染色体10q26上的年龄-相关黄斑病变(ARM)易感基因的制作方法

专利名称：：染色体10q26上的年龄-相关黄斑病变(ARM)易感基因的制作方法染色体10q26上的年龄-相关黄斑病变(ARM)易感基因发明者迈克尔B尚瑞约翰纳加科伯斯多缇尔耶维特P孔利丹尼尔E威克斯特玛麦S马4可-费瑞瑟罗伯特E费瑞尔
背景技术：
：年龄-相关黄斑病变(已知为一种年龄-相关的黄斑变性)是一种在老年人群中引起中心失明的主要原因，并且大量研究表明一种强潜力基因组成了这种复杂疾病。使用大家系的基因组-范围连锁扫描，患病同胞对，及最近的表型不一致同胞对，已经鉴定了大量潜在的易感4立点。(Klein等，1998Age-relatedmaculardegeneration.Clinicalfeaturesinalargefamilyandlinkagetochromosomelq.ArchivesofOphthalomolgy116:1082-1088.;Weeks等.2000Afullgenomescanforagerelatedmaculopathy.HumanMolecuarGenetics9:1329-1349;Majewski等，2003Age-relatedmaculardegeneration-agenomescaninextendedfamilies.AmJHumGenet73:540-550;Schick等2003Awhole-genomescreenofaquantitativetraitofage-relatedmaculopathyinsibshipsfromtheBeaverDamEyeStudy.AmJHumGenet72:1412-1424;Seddon等2003Agenomewidescanforage國relatdmaculardegenerationprovidesevidenceforlinkagetoseveralchromosomalregions.AmJHumGenet73:780-790;Abecasis等2004-Age-relatedmaculardegeneration:ahigh-resolutiongenomescanforsusceptibilityLociinapopulationenrichedforlate-stagedisease.AmJHumGenet74:482-494;Iyengar等,2004Dissectionofgenomewide-scandatainextendedfamiliesrevealsamajorlocusandoligogenicsusceptibilityforage-relatedmaculardegeneration.AmJHumGenet74:20-39;Kenealy等2004Linkageanalysisforage-relatedmaculardegenerationsupportsageneonchromosome10q26.MolVis10:57-61;Schmidt等2004Orderedsubsetlinkageanalysissupportsasusceptibilitylocusforage-relatedmaculardegenerationonchromosome16pl2.BMCGenet5:18;Weeks等2004Age-relatedmaculopathy:agenomewidescanwithcontinuedevidenceofsusceptibilitylociwithinthelq31,10q26,and17q25regions.AmJHumGemet75:174-189;Scantangelo等2005ADiscordantSib-PairLinkageAnalysisofAge-RelatedMacularDegeneration.OphthalmicGenetics26:61-68)基因组-范围交联扫描强烈显示10q26区域含有年龄-相关黄斑变性(AMD)基因(Weeks等2004);该区i成已经一皮许多其他研究所支持并且是最近meta分斗斤中的顶—级区i或(Fisher等2005Meta-analysisofgenomeseansofage-relatedmaculardegeneration.HumMolGenet.2005Augl;14(15):2257-64)。最近，Science上的三篇文章(Edwards等2005ComplementFactorHPolymorphismandAge-RelatedMacularDegeneration.Science308,421-424;Haines等2005ComplementFactorHVariantIncreasestheRiskofAge-RelatedMacularDegeneration.Science308,419-421.Klein等2005ComplementFactorHPolymorphisminAge-RelatedMacularDegeneration.Science308，385-389)鉴定了对应于染色体1上交联:信号的补体因子H(CFH)上的等位基因变体，其在家族和零星情况中导致ARM重要归因危险性。这些发现已经被i正实(Conley等2005Candidategeneanalysissuggestsaroleforfattyacidbiosynthesisandregulationofthecomplementsystemintheetiologyofage-relatedmaculopathy.HumMolGenet14:1991-2002;Hageman等(2005a)FromTheCover:AcommonhaplotypeinthecomplementregulatorygenefactorH(HF1/CFH)predisposesindividualstoage-relatedmaculardegeneration.ProcnatlAcadSciUSA102:7227-7232;和Zareparsi等2005aStrongAssociationoftheY402HVariantinComplementFactorHatlq32withSusceptibilitytoAge-RelatedMacularDegeneration.AmJHumGenet77:149-53)。CFH在Hageman禾口Anderson先前的研究中已经怀l是在ARM中起作用(Hageman和Mullins1999Molecularcompositionofdrusenasrelatedtosubstructuralphenotype.MolecularVision5:28;Johnson等2000Apotentialroleforimmunecomplexpathogenesisindrusenformation.ExperimentalEyeResearch70:441-449ComplementactivationandinflammatoryprocessesinDmsenformationandagerelatedmaculardegeneration.ExperimentalEyeResearch73:887-896;Mullins等2000Drusenassociatedwithageingandage-relatedmaculardegenerationcontainproteinscommontoextracellulardepositsassociatedwithatherosclerosis,elastosis，amyloidosis,anddensedepositdesease.FASEBJournal14:835-846;Hageman等2001Anintegratedhypothesisthatconsidersdrusenasbiomarkersofimmune-mediatedprocessesattheRPE-Bruch，smembraneinterfaceinagingandage-relatedmaculardegeneration.ProgressinRetinal&EyeResearch20:705-732;Johnson等2001),我们已经发现许多ARM病人中观察到的S见网膜床(玻璃膜疣)含有补体因子。然而直到其他导致ARM的基因被鉴定后，CFII仍然是一个独立的难题，表明选择性途径和炎症是ARM的发病才几制，但并非眼科中观察到的唯一病理学。9
