由表达盒b编码；如上文定义)的细胞或生物，所述选择标记蛋白质与编码具有农业价值性状的基因一起被插入所述细胞或生物。可以部分或优选完全不存在编码所述选择标记蛋白质的序列。另外，与其有效连接的启动子可以通过部分或完全不存在而不具功能。然而得到的植物可包含作为选择标记作用的其他序列。例如，植物可包含赋予除草剂抗性的基因作为具有农业价值的性状。然而，最优选得到的植物不包含任何选择标记。本发明的多种其他方面和实施方案会是本领域技术人员根据本发明的公开而理解的。本说明书中提到的所有文件以其整体《1入本文作为参考。目前本发明的某些方面和实施方案会以实施例的方式参考下文所述图表被阐述。3.2基因叠加本发明的方法和组合物允许连续转化。D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢酶是兼容的，并不干扰其他选择标记和选择体系。因此可能用本发明的构建体转化包含另一选择标记的存在的转基因植物，或用另一标记连续地转化通过本发明方法获得(并包含用于D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢酶的表达构建体)的植物。因此，本发明的另一实施方案涉及将至少两个DNA构建体连续转化进玉米植物的方法，所述方法包括步骤a)用第一构建体转化，所述构建体包含至少一个表达构建体，所述表达构建体包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶，和b)用第二构建体转化，所述构建体包含第二选择标记基因，所述第二选择标记基因不能赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。优选所述第二标记基因是阴性选择性标记，其赋予对杀生物化合物的抗性，所述杀生物化合物如(非-D-氨基酸)代谢抑制剂(例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐，WO98/45456)、抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如膦丝菌素或N-膦酰甲基甘氨酸)。实例为-膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT;也称作Bialophos@抗性；bar;deBlock1987;Vasil1992,1993;Weeks1993;Becker1994;Nehra1994;Wan&Lemaux1994;EP0333033;US4,975,374)-5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(5曙enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase)(EPSPS),其赋予对Glyphosate(N-(膦酰曱基)甘氨酸)的抗性(Shah1986;Della-Cioppa1987)-Glyphosate降解酶(Glyphosate⑧氧化还原酶；gox)，-Dalapon⑧失活脱卣素酶(deh)-磺胺脲和/或咪唑啉酮失活乙酰乳酸合酶(ahas或ALS;例如具有例如S4、XI12、XA17和/或Hra突变的被突变的ahas/ALS变体-BromoxyniP降解腈水解酶(bxn)-卡那霉素或遗传霉素(G418)抗性基因(NPTII;NPTI)，其编码例如新霉素磷酸转移酶(Fraley1983;Nehra1994)-潮霉素砩酸转移酶(HPT),其介导对潮霉素的抗性(VandenElzen1985)。-二氩叶酸还原酶(Eichholtz1987)可使用多种时间流程用于多种阴性选择性标记基因。在抗性基因(例如针对除草剂)的情况下，优选贯穿整个愈伤组织诱导阶段进行约4周选择，并在至少4周后进入再生。这样的选择流程可以用于所有的选择体制。还可能(尽管不明确地优选)将选择维持在包括生根的整个再生流程中。例如，使用膦丝菌素抗性基因(bar)作为选择性标记，培养基中可包含从约1mg/1到50mg/1浓度的膦丝菌素。例如，使用突变的ahas基因作为选择性标记时，培养基中可包含约100nM到约1500nM浓度的PURSUIT。用于选择的典型浓度为约500nM到约1000nM。在本发明优选的实施方案中，阴性选择性标记是赋予磺胺脲和/或咪唑啉酮类杀虫剂抗性的ahas基因。所述ahas基因可以是XI12突变体ahas2基因。具有突变的ahas2基因的XI12突变体玉米抹系被证明高度抗咪草烟(PURSUITT,，但是对灭草全(SCEPTElT)敏感和对磺胺脲除草剂易感。分离自突变玉米抹系的基因XI12ahas2与对咪唑啉酮除草剂选择偶联已-故成功用于玉米、稻和小麦转化的领域(US6，653，529)。可〗吏用例如PURSUn^来实现对包含XI12突变体ahas选择性标记的构建体的选择。另一合适的ahas基因是XA17ahas突变基因。玉米XA17突变体证明高度抗咪草烟和灭草会(SCEPTElT)，并对硫胺尿素除草剂轻微耐受。因为玉米XA17基因赋予对不同咪唑啉酮化合物和硫胺尿素除草剂不同的耐受性，所以在选择使用咪草烟、灭草喹或硫胺尿素作为选择性试剂时，其可以被用作植物转化中的选择性标记。突变的XA17ahas基因及其启动子可以分离自XA17突变体林系。分离序列并表征基因(Bernnasconi1995)。XA17突变体及其表型已被描述(US4，761，373;US5,304,732;Anderson&Gregeson1989;Currie1995;Newhouse1991)。可以用用于选择的SCEPTERTM除草剂或硫胺尿素化合物进行选择。因此，多种ahas突变体的组合允许有效的基因叠加，提供用于双重转化的机制。优选所述第二标记赋予针对至少一种选自phosphinotricin、N-膦酰甲基甘氨酸、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的化合物的抗性。更优选所述第二标记基因是ahas抗性基因，最优选其赋予针对选自XI12ahas突变基因和XA17ahas突变基因的化合物的抗性。本发明的另一实施方案涉及玉米植物，所述玉米植物包含a)第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶，b)用于选择标记基因的第二表达构建体，其不赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。