发明内容至此，如上所述，等位基因变异型，包4舌单核甘酸多态性，已经在染色体10q26上鉴定。这里显示这些等位基因变异型与随年龄增长-相关黄斑变性的增高危险性相关。等位基因变异型随LOC387715和/或PLEKHA1基因一起定位在染色体10q26上。一个实施方案中，等位基因变型伴随LOC387715。在本发明的一个非-限制性实施方案中，提供了一种鉴定高危发生年龄-相关黄斑病变的个体的方法。该方法包括在来源于主体的核酸样本中，鉴定与发生年龄-相关黄斑变性危险性相关的染色体10q26上的等位基因变异的存在。在一个非-限制性实施方案中，等位基因变异发生在染色体10q26上的PLEKHA1/LOC387715/PRSS11。例如并且非限制性的，等位基因变异是发生于PLEKHAl和LOC387715其一或两者上的等位基因变异，例如，非限制性的，LOC387715上的丝氨酸69丙氨酸变异。另一个非-限制实施方案中，变异是包4舌一种或一种以上定义为rs4146894，rsl0490924，rsl045216，rsl882907,rs760336,rs763720,rs800292，rsl483883和rsl853886变异的多态性。等位基因变异可以是，非限制性的，产生一种非-功能基因产物的突变和一种基因产物的变异表达，如一种或一种以上移码突变，启动子突变和^H妻突变。一个实施方案中，该方法包4舌在来源于主体核酸才羊本中进一步定义补体因子H等位基因变异的存在，如，非限制性的，对应于单核甘酸多态性rsl852883的变异。》匕方法可以<吏用4壬<可可用的#支术，例力。非限制性的核酸扩增方法，例如PCR,反转录PCR(RT-PCR),等温扩增，基于4亥酉吏序列扩增(NASBA),5，荧光4亥&复方法(例力oTAQMAN方法)，核酸信标方法和滚环扩增。这种等位基因变异可以使用一种阵列进行鉴定，其典型地包括一种或一种以上用于在来源于主体的核酸样本中，筌定包4舌两种或多种单核甘酸多态性，rs4146894，rsl0490924，rsl045216，rsl882907，rs760336，rs763720,rs800292,rsl483883禾口rsl853886的等^f立基因变异的存在的试剂。另一个非-限制性实施方案中，^是供一个包括一种或一种以上试剂序列的阵列，其鉴定来源于主体的核酸样本中与发生年龄-相关黄斑变性危险性相关的染色体10q26上的等位基因变异的存在。非限制性的，等位基因变异可以发生在染色体10q26上的PLEKHAl/LOC387715/PRSS11，并且，例如，可以对应于一种或一种以上定义为rs4146894,rsl045216,rsl0490924,rsl882907，rs760336,rs763720,rs800292，rsl483883和rsl853886的单核甘酸多态性。图1:相对于候选基因的CIDR位置和局部基因型SNPs。染色体10上的位点，距离和核酸位点来源于NCBIEntrez-gene和SNPlt据库。图2:染色体10的单-点和多点连锁结果。左图表示使用所有SNPs时的结果。右图表示仅使用H-clustSNPs分析的结果。标记，，F，，的峰表示可能为由于高SNP-SNPLD导致的假峰，而标记"G"和"P"的峰，分别对应于包括GRK5和PLEKHA1的位点。水平线表示多点Sall(Sall-1最大值)的1-单位支撑间隔。图3A-3D:基于196CIDRSNPs和179非相关对照的染色体10的连锁不平衡模式。图3A:135cM的假峰(见图2),图3B-.142cM的假峰(见图2)，图3C:连锁峰。图3D-1和3D-2是图3C的放大版本，源于线A-A:假峰中带有最大Sw的SNP(图3A和3B)以灰色显示而真实连锁峰中来源于CCREL(表5)的5个基因(GRK5/RGS10/PLEKHA1/LOC387715/PRSS11)上的重要SNPs以灰色显示。灰色阴影表示SNP对之间的重要LD(无号的深灰方块表示成对D，-1),白色方块表示无重要LD的迹象，而无号的灰色方块表示不带有统计重要性的值为1的成对D:运用D，测定LD并且方块中的凄t字以D，承IOO给出成对LD。12图4:染色体1的多点连锁结果。左图表示4吏用所有SNPs时的结果，而右图表示仅使用H-clustSNPs分析的结果。标记"F"的峰表示可能为由于高SNP-SNPLD导致的假峰，而标记"C"的峰对应于CFH基因。水平线表示多点Sa(CFH-1最大值S州)的1-单位支撑间隔。图5A-5C提供基于679CIDRSNPs和179非相关对照的染色体1的连锁不平樹"漠式。图5A:188cM的假峰(见图4),图5B:202cM的假峰(见图4),图5C:CFEN立点上的连锁峰。4艮峰中带有最大Sw的SNP以灰色显示而真实连锁峰中来源于CCREL(表5)的CFH上的重要SNPs以灰色显示。灰色阴影表示SNP对之间的重要LD(无号的深灰方块表示成对D，=l),白色方块表示无重要LD的迹象，而无号的灰色方块表示不带有统计重要性的值为1的成对D:运用D，测定LD并且方块中的婆t字以D，*100给出成对LD。图6A和6B:图6A:GRK5(1区域)，RGS10(SNP6)，PLEKHA1(2区;或)，LOC387715(3区i或)，PRSS11(4区i或)的连锁不平衡模式。图6B:CFH(区域1)的连锁不平衡才莫式。灰色阴影表示SNP对之间的重要LD(无号的深灰方块表示成对D，=1)，白色方块表示无重要LD的迹象，而无号的灰色方块表示不带有统计重要性的值为1的成对D:运用D，测定LD并且方块中的#1字以D，承100给出成对LD。CCREL等位基因试验中的重要SNPs是灰色中最高的(见表6)。三个SNPs(rs6428352,rsl2258692和rsl1528141)由于非常低的杂合性不包括在内，而一个SNPs,rs2736911,由于其无4言息也不包4舌在内。表明这些区i或清楚的显示了基因的位置而非代表单体型区域。图7显示CFH,ELOVL4，PLKEHA1，和LOC387715基因的评估的粗略ORs和95%CIs。一个或两个危险等位基因(RR+RN)将与非-危险等位基因(NN)主体纯合子比较。实线表示对应于OR(开环)的95%。1。点垂直线表示OR为l的空〈直。垂直列给出了在AREDS和CHS队列中评估的对比值。图8显示了CFH的评估ORs和95%CIs。A:显性效应(CT+CCvs.TT)评估ORd師。B:杂合子(CTvs.TT)危险性评估ORhet。C:隐形效应(CCvs.CT+TT)评估ORrec。