优选所述第二标记基因如上文定义，最优选其赋予针对至少一种化合物的抗性，所述化合物选自phosphinotricin、N-膦酰甲基甘氨酸、phosphinotricin、N-膦酰甲基甘氨酸、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂。特别优选以下组合1)用ahas选择标记基因第一转化，随后用dsdA选择标记基因第二转化；2)用ahas选择标记基因第一转化，随后用daol选择标记基因第二转化；3)用dsdA选择标记基因第一转化，随后用ahas选择标记基因第二转化；4)用daol选择标记基因第一转化，随后用ahas选择标记基因第二转化。除了与用于选择标记基因的第二表达构建体(其不赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性)叠加外，dsdA和daol基因也可被叠加。例如，可以使用dsdA基因和D-丝氨酸作为选择剂进行第一选择，随后使用daol基因和D-丙氨酸作为选择剂进行第二选择。因此，本发明的另一实施方案涉及用于将至少两个DNA构建体连续转化进玉米植物的方法，所述方法包括步骤a)用第一构建体转化并用D-丝氨酸选择，所述构建体包含表达构建体，所述表达构建体包含植物启动子(优选上文定义的泛素启动子)和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码dsdA酶，和b)用第二构建体转化并用D-丙氨酸选择，所述构建体包含表达构建体，所述表达构建体包含植物启动子(优选上文定义的泛素启动子)和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码dao酶。序列1.SEQIDNO:1酸序列2.SEQIDNO:2序列3.SEQIDNO:3列4.SEQIDNO:45.SEQIDNO:56.SEQIDNO:6内含子)的核酸序列7.SEQIDNO:7编石马甘蔗杆状病毒(Sugarcanebacilliformvirus)275bp核心启动子的核^^列8.SEQIDNO:8编码甘蔗杆状病毒启动子的核酸序列编码构建体RLM175T-DNA区的核酸序列编码构建体RLM151T-DNA区的核酸序列编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA的氨基酸编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA基因的核编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶dsdA的氨基酸编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶基因的核酸序编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列编码玉米泛素核心启动子区的核酸序列编码玉米泛素启动子(还包含5，非翻译区和第一9.SEQIDNO:910.SEQIDNO:1011.SEQIDNO:11序列12.SEQIDNO:1213.SEQIDNO:1314.SEQIDNO:1415.SEQIDNO:1516.SEQIDNO:16编码构建体RLM255T-DNA区的核酸序列编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列编码构建体RLM220T-DNA区的核酸序列编码构建体RLM242T-DNA区的核酸序列编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列17.SEQIDNO:17编码构建体RLM241T-DNA区的核酸序列18.SEQIDNO:18编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列19.SEQIDNO:19编码构建体RLM240T-DNA区的核酸序列20.SEQIDNO:20编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA的氨基酸序列21.SEQIDNO:21编码构建体RLM239T-DNA区的核酸序列22.SEQIDNO:22编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA的氨基酸序列按照布达佩斯条约的保藏本发明参考布达佩斯条约对下述材料进行保藏，所述保藏涉及2005年6月23日提交的US临时专利申请No.60/693,321(其引入本文作为参考)进行1.玉米林系BPS553的种子；专利保藏号PTA-6170。2.玉米林系BPS631的种子；专利保藏号PTA-6171。该保藏于2004年8月26日在美国典型培养物保藏中心((ATCC)，Manassas,VA20110-2209美国)进行。实施例一般方法除非另有说明，实施例中的化学品和试剂得自SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)。用于细胞培养基的材料得自Gibco/BRL(Gaithersburg,MD)或DIFCO(Detroit,MI)。如Sambrook(1989)所述进行为本发明目的所进行的克隆步骤，例如转化大肠杆菌细胞、培养细菌、繁殖噬菌体和序列分析重组的DNA。提供下列实施例用于说明而非限制。培养基配方A-l.玉米YP培养基(用于生长农杆菌)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>用1MNaOH将pH调节至6.8。对固体培养基而言，每250mL瓶中添加3g琼脂(EMScience),每250mL瓶中等分100mL培养基，灭菌，使其冷却并在瓶中凝固。对于平板制备而言，在微波炉中熔化瓶中的培养基，将瓶置于水浴中并冷却至55°C。冷却后添加壮观霉素(SigmaS-4014)至50mg/L的终浓度，充分混合并倒板。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>用1MHC1将pH调节至5.2,过滤灭菌，分散在100mL等分式样中，用于农杆菌感染之前向培养基中添加乙酰丁香酮(100^M)(50nL到100mL培养基-200mM储存液)。A-3.玉米1.5LSAs培养基(用于共培养)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>用1MNaOH将培养基pH调节至5.8,每瓶称量4gSigma纯化琼脂(8g/L)并向每瓶中分装500mL培养基，高压灭菌。冷却后添加:<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>*对BPS553x(H氾AxA188)基因型是可选的。将得到的培养基倒入100x20mm培养平板中(含乙烯丁香酮的培养基应当新鲜使用，不能长期储存)。A-4.玉米恢复培养基-l:IM培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>称量所需总体积ddH20的约3/4，加入蔗糖和盐，搅拌溶解。所有成分溶解后，用ddH20调节至最终体积，并使用1MKOH调节至pH5.8。向1L瓶中等分500ml，向每瓶液体中添加0.9g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)。高压灭菌20分钟(液体循环)。高压灭菌后将瓶置于水浴中冷却至55。C,并添加以下成分<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>在分层超净台(laminarhood)中将得到培养基倒入100x20mm培养平板中，允许培养基在超净台中保持过夜以预防过分凝结。A國6.选择性培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>A-7.玉米再生培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>用11\13011将培养基？11调节至5.8。每瓶称量48纯化琼脂(Sigraa,8g/L)。每瓶分装500mL培养基，高压灭菌并使其在瓶中凝固。使用时用微波炉熔化培养基，冷却后添加<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>倒入100x20mm培养平板A-8.玉米生根培养基(生根)<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>用1MNaOH将培养基pH调节至5.8，每瓶添加1g脱乙酰吉兰糖胶(2g/L),每瓶分装500mL，高压灭菌，倒入一次性Phyatrays中。_<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>A-9.D-丝氨酸储存溶液(lM):1MD-丝氨酸(储存于室温)A-10.D-丙氨酸储存溶液(lM):1MD-丙氨酸(储存于室温)A-ll.乙酰丁香酮储液(DMSO中200mM),储存于-20。C。2.方案概迷该方案适用于杂种系和近交系。表2:转化方案概述<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>实施例1:基本转化方案1.1制备杂种供体植物本发明的方法对玉米的近交和杂种系和多种基因型的变种等效作用。使用以下的玉米近交系用于以下步骤1.HiIIA:HiII亲本A;保藏号No.:T0940A，(玉米遗传学和基因组学数据库(MaizeGeneticsandGenomicsDatabase))，可得自玉米遗传学协会储藏中心(MaizeGeneticsCooperation-StockCenterUSDA/ARS&CropSci/UIUC，S-123TurnerHall，1102S.GoodwinAvenue,UrbanaIL美国61801-4798;httD:〃www.maizegdb.org/stock.Dhp)。2.A188:Agronomy&PlantGenetics,411BorlaugHall，UnivofMinnesota,SaintPaulMN55108.3.BPS533(ATCC专利保藏号PTA-6170)4.BPS631(ATCC专利保藏号PTA-6171)通过将HiIIA(雌性亲本)与近交系A188(雄性)杂交产生玉米基因型HilIAxA188的Fl种子，并种植于温室作为花粉供体。通过温室中或大田中Fl(HilIAxA188)植物的自花传粉产生(HilIAxA188)的F2种子，并种植于温室中作为花粉供体。使用近交系BPS553(ATCC专利保藏号PTA-6170)或BPS631(ATCC专利保藏号PTA-6171)作为雌性亲本，Fl或F2(HilIAxA188)植物作为雄性亲本在温室中产生BPS553x(HilIAxA188)或BPS631x(HilIAxA188)的杂种不成熟胚。将两粒种子播种于含Metromix的盆中。一旦种子开始发芽并生根，维持每盆一棵幼苗用于产生不成熟胚，将第二棵幼苗清除；或者种子起初种植在4x4英寸的盆中，播种种子后两周将幼苗移植到10英寸的盆中。向每盆表面添加约一汤匙的Osmocote14-14-14(—种緩释肥料)。温室温度维持在夜晚24'C白天28。C。自动浇水，但是需才艮据需要每天手动补充。用Peters20-20-20肥料的1:15稀释液每周浇植物两次。进行常规昆虫和疾病治理。l丄l近交供体植物的制备将近交系BPS553或BPS631的种子直接播种于4英寸盆中，播种种子两周后将幼苗移植至10英寸盆中。或者将种子直接播种于10英寸盆中。进行自花传粉或近桑M粉。生长条件与上文用于杂交系的相同。1.1.2手工传粉监测每抹玉米植物的穗枝条，发现时用小的白色穗枝条袋(Lawson)将其覆盖。一旦穗枝条开始产生穗丝，切除穗丝并再次用穗枝条袋覆盖。用棕色纸袋将相同植物的雄花穗装袋(条件是雄花穗已经进入开花期)。第二天一早，摇动雄花穗，将花粉和花药移入袋中。然后拿走袋，将花粉在穗枝条的穗丝上摇动。在早晨8点到10点之间进行传粉。保证棕色纸袋在穗枝条上和玉米柄附近。传粉后从植物上去除雄花穗以减少温室中的花粉(许多人的变应原)。为了确保相同基因型同步传粉，从而避免周末收集/转化，将这些早花植物的穗枝条再次修剪。然后在同一天对一组植物(例如>5到10个植物)传粉。例如，如果计划的转化日期是2002年8月19日，则理想的传粉日期是2002年8月9-10日左右。2002年8月9日之前(例如8月7、8日)的穗枝条应净皮修剪。然而，该实践取决于植物上花粉的质量/数量。对于近交系而言需要近缘传粉。