D:杂合子(CCvs.TT)危险性评估ORh。m。点垂直线表示OR为1的空值。图9显示了ELOVL4的评估ORs和95%CIs。A:显性效应(AG+GGvs.AA)评估ORd。m。B:杂合子(AGvs.AA)危险性评估ORhet。C:隐形效应(GGvs.AG+AA)评估ORree。D:杂合子(GGvs.AA)危险性评估ORh。m。点垂直线表示OR为1的空值。图10显示了LOC387715的评估ORs和95%CIs。A:显性效应(GT+TTvs.GG)评估ORdom。B:杂合子(GTvs.GG)危险性评估ORhet。C:隐形效应(TTvs.GT+GG)评估ORrec。D:杂合子(TTvs.GG)危险性评估ORh。m。点垂直线表示OR为1的空^f直。图11显示了PLEKHA1的评估ORs和95%CIs。A:显性效应(AG+AAvs.GG)评估ORd。m。B:杂合子(AGvs.GG)危险性评估ORhet。C:隐形效应(AAvs.AG+GG)评估ORrec。D:杂合子(AAvs.GG)危险性评估ORh。m。点垂直线表示OR为1的空值。图12提供了来源于包括了CFH中Y402H熔解-分析数据组的评估ORs和95%CIs，及从固定和随机效应模型中汇集的评估值。顶端的数据显示ORhet(CT杂合子对比于TT的OR)而底部的凄史据显示ORh。m(CC杂合子对比于TT的OR)。'Hage-C，和'Hage—I,表示来源于Hageman等的Columbia禾口IowacohortsDi平估值(Hageman，G.S等(2005)AcommonhaplotypeinthecomplementregulatorygenefactorH(HFl/CFH)predisposesindividualstoage—relatedmaculardegeneration.ProcNatlAcadSciUSA.2005May17;102(20):7227-32.Epub2005May3)，分别地，'Jakobs，表示来源于Jakobsdottir等文章的评估值(Jakobsdottir，J等(2005)Susceptibilitygenesforage—relatedmaculopathyonchromosome10q26.AmJHumGenet.77，389-407)。"固定"表示来源于所有试验的汇集的评估值都假设研究之间的可变性是归因于偶然的。"随机"表示来源于所有试验的汇集的评估值都考虑了研究中的异质性。"IlAMD，。，是评估值中包括的ARM情况的全部凄t量，而"Ile。n"包括在评估值中的无ARM的对照的全部数量。点垂直线表示同质下汇集OR的点评估值("固定')。图13提供了A:在包括CFH中的Y402H的meta-分析的阵列中，非相关ARM情况中的基因型频率(％)。B:在包括CFH中的Y402H的meta-分4斤的研究中，无ARM的非相关对照的基因型频率(％)。"Hage-C"和"Hage-I"表示来源于Hageman等的Columbia和Iowa阵列的评估值，分别地，"Jakobs，，表示来源于Jakobsbottir等文章的评估值。图14提供了来源于包括了LOC387715中S69A熔解-分析数据组的评估ORs和95%CIs，及从固定和随机效应模型中汇集的评估值。顶端的lt据显示ORhet(GT杂合子对比于GG的OR)而底部的ft据显示ORh。m(GG杂合子对比于TT的OR)。"Jakobs"表示来源于Jakobsdottir等文章的评估值(Jakobsdottir,J等(2005)Susceptibilitygenesforage-relatedmaculopathyonchromosome10q26.AmJHumGenet.77,389-407)。"固定"表示来源于所有试-验的汇集的评估值都<叚i殳研究之间的可变性是归因于偶然的。"随机"表示来源于所有试验的汇集的评估值都考虑了研究中的异质性。"11扁0"是评估值中包括的ARM情况的全部数16量，而"nc。n，，包括在评估值中的无ARM的对照的全部数量。点垂直线表示同质下汇集OR的点评估值("固定，)。图15^是供了A:在包括LOC387715中的S69A的meta-分一斤的阵列中，非相关ARM情况中的基因型频率(％)。B:在包括LOC387715中的S69A的meta-分析的研究中，无ARM的非相关对照的基因型频率(％)。"Jakobs"表示来源于Jakobsbottir等文章的评估值。图16提供了LOC387715的氨基酸(序列号19)和核酸序列(序列号20)。具体实施例方式如下列所述，等位基因变异型，包括单核苷酸多态性，已经在染色体10q26上被鉴定。这里显示的等位基因变异型与年龄-相关黄斑变性的高危发生相关。实施例1鉴定了PLEKHA1和/或LOC387715是ARM相关的等位基因变异型位点。进一步的研究，如实施例2显示，i正实并进一步支持LOC387715变异作为ARM标记的相关性。LOC387715变异作为ARM标记的相关性还未4皮4非除，但最近的遗传学研究的i正据更加强烈显示变异发生在LOC387715基因上。因此提供了对具有高危险性发生年龄-相关黄斑变性的病人个体进4于确i人的方法。本方法包4舌鉴定来源于主体核酸才羊本中PLEKHA1和/或LOC387715,在一个非限制性实施方案中，LOC387715中，等位基因变异或特定单倍型的发生(包括几种等位基因变异)。特定单核甘酸多态性(SNPs)在这些位点上已经,皮鉴定，包括，非限制性的，这些SNPs鉴定为rs4146894，rsl045216,rsl0490924,rsl882907,rs760336，和rs763720。方法进一步包括在补体因子H(CFH)中对等位基因变异型进行鉴定，例如，非限制性的等4立基因变异型定义为rsl853883。这里4吏用的，"等位基因变异型"指核酸上的，典型的为主体的，如病人的一个或一个以上等位基因原初氨基酸序列的变异。等位基因变异包括在蛋白表达中具有任何某项效应的单一或多重核苦酸和氨基酸的替换，增加或删除，包括f旦不局限于调节转录的启动子活性，移码，早期蛋白终止，蛋白错误-折叠，选择性蛋白加工，破坏(或增强)蛋白的活性位点或结合位点，mRNA的4晉误拼4妄或影响最终基因产物的表达和/或功能的核酸或蛋白的任何其他特征。一个氨基酸和核酸序列的变异可以是或非沉默的，即非表型效应，如疾病的威胁，可以与序列变异相关。另一方面，等位基因变异可以是公认的"野生型"核酸或氨基酸序列的变异，其通过这里描述的示范性和非限制性统计学方法，被"i人为与疾病危险，如ARM,是牵连的，相关的或相写关系的。这样，LOC387715单核甘酸多态性rsl0490924(Ser69Ala)是一种等位基因变异。大量的方法，包^^高通量的方法，可用于测定SNPs和/或其他等位基因变异，非限制性地如下列实施例描述的PCR和限制性片断长度多态'l"生方法。一个实施方案中，通过4壬4可方法对才羊本中的DNA进行测序(重新测序)鉴定SNP或小等位基因变异。许多重新测序的方法在4页域中是已知的，包括高-通量方法。扩增-基础的方法也可以用于鉴定等位基因变异，如SNPs,包4舌，非限制性的PCR,反转录PCR(RT-PCR),等温扩增，基于核酸序列的扩增(NASBA),5，荧光核酸酶方法(例如TAQMAN方法)，分子信标方法和滚环扩增。其他方法，如作为合适的和有效的鉴定不同等位基因的限制性片断长度多态性RFLP，也可以应用。方法可以是多重的，意口未两种或多种反应可以在相同的物理位置同时进行，如在相同的管或阵列中相同位置_只要多重反应的反应产物可以区分。