例如，BPS553或BPS631可以自花传粉或在相同基因型间近缘传粉。1.1.3收集和预处理穗在传粉后(DAP)8到14天(平均10天)收集来自玉米植物的穗(最好是首先出现的穗)。收集时间才艮据生长条件和玉米变种而不同。不成熟胚的尺寸是它们发育阶段的良好标志。用于转化的不成熟胚的最佳长度为约1到1.5mm，包括盾片的长度。胚应当是半透明的，而不是不透明的。在HiII基因型中优选不使用尺寸大于2.0mm的不成熟胚。如果穗已经准备好，但是当天不能用于转化，则可以收集穗，置于传粉袋中并在4。C水箱中塑料袋中储存1到3天。1.2制备农杆菌农杆菌甘油储存液储存于-80。C。将农杆菌接种物从甘油储存液中划线在YP琼脂培养基(A-1)上，所述培养基含有适当的抗生素(例如50mg/L壮观霉素和/或10mg/1四环素)。将细菌培养物在暗中28。C下孵育1到3天，或直到可以看见单个菌落(直接从-80。C冰箱培养农杆菌培养物通常耗时2天)。获得的平板在4。C储存1个月并作为主板用于划出新鲜细胞。新鲜的细胞应当在转化前至少2天从主板上单个菌落中划在含有适当抗生素的YP琼脂上。这些细菌培养物可以在暗中28。C下孵育1到3天。可选地可以制备冷冻的农杆菌储存液从冷冻储存液将农杆菌细胞划在平板B-YP-002(YP+50mg/1壮观霉素+10mg/1四环素)或含有50到100mg/l卡那霉素的平板YP/或LB培养基上，这取决于质粒上的细菌选择标记。在28。C下培养2到3天。将其作为主板保存并在4。C储存最多一个月。从主板上将一接种环的农杆菌细胞划在烧瓶中，所述烧瓶含有25ml分别添加有50mg/L壮观霉素加10mg/L四环素或50-100mg/L卡那霉素的液体B-YP-000培养基。在设置为300rpm和28。C的摇床上培养2到3天。通过将一份上述农杆菌培养物与一份无菌30%甘油混合制备冷冻农杆菌储存液。振荡以混合均匀并将10农杆菌/甘油混合物分装在50nLEppendorf管中。储存于一80'C。将充满细菌培养物的一个或两个环(直径2mm)悬浮在1.0到1.8mlLS-inf培养基中，所述培养基补充有100mM乙酰丁香酮。这产生具有0.5到2.0之间近似光密度(OD6。())的细菌悬液。振荡0.5到3小时。振荡如下进行将微量离心管水平地(而不是垂直地)固定(例如用胶带)在振荡器的平台上，确保将农杆菌细胞更好地分散进溶液中。将100pl农杆菌细胞悬液与900jiL的LS-inf溶液在管中混合，并测量OD6。。。将原始农杆菌溶液的OD用LS-Inf(含100mM乙酰丁香酮)溶液调节为0.6到2.0。感染前优选将农杆菌悬液在LS-inf十乙酰丁香酮培养基中振荡至少0.5到3小时。开始收集胚之前制备该悬液。可选地可如下制备用于玉米转化的农杆菌悬液转化前两天，从-80。C的储存液中，将来自一管的农杆菌划在含B-YP-002(凝固的YP，分别加50mg/1壮》见霉素加10mg/1四环素或50-100mg/1卡那霉素，取决于使用的细菌选择标记)的平板上并在28。C暗中培养两天。转化前约1到4小时，将一勺细菌细胞置于2mlEppendorf管中1.5mlM-LS-002培养基(LSinf+200jiM乙酰丁香酮)中。振荡管将细菌细胞分散至溶液中，并在l，000rpm将管摇动1到4小时。OD6oo应当在0.6到1.0的范围内或约108cfu/mL。为了以下实施例的目的，使用用二元载体质粒pBPSMM232转化的根瘤农杆菌菌抹LBA4404或卸甲农杆菌菌林K599(NCPPB2659)。pBPS—MM232含有ahas基因(作为选择性标记)和gus报道基因。1.3分离不成熟胚1.3.1表面灭菌传粉后8到12天从温室收集穗。去除所有的外壳和穗丝，并将穗在棕色棕色传粉袋中运输回组织培养实验室。将穗轴移进无菌超净台中。将一对大镊子插入穗的基底部，使用该镊子作为操作穗轴的手柄。任选地，当穗上存在昆虫/真菌时，应当首先用20%的商业漂白剂将穗灭菌10分钟(或者30。/oClorox溶液15分钟)，然后用无菌水沖洗三次。用镊子握住穗轴，用70%乙醇彻底地喷洒穗，然后用无菌ddH20冲洗。1.3.2制备并用农杆菌接种不成熟胚1.3.2.1方法l:改良的"管"方法将带有镊子手柄的穗轴置于大的培养平板中。可使用解剖镜。切掉仁的顶部(2/3)并用#10解剖刀去除(为了安全起见，远离握住镊子手柄的手切除来完成仁的切割)。然后用解剖刀(#11或#15解剖刀)从穗轴上的仁上切下不成熟胚将解剖刀刀锋以一定角度插入仁的一端。将胚乳提起；胚位于胚乳下。被切下的胚收集在含有约1.5到1.8ml农杆菌悬液的微量离心管(或小培养平板)中，所述农杆菌悬浮于含乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基(见上文；A-2)中。每管可以含至多100个胚。将含胚的管手摇混合若干次，使管/平板在室温(20到25。C)保持30分钟。用移液管从管/平板中去除多余的细菌悬液。将残余的LS-inf培养基中的不成熟胚和细菌转移至含共培养琼脂培养基的培养平板中。用无菌环转移微量离心管中残余的任何不成熟胚。用移液管去除多余的细菌悬液。将不成熟胚置于共培养基上，平侧向下(盾片朝上)。不要将胚埋入培养基中。将平板盖打开置于无菌超净台中约15分钟，蒸发覆盖不成熟胚的多余水分(晾干)。用3M微孔胶带封住培养亚。约100个胚可被置于培养平板中用于共培养。封住平板并用一片铝箔包裹。将平板在暗中22。C孵育2到3天。如果使用GUS构建体评估瞬时GUS表达，取3到5个胚进行GUS染色。1.3.2.2方法2:"滴"方法切下的不成熟胚直接置于共培养培养基(见培养基A-3)上，平侧向下(盾片朝上)。每个平板(20xl00mm平板)可以装载至多100个不成熟胚。用重复移液器对每个不成熟胚应用5jil稀释的农杆菌细胞悬液。通过在超净台中将平板盖打开约15分钟去除覆盖不成熟胚的多余水分。用3M微孔胶带封住平板并用铝箔包裹。将平板在暗中22。C孵育2到3天。如果使用GUS构建体评估瞬时GUS表达，取出3-5个不成熟胚用于GUS染色。1.4恢复共培养后，将胚转移至恢复培养基(A-4或A-5)上并将平板在暗中27°C下孵育约5到7天。保持盾片侧向上，并且不要埋入培养基中。1.5选择将不成熟胚转移至第一轮选择性培养基(A-6)上。每个平板上大约可放置25到50个不成熟胚。小心地维持胚的相同方向(盾片向上)。不要将胚埋入培养基中。用3M微孔胶带封住培养平板。在暗中27。C下孵育10到14天(第一轮选择)。将产生可变愈伤组织的所有不成熟胚在第二轮选择性培养基(A-6)中次培养。尽量避免转移粘的或软的愈伤组织。在该阶段，使用剪刀去除形成的任何枝条(如果可能，尝试从盾片上取下整个胚并丟掉)。将愈伤组织稳固地置于培养基上，不要埋入培养基中。用3M微孔胶带封住平板，置于暗中27'C下。在与第一轮选择相同的条件下孵育2周(第二轮选择)。使用2对精细镊子，在立体显微镜下从盾片上切除可再生的愈伤组织。可再生的愈伤组织颜色是带白色/浅黄色、致密的、不粘滑并可具有一些胚状结构。将愈伤组织转移至新鲜的第二轮选择性培养基(A-6)上，用3M微孔胶带封住并在暗中27。C下孵育2周。将愈伤组织稳固地置于培养基上，不要埋入培养基。小心地分组并标记来自同一胚的愈伤组织碎片。1.6被转化植物的再生以用于第二轮选择相同的方式切下增生的愈伤组织(因胚结构形成而带白色)并转移至25x100mm平板中的再生培养基(A-7)上。将愈伤组织稳固地置于培养基上，不要埋入培养基中。用3M微孔胶带封住平板置于光下，25。C到27'C。仔细地将来自相同胚的愈伤组织碎片分组，根据胚对其在25。C或27。C下于光(约2,000lux;14/10小时光/暗)下孵育2到3周，或直到能够看见枝条样的结构。根据需要，转移至新鲜的再生培养基。将的Phytatray或Magenta盒，并在上一步骤相同的条件下孵育2周，或直到发育出生根的小植林。在生根培养基上2周或4周后，将仍然带有绿色区域的愈伤组织(但是其没有再生出幼苗)转移至新鲜的生根Phytotrays。对幼苗样品进行TaqMan分析以确定T-DNA插入数。1.7温室中的转基因植物将生根的幼苗转移至温室中的Metromix土壤，用塑料盖将各幼苗覆盖至少1周，直到幼苗定居。以每天浇水，每周补充液体肥料两次来维持植物(生长)。当植物到达3到4片叶子的阶段时，用Osmocote对其施肥。将存活的植物移植至含有MetroMix和1茶匙OsmocoteTM的10英寸盆中。开花阶段时，将转基因植物的雄花穗用棕色纸袋包装，防止花粉脱落。对转基因植物进行传粉。最好对转基因植物进行自花传粉。如果抽丝和开花不是同步的，则应当可用与转基因T。植物具有相同遗传背景的野生型花粉供体或受体植物，用于进行异花传粉。收集T^种子、千燥并用足够的标签适当地保存在种子袋中。收集转基因Ti种子后，包括土壤和盆的To植物应当包装在高压灭菌袋中高压灭菌(双重装袋)。实施例2:用于评价dsdA和daol基因的转化载体制造含有dsdA或daol基因的若干转化载体。包含ahas选择标记的构建体被用于转化实验中的比较目的(表3)。表3.在构建用dsdA和daol基因作为选择标记的转化中用于实验的p-ScBV=ScBV启动子；p-Ubi=玉米ubi启动子；t-OCS3，=OCS3，终止子;t-NOS=nos终止子；PsFedl=翻译前导序列)栽体LB観选择标记报告子/选择标记-RB<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>实施例3:用D-丝氨酸和D-丙氨酸建立杀伤曲线为了建立D-丝氨酸和D-丙氨酸对抑制組织培养的玉米细胞生长的有效浓度，应用使用不成熟胚的生物测定体系。将长2mm的不成熟胚切片到含有选择剂的萌发培养基上，并在27。C光下孵育.胚胎切片后7天测量萌发的幼苗的枝条和初生根的长度(图1A和1B)。在不成熟胚萌发抑制实验中，当D-丙氨酸的浓度高于2mM,特别是达到10mM时，发生了显著的生长抑制(图1A)。相似的结果指出高于9mM的D-丝氨酸浓度引起显著的生长抑制(图1B)。用D-丝氨酸和D-丙氨酸二者在培养物愈伤组织中的生长抑制测试证实这些D-氨基酸的有效抑制浓度(数据未显示)。实施例4:选择性培养基中D-丝氨酸浓度对转化的影响使用转化载体LM179测定选择性培养基中D-丝氨酸浓度对转化效率的影响(见表3)。用5到15mM浓度范围的D-丝氨酸获得了高于20%的转化效率(表3.1)。选择性培养基中不添加D-丝氨酸(0mMD-丝氨酸)时，将培养物中的每片愈伤组织转移至用15mMD-丝氨酸选择的再生培养基上，从而在该步骤杀死非转基因的愈伤组织。选择性培养基中有20mMD-丝氨酸时，转化效率显示被降低(重复一次)至2%(表3.1)。因此，在我们的转化方案中使用5到15范围内的D-丝氨酸浓度。表4.选择性培养基中D-丝氨酸(D-Ser)浓度对玉米基因型J553x(HilIAxA188)中转化效率的影响。实验中使用载体LM179。数据来自四个不同的实验。将推定的转基因愈伤组织从OmMD-Ser对照上转移至含10mMD-Ser的再生培养基上，通过Taqman测定证实存活的植物。D-Ser(mM)#重复#IesTE(%)土标准误差014122.05312520.8土17.810419633.5土9.11528426.5201452.2实施例5.用ahas和dsdA作为选择标记的转化比较用两种选择方案dsdA710mMD-丝氨酸和ahas/750nMPursuit与两种LM179和MM232载体获得了相似的转化效率(表4)。载体LM179含有ahas和dsdA选择标记二者，而MM232仅含有ahas标记(表3)。转化结果指示dsdA选择标记提供与ahas选择标记相同的转化效率。表5.比较两种选择体系的转化效率在J553x(HilIAxA188)基因型中dsdA/D-丝氨酸和ahas/Pursuit与载体LM179(表3)，使用MM232作为对照转化载体。载体选择#重复#IEsTE(%)土标准误差MM232750nMPursuit836441.7土18.1LM17910mMD國Ser946640.7土14.6LM179750nMPursuit633144.5土11.1实施例6:用daol基因建立转化和翻译前导序列(PsFedl)对转化的影响使用LM198和LM199(见表3)载体得到相似的转化效率，提示在基因型J553x(HilIAxA188)中未观察到编码序列之前的翻译前导序列的显著影响(表6)。选择、再生和生根培养基中存在用10mMD-Ala的严格选择，因为用含有MM232的农杆菌菌株感染不成熟胚并在10mMD-Ala上选择时没有漏掉(表6)。另外，密码子优化的daol基因和翻译前导序列(PsFedl,载体LM226)的组合在玉米模式林系中不产生更高的转化效率(表7)。另一方面，使用下述载体时对转化效率没有显著影响所述载体包含未优化daol和翻译前导序列的(载体LM224),或密码子优化daol但没有翻译前导序列(载体LM225)。