作为非限制性的实施例，可以通过4吏用和监控对应于两种不同序列-特意探针的不同荧光燃料的聚集或损耗，复合TAQMAN或分子信标方法。许多情况下，通过个人选择和经-验，现有的设备和试剂，高通量和/或复合方法的需要，费用，方法的精确性，和技术员操作方法的技术水平来指定合适的方法。这些技术的设计和实施是广泛-知晓的并在本领域中技术人员平均能力之内。在这里提供的方法的实施中，可以使用一个阵列。在进行高-通量方法时阵列是特别有用的。阵列典型地包括一种或一种以上试剂，例如非限制性的，核酸引物和/或探针，以鉴定人类主体核酸样本中对应于LOC387715和/或PLEKHAl上的一个或一个以上单核甘酸多态性的等位基因变异的发生，例如，非限制性的，以下鉴定的SNPs:rs4146894，rsl045216,rsl0490924，rsl882907,rs760336,rs763720,rs800292,rsl483883,rsl853883和rsl853886。阵列可以同时测试和鉴定LOC387715和/或PLEKHA1上的一个或一个以上等位基因变异，例如，非限制性的，以下鉴定的SNPs:rs4146894,rsl045216，rsl0490924，rsl882907，rs760336,rs763720，rs800292，rsl483883,rsl853883和rsl853886,以及同时测定CFH，其他基因/位点和对照基因/位点/核酸上的等位基因变异。这里^f吏用的术语"阵列"指有助于鉴定基因上定位于两个或更多已鉴定的位置的等位基因变异的试剂。一个实施方案中，阵列是一种装置，其具有两个或更多分离的，确i^的反应腔室，例如，非限制性的为96-孔板，在其中进行包括确定组分的反应。一个示范性实施方案中，两种或更多核酸引物或4果针以空间可寻址方式固定于基质上，从而每个独立的引物或探针固定于基质的不同的和(可寻址的)确定位置。基质包括，'非限制性的，多-孑14反，硅片和硅珠。一个实施方案中，阵列包括两套或多套珠，每套珠具有一个确定的标记，如一个量子点或萸光标签，从而可以〗吏用，例如非限制性的，流式细胞仪对珠进行单独确认。一个实施方案中，在目前所描述的范围中，阵列可以是包4舌两个或多个反应腔室，其带有扩增DNA以鉴定SNPs的引物或结合特定序列的纟果针。从而，试剂，如探针和引物可以结合或沉积于阵列的特定位置。试剂可以为任何合适的形式，包括，非限制性的溶液，干燥，冻干或3皮璃4匕。有用的阵列4支术包4舌，例如并且非限制性的，AffymetrixGeneChipRArray,例如，GeneChipRCustomSeq及ResequencingArrays(可从California,SantaClara，AffymetrixInc.商业获得)和相似技术。从病人样本获得的数据中分析阵列数据和/或鉴定遗传危险性因子的信息和/或统计软件或其他计算-^M亍程序在本领域中是已知的。这里^f吏用的，"鉴定主体核酸样本中发生等位基因变异的试剂"，其中该等位基因特被异地鉴定或在基因或位点中被鉴定，指通过任何合适的方法，例如非限制性的，通过PCR,再测序5，外切核酸酶(TaqMan)方法和/或阵列或高-通量方法，鉴定特定等位基因变异的试剂。这些试剂的非-限制性实施例包括在任何有用的方法系统中使用的序列-特异引物，引物对和探针。引物和探针可以为任何有用的形式，但是典型地为核酸，但可以为核酸类似物，如，非限制的为石克代^粦酸化物。实施例1中，^使用高密度SNP板在lq31和10q26的两个交联区域进行基于家力臭的交联研究和疾病-对照相关的研究。染色体lq31的SNP交写关和相关的结果证实交联峰和ARM最强关联21位于CFH基因上。分析染色体10q26的家族和疾病-对照数据以鉴定下一个主要ARM易感-一目关基因。实施例2描述的以下研究中，对心血管研究(CHS)恢复的主体，一种不将年龄-相关黄斑变性(ARM)情况作为研究因素的群体-基础的队列，和年龄-相关眼疾病研究(AREDS),—种将ARM情况作为研究因素的群体-基础的队列进4亍嵌套式疾ARM易感寸生中的CFH，PLEKHA1，LOC387715和ELOVL4基因。此外，这两个队列在OC387715的meta-分析中分别包括了额外增力。1和4个疾病-对照研究。两个队列中CFH与ARM情况显著相关(pO.00001)并且meta-分析证实了杂合和纯合情况下(OR,2.4和6.2;95%CI(置4言区间)，分别为2.2-2.7和5.4-7.2)危险等位基因提供了该易感性。两个队列中LOC387715与ARM情况显著相关(pO.OOOOl)并且meta-分析证实了杂合和纯合情况下(OR，2.5和7.3;95%CI，分别为2.2-2.9和5.7-9.4)危险等位基因提供了该易感性。PLEKHA1，其与LOC387715紧密相关，在AREDS队列而非CHS队列中与ARM情况明显相关，而ELOVL4在两个队列中都与ARM显著不相关。通过对具有ARM情况不同研究策略的阵列进行评估以及meta-分析的进一步支持，该研究提供了CFH和LOC387715基因在ARM易感性中的进一步支持。实施例1材料和方法家力矣和疾病_7于照阵列共612个AMD家力矣和184的非相关^f照送至遗传疾病研究中心(CIDR)鉴定基因型。由于人种基础的可能性，我们的数据仅限制于对高加索组进4亍分析。高加索组具有594个AMD家族，包括1443个基因型个体，和179个非相关对照。高加索家族包括430个基因型相关的血缘对，38个基因型相关的伯父对，和52个基因型相关的第一代堂兄妹对。共323个高加索家;^矣，117峰非相关对照，和196个非相关疾病也对额外SNPs进行部分基因型鉴定。部分组包括824个基因型个体，298个基因型相关的血缘伯父对，23个基因型相关的伯父只于和38个基因型相关的第一代堂兄妹对。Merlinpackage中的PdeStats(Abecasis等，2000)可方便地用于概要计算家族数据。疾病情况模型三个经典的才莫型(A,B和C)用于定义ARM情况的严重性(Weeks等，2004)。最简化的情况下，仅限于关注最严重的和最保守诊断的"类型A"疾病。仅使用在所有三种诊断模型中都未受影响的非相关对照。未受影响是那些眼睛护理纪录和/或眼底照相显示无任何黄斑变化(包括玻璃膜祝)或少量(少于10)硬玻璃膜疣(50孩t米直^:或更小)而无4壬4可其4也RPE变4b的个体。当具有可用信息时，带有大量黄斑外玻璃膜疣的个体不属于未受影响。为解释特异ARM亚-型，只有那些疾病末阶^:的，任一眼中被证明具有脉络膜新生血管膜(CNV)的，或任一眼中具有地区萎缩(GA)的情况被选择关注。具才艮道大量个体皆具有地区萎缩和CNV,然而由于这些情况中难以获知地区萎缩是继发于CNV的损害或来自于限制CNV生长的治疗(例如，激光，手术，或光力学治疗)，其将是问题化的。由于难以在照片或纪录中辨别病人眼GA是否先于CNV的发生，CNV组中包括了皆具两种疾病的病人。然而，在地区萎缩组中《又包括该交叠组中的亚组，特别是具才艮道一个眼睛中具有;也区萎缩而无CNVi正据的情况。表1显示三种情况组中个体的数量。这些研究可能排除了i也区萎缩组中的小部分个体，其在相同眼中在CNV发生之前就具有不对称i也区萎缩或在两眼中都发生CNV时已经具有对称地区萎缩。表1高度ARM病人的亚型分布。括号中的数字指皆具CNV和GA并且包括在GA组中(见选择标准)用于几率和归因危险性评估和相关试—验的个体。24<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>系谱和分型4晉误和翁:据处理PedCheck禾呈序(O，Connell和Weeks1998PedCheck:在交联分析中分析基因型不相容的程序。