因此，结果提示dsdA和daol基因的密码子优化在才莫式基因型中不提供转化的进一步增强。表6.J553x(HilIAxA188)中翻译前导序列(PsFed)对转化效率的影响，所述转化使用daol基因作为选择标记。载体LM199含有密码子优化的daol基因和翻译前导序列。载体LM198含有密码子优化的daol基因，不含前导序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表7.密码子优化和翻译前导序列对J553x(HilIAxA188)中用daol基因的的转化效率的影响。使用载体LM226(其含有密码子优化的daol基因和翻译前导序列)的转化实验具有比其他两个载体相对更低的效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>实施例7.两种不同的D-氛基酸(D-Ser和D-Ala)对用daol基因作为选择标记的转化的影响。DAOl蛋白质具有更广泛范围的D-氨基酸(例如D-Ser和D-Ala二者)作为底物，相反，DSDA蛋白质仅使用D-丝氨酸作为底物。因此，进行比较实验来测定D-Ser和D-Ala对转化的影响。用具有相似转化效率的D-Ser和D-Ala作为选择剂生成转基因植物(表8)。结果提示两种D-氨基酸在模式基因型中作为daol基因构建体的选择剂等价作用。表8.比较使用两种不同的D-氨基酸(D-丝氨酸和D-丙氨酸)作为选择剂对J553x(HilIAxA188)中转化效率的影响。该实验中使用两种转化载体LM198和LM199。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>实施例8:三种可选择标记的比较ahas、dsdA和daol进行转化实验来比较三种可选择标记/选择剂体系(即ahas/Pursuit;dsdA/D-丝氨酸和daol/D-Ala)的转化效率。使用载体MM232/Pursuit、LM166/D-Ser和LM205/D-Ala分别获得31%、42%和31%的平均转化效率。D-Ser和D-Ala均产生非常严格的选择，因为用含MM232载体的农杆菌菌林感染不成熟胚并在10mMD-Ser或D-Ala上选择时不存在漏掉(表9)。表9.比较使用三种选择方案的转化效率(1)al1as/750nMPursuit;(2)dsdA/10mMD-丙氨酸和(3)dao1/10mMD誦丝氨酸。_<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>实施例9:用dsdA和daol基因二者再转化(基因叠加)由于dsdA蛋白质(主要是D-丝氨酸)的底物特异性和daol蛋白质使用底物广泛范围，含有dsdA基因的初级转基因植物对D-丙氨酸是敏感的，并能够用daol基因再转化，使用D-丙氨酸作为选择剂。如下进行再转化实验用含有daol和gus的构建体LM205(见表3)再转化含有LM179(见表3)T-DNA的dsdA初级Tl转基因不成熟胚(表10)。因为初级转基因植物含有dsdA和ahas两种基因，所以未感染的不成熟胚能够在D-丝氨酸(处理1)和Pursuit(处理2)选择中存活，但是不能在D-丙氨酸选择(处理3)中存活。用含有LM205质粒的农杆菌菌抹感染后，产生含有dsdA和daol两种基因并经分子学证实的阳性转基因事件(表IO,处理4)。表10.用于叠加dsdA和daol基因的再转化实验。含有LM179T-DNA(p画Ubi::ahas::ahas)的初级转基因植物。<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>实施例10:用含dsdA或daol的构建体再转化含有ahas的初级转基因植物为了测试ahas与dsdA或daol基因叠加的能力，用含dsdA基因的构建体再转化含ahas基因的初级转基因植物。产生了含有dsdA和ahas二者的经证实的转基因事件，指示dsdA和ahas选择标记可以用两种选择剂Pursuit和D-丝氨酸叠加。此时，使用ahas(初级事件)和daol(次级转化)，和dsdA(初级事件)/或daol(初级事件)与ahas(次级转化)的基因叠加实验正在进行中。表ll.ahas和dsdA之间的选择标记叠加实验。使用750nMpursuit和15mMD-丝氨酸(用于dsdA构建体)进行选择。<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>表12.用含有ahas和daol选择标记的构建体评价基因叠加。用于基因叠加实验的初级转基因材料是纯合的T2不成熟胚，其含有突变的ahas标记，并用daol构建体LM255(使用D-丝氨酸和/或D-丙氨酸之一作为选择剂)再转化。<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>实施例ll:温室中的D-丝氨酸和D-丙氨酸喷雾测试通过在温室中用D-丝氨酸或D-丙氨酸对野生型玉米幼苗(基因型J553x(HilIAxA188))喷雾进行实验。测试四种喷雾剂量的D-丝氨酸或D-丙氨酸0、100、l，OOO和IO，OOOg/Ac。即使使用最高的浓度(估计的10,000g/ac)也未观察到对植物的损伤症状(数据未显示)。实施例12:评价不同启动子在杂种(BPS553x(HilIAxA188))和近交(BPS553)系转化中对使用dsdA或daol基因作为选择标记的影响。转化数据提示玉米泛素启动子(构建体LM151)驱动的dsdA基因在玉米组织培养物中更有效地工作，并在杂种系中提供更高的转化效率。用ScBV(LM242)或玉米泛素(LM255)启动子在杂种和近交系中驱动daol基因时均未观察到转化效率差异。与玉米ahas启动子结合的dsdA基因和daol基因(LM239和LM241)均不产生转基因事件。表l3.对评价构建体进行的转化实验概述，所述构建体具有驱动dsdA和daol基因的不同启动子。实验数据根据基因型和构建体分库。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>*基因型A=BPS553x(ffilIAxA188);B=BPS553.**#IEs=感染的不成熟胚数量；1￡(%)=转换效率(％);STDEV=平均标准误差。实施例I3:DSDA和DAOl蛋白质的提高的酶促效率通过基因改组修饰DSDA和DAOl蛋白质以提高酶促效率。合成的DSDA和/或DAOl蛋白质通过随机组合来自DSDA和/或DAOlDNA序列的结构域和来自其他蛋白质基因的潜在功能性DNA片段产生。产生的嵌合DNA序列在微生物系统例如大肠杆菌中表达，并测定蛋白质的酶促动力学。参考文献下文所列的参考文献和本文引用的所有参考文献在本文以以下程度引用作为参考即它们补充、解释提供了本文引用的方法、技术和/或组合物的背景，或教导了本文引用的方法、技术和/或组合物。1.An等(1985)EMBOJ4:277-2872.Anderson&Gregeson(1989)Genome31:994-9993.Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985)4.Ashby等(1988)J.Bacteriol.170:4181-41875.Atanassova等(1992)PlantJ2(3):291-3006.AusubelFM等(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience7.Baker等(1987)EMBOJ6:1547-15548.Ball.J.B.和Alewood，P.R(19卯)J.Mol.Recognition3:559.BarnettT.等(1980)Dev.Genet1:331-34010.Becker等(1994)PlantJ"5:299-307，11.BerimasconiP等(1995)J.Biochem.Chem.29:17381-1738512.Bevan等(1984)NuclAcidRes12,8711-872013.Binding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,21-73页，CRCP固，BocaRaton(1985)14.Binet等(1991)PlantScience79:87-9415.Bolton等(1986)Science232:983-985;16.BreathnachR.和P.Chambon(1981)Ann.Rev.Biochem.50:349-38317.BroothaertsW等(2005)Nature433:629-63318.Callis等(1990)JBiolChem265(21):12486-1249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-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(EC4.3.1.18)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)和D-丙氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.21)。7.权利要求1到6中任一项的方法，其中能够代谢D-丝氨酸的酶选自i)SEQIDNO:2编码的大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶，和ii)与SEQIDNO:2编码的序列具有相同酶活性和至少80%同一性的ii)由能够与SEQIDNO:1所述序列的互补序列杂交的核酸序列编码的酶，其中在含有从约1mM到100mM浓度D-丝氨酸的培养基上进行选择。8.权利要求1到7中任一项的方法，其中能够代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自i)SEQIDNO:4编码的痩弱红酵母D-氨基酸氧化酶，和ii)与SEQIDNO:4编码的序列具有相同的酶活性和至少80%同一性的酶，和iii)由能够与SEQIDNO:3所述序列的互补序列杂交的核酸序列编码的酶，其中在含有总浓度从约1mM到100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行选择。9.权利要求1到8中任一项的方法，其中所述泛素启动子是玉米泛素启动子。10.权利要求l到9中任一项的方法，其中所述泛素启动子选自a)包含SEQIDNO:5所述序列的序列，和b)序列，其至少包含SEQIDNO:5所述序列的至少50个连续碱基对的一个片段，并在玉米中具有启动子活性，c)序列，其包含与SEQIDNO:5所述序列具有至少60%同一性的序列，并在玉米中具有启动子活性，d)序列，其包含与SEQIDNO:5所述序列杂交的序列，并在玉米中具有启动子活性。11.权利要求1到10中任一项的方法，其中所述泛素启动子选自a)包含SEQIDNO:6所述序列的序列，和b)序列，其至少包含SEQIDNO:6所述序列的至少50个连续碱基对的一个片段，并在玉米中具有启动子活性，c)序列，其包含与SEQIDNO:6所述序列具有至少60%同一性的序列，并在玉米中具有启动子活性，d)序列，其包含与SEQIDNO:6所述序列杂交的序列，并在玉米中具有启动子活性。12.权利要求1或2的方法，其中权利要求1步骤b)的选择或权利要求2步骤d)的选择使用约3mM到约15mMD-丙氨酸，或约7mM到约30mMD-丝氨酸进行。13.权利要求1、2或12的方法，其中去分化条件下的总选择时间从约3到4周。14.权利要求1或2的方法，其中权利要求1步骤b)的选择或权利要求2步骤d)的选择分两步进行，使用约5到20天的第一选择步骤，然后将存活的细胞或组织转移至第二选择性培养基上再选择5到20天，所述第二选择性培养基与所述第一选择性培养基具有基^目同的组成。15.权利要求1到14中任一项的方法，其中所述DNA构建体的引入由选自以下的方法介导根癌菌科介导的转化和粒子轰击介导的转化。16.权利要求15的方法，其中根瘤菌科细菌是卸甲根瘤农杆菌或卸甲毛才艮农杆菌细菌。17.权利要求1到16中任一项的方法，其中所述玉米植物、不成熟胚、细胞或组织选自下述玉米植物近交、杂种、近交之间的F1、近交和杂种之间的Fl、近交和自然传粉变种之间的Fl、市售Fl变种、前述变种和前述任何后代之间杂交或自花传粉的任何F2。18.权利要求17的方法，其中所述玉米细胞或组织或所述不成熟胚分离自(HilIAxA188)杂种与近交系的杂交，所述近交系选自其代表性种子已以专利保藏号PTA-6170和PTA-6171保藏于美国典型培养物保藏中心的近交系。19.