AmJHumGenet63:259-266)用于-险证Mendelian矛盾。在小家族中确定哪个基因型是错误的是非常困难的(Mukhopadhyay等，2004Comparativestudyofmultipointmethodsforgenotypeerrordecetion.Hum—Hered58:175-189)，在含有Mendelian矛盾的家族中的每个缺失问题标记中i殳定所有基因型。Mega2(Mukhopadhyay等，http:〃watson.hgen.pitt.edu/register)用于建立文4牛进4亍交联分才斤以及通过基因-计数评估等位基因频率。等位基因频率和HardyWeinberg平衡乂人非相关和非影响对照中，通过直4妄计数，评估交耳关分析中的等位基因频率。所有对照在所有三个疾病情况模型中都是未受影响的。未有小孩的基因型配偶，或其小孩非本研究的一部分，合并入本研究的只于照。^青确的Hardy^Veinberg平衡，按Mega2执行(Mukhopadlyay等.2005Mega2:data-handlingforfacilitatinggeneticlinkageandassociationanalyses.Bioinformatics)，用于我们的SNPs。Mendelversion5(Lange等，2001MENDELVersion4.0:Acompletepackagefortheexactgeneticanalysisofdiscretetraitsinpedigreeandpopulationdatasets.AmJofHumGenet69(Supplement):A1886)也直4妄用于评估家族凄史据的等位基因频率，Mendel在评估等位基因频率时完全地说明主体的相关性。因为基因型家族成员大多数是患病的，这些评估值与使用非相关疾病获得的评估值相当接近。遗传图谱Rutgers联合交联-物理图语(2.0版本)(Kong等，2004Acombinedlinkage-physicalmapofthehumangenome.AmJHumGenet75:1143-1148)#皮用于子页测在Rutger图i普中还未出现的SNPs遗传位点。因为我们的SNPs在期望区域的分布非常密集，故几个SNPs之间的评估重组为零；这些情况下重组i殳定为0.000001。获得来源于NCBIdbSNP数据库(人类构造35)的我们的所有SNPs物理位点。交耳关不平衡结构进4亍交联分析时忽3见SNPs之间的高交联不平tf(LD)可以导致假阳性结果(Schaid等，2002Cautiononpedigreehaplotypeinferencewithsftwarethatassumeslinkageequilibrium.AmJHumGenet71:992-995;H画g等.2004Ignoringlinkagedisequilibriumamongtightlylinkedmarkersinducesfalse-positiveevidenceoflinkageforaffectedsibpairanalysis.AmJHumGenet75:1106-1112)。考虑高SNP-SNPLD的努力包括1，运用H-cluster方法研究非相关对照中的LD结构(Rinaldo等，2005Characterizationofmultilocuslinkagedisequilibrium.GeneticEpidemiology28:193-206)，其以R进行操作(RDevelopmentCoreTeam2004R:Alanguageandenvironmentforstatisticalcomputing.RFoundationforStatisticalComputing,Vienna,Austria.ISBN3-900051-07-0，Rstatisticalsoftwarewebsite,htt.p:〃www.r—roiect.org/)。目6令是观'J定交联分析中的单4莫标本-标"i己的SNPs(htSNPs)。方法使用分层聚类来汇集高相关SNPs。聚类后，H-clust方法在每个聚类中选择htSNP;htSNP是聚类中与其他所有SNPs最具相关性的SNP。对SNPs进行选择从而使得每个SNP至少与一个htSNP的相关系数(r2)大于0.5;2.禾呈序HaploView(Barrett等.2005Haploview:analysisandvisualizationofLDandhaplotypemaps.Bioinformatics21:263-265.)被用于获得染色体1和10上的SNP-SNPLD图形显示；以及3.<吏用两个和三个-SNP移动窗进4于单倍型-基础的相关性分析(见如下)。交联分析1.单一点分牙斤。^口我们先前的研究(Weeks等，2004),LOD分值在单一(疾病等位基因频率=0.0001并且外显率矢量=)。由于ARM显性杂性和晚发性，仅使用两种疾病显性"模型A中收影响的"和"未知'。，在异质性下计算参变量LOD数^直(HLOD),而运用线性Sau统计学计算才莫型-自由LOD数值。两种凄丈值都用Allegro计算(Gudbjartsson等，2000Allegro,anewcomputerprogramformultipointlinkageanalysis.NatGenet25:12-13.)。2.忽略交联不平衡的多点分析。既然内部-标记距离通常是非常小的，SNPs之间的LD可以非常高并且违背许多交耳关分^f程序获得的无LD的假设。运用Allegro进行忽略LD的多点分析(Gudbjartsson等，2000)。HLODs和Sall统计都被计算。3.运用htSNPs的多点分析。当仅使用htSNPs计算LOD数值时，染色体1和染色体10上的SNPs婆t量减少至533和159个。如上进行多点LOD分析(Weeks等，2004)。忽略的SNPs很好地符合HaploView评估的SNP-SNPLD结构(Barrett等，2005)。相关性分析为了使家族中的所有病例都能被使用，新的CCREL程序(Brownig等，2005Case-Controlsingle-markerandhaplotypicassociationanalysisofpedigreedate.Genetepidomiol28:110—122)被运用，其通过同时使用相关病例和非相关对照以测试相关性。CCREL被用于在染色体1和10的交联峰分析SNPs以测定相关性。CCREL试—验通过计算病例和对照的有效数量而关注于生物-相关的主体。对于这些分析，非相关对照被给予"正常"表型，而未受"类型A"ARM影响的家族成员被给予"未知"表型(CCREL方法还未能够同时l吏用相关病例和相关对照)。用于相关性试-验的每个SNP的对照的有效凄t量是对该SNP进4亍基因型定义的对照的数量。一个等位基因试验，一个使用两个SNP滑动窗口的单模标本试验，使用三个SNP滑动窗口的单模标本试验和一个基因型试验被执行。根据作者所提供的使用CCRELR包进行分析(Browning等，2005)。GIST分析为了研究对于交联信号最关键的等位基因/SNP，使用来源于CCREL试-验的局部基因型SNPs和重要SNPs,在染色体1和10交联峰之间进行基因型-IBD共享试验(GIST)。GIST试验测定一个等位基因或LD等位基因是否部分为观察到的交联信号(Li等，2004)。