权利要求l的方法，其中所述方法包括步骤i)用第一DNA构建体转化玉米植物，所述第一DNA构建体包含a)至少一个第一表达构建体，所述第一表达构建体包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码D-氨基酸氧化酶，其中所述第一表达盒侧翼是允许特异缺失所述第一表达盒的序列，和b)至少一个第二表达盒，所述表达盒适合赋予所述植物有农业价值的性状，其中所述第二表达盒不位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间，和ii)用毒害植物浓度的第一化合物处理步骤i)的所述经转化的玉米植物细胞，并选择其基因组中包含所述第一DNA构建体的植物细胞，所述第一化合物选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物，所述第一DNA构建体通过表达所述D-氨基酸氧化酶赋予所述经转化的植物细胞针对所述第一化合物的抗性，和iii)诱导从所述经转化植物细胞的基因组中缺失所述第一表达盒，并用对仍然包含所述第一表达盒的植物细胞有毒浓度的第二化合物处理所述植物细胞，从而选择包含所述第二表达盒但是缺乏所述第一表达盒的植物细胞，所述第二化合物选自D-异亮氨酸、D-缬氨酸及其衍生物。20.权利要求19的方法，其中a)泛素启动子如权利要求9到11中任一项所定义，和/或b)D-氨基酸氧化酶如权利要求6或8中所定义。21.重组表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核,列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶，其中所述启动子相对于所述酶编码序列是异源的。22.权利要求21的重组表达构建体，其中a)泛素启动子如权利要求9到11中任一项所定义，和/或b)能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如权利要求6到8中任一项所定义。23.DNA构建体，其包含i)至少一个第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，ii)至少一个第二表达构建体，其赋予所述玉米植物有农业价值的性状。24.权利要求23的DNA构建体，其包含a)第一表达盒，其包含与泛素启动子有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其中所述第一表达盒侧翼是允许特异缺失所述第一表达盒的序列，和b)至少一个第二表达盒，所述表达盒适合赋予所述植物有农业价值的性状，其中所述第二表达盒不位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间。25.权利要求24的DNA构建体，其中允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列选自下述序列a)以下述方式排列的针对序列特异性重组酶的重組位点所述侧翼重组位点之间的重组导致之间的序列从基因组缺失，和b)同源性序列A和A，，其具有足够的长度和同源性从而确保A和A，之间的同源重組，并具有方向，A和A，之间重组时所述方向会导致之间的序列从基因组缺失。26.权利要求24或25的DNA构建体，其中所述构建体包含针对序列特异性核酸酶的至少一个识别位点，所述位点位于允许特异缺失所述第一表达盒的所述序列之间。27.载体，其包含权利要求21或22的表达构建体，或权利要求23到26中任一项的DNA构建体。28.转基因细胞或非人生物，其包含权利要求21或22的表达构建体、权利要求23到26中任一项的DNA构建体，或权利要求27的载体。29.权利要求28的转基因细胞或非人生物，其中所述细胞是植物细胞和/或所述生物是植物。30.权利要求28或29的转基因细胞或非人生物，其中所迷细胞是玉米植物细胞和/或所述生物是玉米植物。31.权利要求30的玉米植物，其中所述植物通过将(HilIAxA188)杂种与近交系杂交获得，所述近交系选自其代表性种子已以专利保藏号PTA-6170和PTA-6171保藏于美国典型培养物保藏中心的近交系。32.权利要求30或31的玉米植物的后代植物。33.从权利要求30到32中任一项的玉米植物产生的杂种植物。34.从权利要求30到32中任一项的玉米植物产生的近交植物。35.权利要求30到34中任一项的玉米植物的部分。36.用于将至少两个DNA构建体连续转化进玉米植物的方法，其包括步骤a)用第一构建体转化，所述构建体至少包含一个表达构建体，所述表达构建体包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码b)用第二构建体转化，所述构建体包含第二选择标记基因，所述第二选择标记基因不能赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。37.权利要求36的方法，其中所述第二标记基因赋予针对至少一种化合物的抗性，所述化合物选自phosphinotricin、N-膦酰曱基甘氨酸、磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂。38.权利要求36或37的方法，其中所述标记基因选自XI12ahas突变基因和XA17ahas突变基因。39.玉米植物，其包含a)第一表达构建体，其包含泛素启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，b)用于选择标记基因的第二表达构建体，其不赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。40.将至少两个DNA构建体连续转化进玉米植物的方法，所述方法包括步骤a)用第一构建体转化并用D-丝氨酸选择，所述构建体包含表达构建体，所述表达构建体包含植物启动子和与其有效连接的核酸序列，所述核酸序列编码dsdA酶，和b)用第二构建体转化并用D-丙氨酸选择，所述构建体包含表达构建体，所迷表ii^I建体包含植物启动子和与其有效连接的核酸序列，所迷核酸序列编码dao酶。全文摘要本发明涉及以D-丙氨酸或D-丝氨酸选择为基础将DNA整合进玉米植物基因组中的改良方法。优选转化由农杆菌介导。文档编号C12N15/82GK101228281SQ200680027145公开日2008年7月23日申请日期2006年7月18日优先权日2005年7月27日发明者F-M·赖,H-S·宋,K·梅,L·曼金,T·琼斯申请人:巴斯福植物科学有限公司