计算三种不同疾病^^莫型(隐性，显性，附加)下每个受影响亲全彖关系的重量-在无疾病-标记相关性的零作i设下这些重量是非偏差的。试-险统计的基础是家族重量变数和非参数联结(NPL)值间的相关性。因为GIST试-睑目前仅应用于受影响的亲缘对家族成员，故在计算NPL值之前将家族成员划分入其成员4亥心家系。因为以下的疾病才莫型是未知的，我们在三种不同疾病;f:莫型下(隐性，显性，附加)进行测定，对三种模型运用适合于多重试验的p-值，并取混合值。三重分析以三步连续步骤进行分析。首先，分析已经以CIDR进4亍基因分型的一套数据。第二，在染色体10PLEKHA1/LOC387715/PRSS11区域对8个附加SNPs进4亍局部基因分型，分析局部_基因型邀:据组。注意应^f吏所有PRSS11区域上的PLEKHA1中所有已知非-同义SNPs老N皮研究。这两组数据在大小和成分上都不同，易于分离地对其进行分析(表2)。按上述对这些(重叠)数据组进行等位基因频率评估，CCREL相关性试验，和GIST试验。第三，我们测试染色体1和染色体10区域的交互作用，并测定危险性的不同是否为地图状萎缩或脉络膜新生血管膜的因素。表2每部分统计分析和样本大小概要<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>部分1:分析CIDRSNPsCIDRSNP基因分型为鉴定染色体10q26上的应答基因，遗传疾病研究中心(CIDR)对612AMD家族和184非相关对照进行了高-密度客户SNP基因分型，包括了期望区域上13.4Mbp(26.7cM)的199SNPs。196SNPs一皮用于分4斤其中三个由于在对照中缺少多态性而忽略(在家族数据中进行检查，缺失的等位基因是非常稀少的并只出现在异质结合体中)。染色体lq31上包括45.7Mbp(47.1cM)的684SNPs也进行基因分型；五个SNPs由于在对照中缺少多态性而忽略-缺失的等位基因或者是不出现的或非常稀少并在家》矣数据中仅出现在异质结合体中。见表3中这里提供的标记等位基因和实际等位基因间的相关性，及非-同义SNPs，氨基酸改变。表3等位基因标记。每个研究标记，等位基因标签，非-同义SNPs氨基酸改变，CIDR对照的等位基因频率(179)和局部对照等位基因频率(117重叠CIDR对照)和实际试-验的HWEp一值。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>部分II:局部分型SNPs分析局部分型SNPs-包4舌三个易感基因，PLEKHA1(rsl2258692，rs440524和rsl045216)，LOC387715(rsl0490923，rs2736911,rsl0490924)牙口PRSSll(rsl153715,rsl803403)的染色体l0上的八个附加SNP也被基因分型。该基因分型包括已经在NCBI数据库中被报道的所有非-同义SNPs(见图1)。作为另一研究的一部分(Conley等，2005候选基因分析提供了年龄-相关黄斑病变病原学中的脂肪酸生物合成4见律和补体系统的调整)，两个CFH变异体(rsl0922093和rs1061170)^皮基因分型，并在此#皮<吏用。对GRK5/RGS10位点的附加SNPs的基因分型正在进行中。rsl2258692,rsl803403和新定义的SNP，rs4405249，rsl2258692的3'—个碱基的基因分型数据，通过测序收集(RexagenCorporation,Seattle,WA)并用Sequencher软件分析(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)。<吏用RFLP收集rsl1538141，rs2736911,rsl0490923和rsl0490924的基因分型数据。合适的引物，扩增条件和限制性内切酶见表4，其中通过测序或RFLP对SNPs进4亍基因分型。表4通过测序或RFLP进行基因分型，用于基因数据收集的引物，退火条件和限制性内切酶。NA-无应用变量引物序列序列号退火温度(°c)限制性内切酶rsl1538141CAGAQTCGCCATGCAGATCC(F)158MnIICCCGAAGGGCACCACGCACT(R)2rs273舰lGCACCTTTGTCACCACATTA(F)354DraIIIGCCTGATCATCTGCATTTCT(R)4rsl0490923GCACCTTTGTCACCACATTA(F)554HhalGCCTGATCATCTGCATTTCT(R)6rsl0柳924GCACCTTTGTCACCACATTA(JF)54PvuHGCCTGATCATCTGCATTTCT(R)8rsl803403TGCTGTCCCTTTGTTGTCTC(F)955NAAGACACAGACACGCATCCTG(R)10rsl225鹏2GCCAGGAAAAGGAACCTC(F)U54NAGCCAGGCATCA八GTCAGA(R)12使用5,夕卜切核酸酵Assay-on-DemandTaqManassay(AppliedBiosystemsIncorporated,LaJolla，CA)分析rsl045216的基因分型数据。使用ABI7000和SDS2.0软件(AppliedBiosystems)进行扩增和基因型分配。两个非相关CEPH样本X十每个变量进行基因分型，并包括每个凝胶和每个TaqMan板以确定基因型呼叫的内部稳定性。此外，对每个变量进行双-隐蔽基因分型，比较，使用原始数据或重-基因分型对每个差异点进行定位。见表3,这里提供的等位基因标签和实际等位基因间的相关性，以及，只十于非-同义SNPs，氨基酸的改变。部分in:交互性和比值比(OR)分析非相关病例-CIDR没有对非相关病例进行基因分型，但是196非相关病例进行局部附加SNPs基因分型。为计算比值比和交互分析(见下述)，从每个家族中选取一个"类型A"的受影响病人组建非相关疾病组。321局部-基因型家族至少具有一个"类型A"受影响病人。如果一个家族拥有超过一个"A"受影响病人，则将从主要在rs800292(CFH),rsl061170(CFH),rsl537576(GRK5)和rs4146894(PLEKHA1)进4亍基因分型的人群中选择；如杲在两个个体间基因分型SNPs的数量没有明显区别，则将选择产生疾病的年轻者，否则"A"受影响疾病将/人进4于最主要基因分型的并且最早发生的人群中随才几糸IL选。577CIDR家族至少具有一个"A"受影响病人，321个这些家族也进行局部基因分型，并且挑选的"A"受影响病人与局部组中的相同。剩余的256个家族，基于上述相同的标准，仅使用rs800292(CFH)，rs1537576(GRK5)和rs4146894(PLEKHA1)寻4戈最具完全基因分型的病人。分才斤CFH交互性CFH与染色体1和染色体IO上的基因的交互性可通过GIST评估，是否CFH上的SNPs有助于染色体10的交联信号及染色体10上的SNPs有助于染色体1的交联信号。通过使用来源于一个染色体上的SNPs和另一个上的家力矣-基础的NPLs的重量而进行。按照North等(2005)包括两个原因位点的疾病-控制相关研究的对凄t降解应用，HumHered59:79—87,对凄t降解也可以用于评估不同的交互才莫型经测试交互性。本应用中，许多不同可能性的交互模型，同时考虑了两个位点的附加和主要效果，为挑选最相似和节省的一莫型，将比4交不同模型的相关可能性。如前所述(North等，2005),合适的模型包括仅评估平均情况的MEAN才莫型，；平估一个或另一个或两个4立点上的附加凌文果的ADD1，ADD2和ADD模型，额外整合主要效果的DOM1,DOM2和DOM才莫型和考虑交互凌文果的两个才莫型，ADDINT和DOMINT(更多细节，请见North等(2005))。由于一些模型的配对是非嵌套的，将使用Akaike信息标准(AIC)比较；本研究中，具有最低AIC的模型被认为是最适合和最节省的。使用North和其合作者提供的程序进行这些分析。对早已经发现的一些程序缺陷进行改善后；结果用我们自己的R程序进行双-检查。为使样品大小最小化，选择每个基因内具有高度重要非-同义SNP的高LD内的CIDRSNPs。选4奪CIDRSNPrs800292来表示rsl0611710(CFH的Y402H变体)，CIDRSNPrs4146894表示PLEKHA1内的rsl045216。相似的，选择GRK5，RGS10,PRSSll内的代表性CIDRSNP。相关性的大小在每个基因中计算并且优势比并评估对于SNPs的归因危险性。至少在对照中是频繁出现的等位基因被认为是危险等位基因。使用等式AF=100*P*(OR-1)/(1+P*(OR-1)评估归因危险性，其中OR是优势比而P是从对照中评估的人群中危险等位基因的频率。^吏用对比于对照的"类型A"影响者，，t比于乂于照的CNV主体和对比于对照的GA主体。为<吏用最大可能性的不同大小的，但重叠的样本，将使用CIDR和局部分型SNPs样本。使用从家族中才兆选的577病例和179非相关情况计算CIDRSNPs的OR和AR,使用517病例(其中321例在577CIDRSNP情况中)和117对照(所有都在179CIDRSNP对照中)i十算局部分型SNPs的OR和AR。多重试-验方案为在先前研究中探索染色体10q26区域上ARM-易感位点的有力证据，除了假-没试-验，这里进行的分析更关注于评估易感基因的位点。多重试-睑方案是至关重要的并与個二没试验相关。在评估中，当信号非常强时这些研究的焦点是简单的。任何情况下，多重试—验的任何修正都不钢鞭结果的排列顺序。Bonferronifl"正，38其由于LD不关注任何试-验间的相关性，0.05水平的196个试-验将导致0.05/196=0.00026的重要界限；由于LD的相关性将导致更大的界限。结果以三个连续步骤开展分析。第一，分析在CIDR被基因分型的一组数据。第二，对染色体10上PLEKHA1/LOC387715/PRSS11区域的额外8个SNPs进行局部基因分型，我们随后对局部-基因分型数据组进行分型。如上述对这些(重叠)数据组进行等位基因频率评估，Hardy-Weinberg平4軒(表3),CCREL相关性试验，和GIST试验。第三，分析染色体1和染色体10区域的交互性并对地理性萎缩或脉络膜新生血管存在的危险性是否具有功能性的不同进行测试。部分I:分析CIDRSNPsCIDR交联结果如我们前述的研究使用CIDRSNPs并运用相同的交联分析(Week等，2004)，染色体10上的Sail多点曲线峰表明了GRK5区域(图2中的"GVGRK5中的rsl537576具有1.87的单-点Sall而在rs555938具有最大单-点Sail值3.86,GRK5着丝粒为206kb)，但某些评估了两-点非-参数SailLOD分值和我们的最高异种LOD分值(HLOD)，其关注于PLEKHA1/LOC387715/PRSSll区i或(图2中"P，)。在jt匕区i或，PLEKHAl内的SNPrs4146894具有3.34的两-点Sail和2.66的最高两-点HLOD,而PRSSll内的SNPsrs760336禾口rs763720分另'J具有2.69和2.23的两-点Sall。然而，支持间隔是4交大的(10.06cM，图2),仅仅由交联分析得出的定位是不严密的。将所有SNPs的多点分值(图2,左部分)与仅以htSNPs计算的进行比较研究未考虑SNP-SNPLD造成的影响。当仅使用H-成串SNPs时其中的两个峰几乎完全消失(指错误峰，"F"s，图2，左部分)；有趣的是这两个峰存在于单体型区域(图3A和3B)而最高的多重-和两-点LOD分值周围的LD是4交低的(图3C,3D-1和3D-2)，表明进行交联分析时关注LD的重要性。染色体1交联结果得到三个Sall大于2的峰，当分析受限于htSNPs(图4)时仅获得一个峰。保留的峰跨越了补体因子H(CFH)基因并且包4舌两个具有非常高的两-点Sall和HLODl直的SNPs;rs800292，CFH上的一个非-同义SNP,其Sall为1.53而HLOD为2.11,SNPrsl853883，CFH的165kb端粒，其Sail为4.06而HOLD为3.49。这些结果有力的支持了早期ARM中CFH，s损害的发3见(Conley等，2005;Edwards等，2005;Hageman等,2005bAcommonhaplotypeinthecomplementregulatorygenefactorH(HF1/CFH)predisposesindividualstoage-relatedmaculardegeneration.ProcNatlAcadSciUSA.;Haines40等，2005;Klein等，2005;Zareparsi等，2005a)。在交联分析中4吏用所有我们的SNPs可以^见察到消失的峰(图4中的"F"s,左部分)定位于强单倍型区域(图5A和5B),而CFH峰下的LD相只于4交^f氐(图5C)。CIDR相关性结果为获得比交4关更细致的定位，进行相关性分才斤(其成功用于研究染色体1上的CFH)。在此，运用CCREL方法进行相关性分牙斤，其可以通过合适;也调整疾病的相关性同时<吏用我们的非相关对照和所有相关家族。染色体10上的CIDR样本中，我们的交联_峰内，我们发现S，越3个基因PLEKHA1，LOC387715和PRSSll的具有非常小p—^f直的四个附力口SNPs(rs4146894,rsl882907,rs760336和rs763720)。染色体10上最强的CCREL结果在包括SNPrs4146894的PLEKHA1内(表5)。同时使用三个SNPs的移动窗单倍型分析(，，单倍3，)在^,越全部PLEKHA1至PRSS11区域时获得非常小的p-值(表5)。相关性试验在GRK5区域在产生了一些适中的小p-值，其为交联发生的最强证据。对跨越染色体1上交联峰的56个SNPs进行CCREL，发现CFH上的两个高度重要性SNPs(rs800292和rs1853883)(表5)。同时^f吏用两个(，，单倍2，〉和三个("单倍3，)SNP的移动窗单倍型分析获得非常低的跨越整个CFH基因的p-值(表5)，进一步支持早期ARM与CFH的强相关性的发现。CIDRGIST结果对CIDR数据组进行GIST试验时，两个最小的p-值(0.006，0.004)发生于染色体10q26上的GRK5/RGS10区域，而第三个最小的p-值(0.008)发生于PLEKHAl(表5)。GRK5基因上的所有四个SNPs具有小的GISTp-值。GIST结果表明GRK5和PLEKHAl对于染色体IO上的交联信号，以及CFH对于染色体1上的交联信号是至关重要的。PRSS11上的两个SNPs都对染色体IO上的交联信号无关。还没有证据表明染色体IO上的这两个与染色体1观察到的交^:信号相关。部分II:局部基因型SNP分析局部分析结果只于额外的SNPs局部分型后，等位基因和基因型试-验在三个基因PLEKHA1/LOC387715/PRSS11中都产生了非常小的p-值(表6)。同时^f吏用三个SNPs的移动窗单倍型分析("单倍3，)在跨越全部PLEKHA1/LOC387715/PRSS11区域时获得非常小的p-值(表6)。这样，当相关性暗示了LEKHA1/LOC387715/PRSSll区域，其在这些基因中并为进行区分。表5在CIDR进行分型家族(594)和对照(179)的CCREL,GIST，和等位基因频率评估。对照中较小等位基因的频率在对照(通过计算评估)和家族(通过Mendelversion5评估)中都被才艮道，对照和家族间的等位基因频率相差超过0.1时该等位基因频率以黑体显示。等位基因试-验，单倍型2SNP移动窗试-验，单倍型3SNP移动窗试验和CCREL的基因分型试验的P-值在S0.05时以黑体显示并在SO.OOl时以黑体和下划线显示。源于染色体1和10的使用NPL评价的GISTP-值当小于0.05是一皮才艮道并以黑体表示，在SO.OOl时以黑体和下划线显示。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表6局部-分型家族(323)和对照(117)的CCREL,GIST,和等位基因频率评估。对照中较小等位基因的频率在对照(通过计算评估)和家i臭(通过Mendelversion5评估)中都净皮才艮道，对照和家族间的等位基因频率相差超过0.1时该等位基因频率以黑体显示。等位基因试验，单倍型2SNP移动窗试验，单倍型3SNP移动窗试-验和CCREL的基因分型试-验的P-《直在S0.05时以黑体显示并在SO.OOl时以黑体和下划线显示。源于染色体1和10的使用NPL评价的GISTP-值当小于0.05是被净艮道并以黑体表示，在SO.OOl时以黑体和下划线显示。斜体的SNPs是局部分型SNPs。基因SNP家族对照bapk)2hsiplo3基因试验GIST(NPL10〕GIST(NPL1)rs66587880.5630.4830.022000.O00520.001620.049200.31S0.244rel5386870.2130.3420.000040.000430.000660細140.6520.302rsl4讓20.2990.3930.005970.026230.020S10.018190.4420.041rs9467550.2950.3800.012340.01243<0.000010.045310.4090.040rs64283520細0.004i細oo<0.00001<0.000011.00000CF/frs8002920.1200.269<0厕01<0.00001<0.00001<0.000010.3150.014my0.609()310<0.00001<0細01<0.00001<0.000010.8950.1320.2100.2950.006930.0017S<0.000010.017230.3600.327c服re706200.1480.1500.91163<0.00001<0.000010.567700.7370.356rel8538830.6330.432<0.00001<0.00001<0.00001<0.000010.7760.011p13605580.4370.3890.蘭40.435760.020790.379930.9750.488ts9559270.4330.3850.153430.01037-0.360870.0170.585rs43502260.0500.1030.00312-0.003730.2280.174■:f':」i-.',:::;'卞《r、—,;二■■■■■rs47522660.2230.2260.817720.277480.649170.082790.1070.453G船rs9153940.2280.2090.344890.832190.055600.621830.0490.320GAOrsl2689470.1170.1150.819750-027480.021920.789650.0490.689G船rsl5375760.4970.4190.026040.022320.056360.063340.0120.023rs20394880.0830.1150.111770.42428-0.423990.0250.358rel4678130.2930.2950.8660S--0.859540.506O.柳■、':■:」■」■::,.rs9274270.5060.4870.567100.000560.000S30.422640.3060.625—s41468940.6110.4740.000040.000120.000530.000240.0060.7370.0080細1.000000.547500細18i細oo0.1390.1580.393780.00026O駕柳0.331180.0030.3450.2890.4270.000040.000360.000010.000260.0680.825rsl8829070.1310.1840.017610.001400.010990.044010.0170.3720.0890.1410.021120.05024<0細010.034150.0860.2510.1210.1190.71668<0.00001<0細010.642300.3120.9680,475(U93<0細01<0細01<0細01<0.000010.0180.327ms〃0.0040.0051.000000.007260.01676i細oors7603360.3730.4740.005270.013860.000360.013960.4790.6S3ms〃rs7637200.2960.2260.016450細160.038990.3050.4510.1180.0300細090.000220.7140.77844局部GIST结果三个基因PLEKHA1/LOC387715/PRSS11中，GIST更强烈地暗示PLEKHA1(表6)。LOC387715也产生小p-4直(rsl0490924),但此SNP与PLEKHA1SNPs间具有高LD(见图6A)。与以上大CIDR样本获得的非-重要结果相似，当^f吏用局部分型凝:据组时，GIST在PRSSll中不产生任何重要结果。表明PLEKHAl(或具有强LD的位点)与AMD最相关，而LOC387715则是可能的。为公平地评估哪个SNP涉及区域内的交联信号，仅使用局部-基因分型家族计算NPLs。提供了表6中PLEKHA1/LOC387715/PRSS11结果和GRK5/RGS10结果的直4妄比4交。在局部分型凄丈据组中，GRK5GIST结果也是期望的，其具有与在CFH中运用GIST获得的p-值相同量级的合适的小p-值(表6)。然而，该p-l直不i口分4斤CIDR凄史4居纟且时所见的那么小。因为所有GRK5区域的SNPs都是CIDRSNPs,该差异作为样本大小的单独函数，局部-分型数据组小于CIDR数据组(见表2)。部分III:交互性和优势比(OR)分析GIST结果GIST试验中未观察到染色体1和染色体10区域间交互性的有力证据。当使用CIDR数据组测试染色体10上的SNPs是否有助于染色体1的交联信号(表5"GIST(NPL1)，)，仅有PRSSll上的rs7637204寻到小于0.05的p-值，然而rs763720并不明显地有助于染色体10的交联信号，使得此p-值缺少信服力。当仅4吏用局部数据组时，一个GRK5变量(rsl537576)，其在更大的CIDR数据组中是不重要的，给予了小于0.05的p-值。相似的，没有i正据表明CFH中的SNPs有助于染色体IO上的交联信号，^f又有一个SNP(rs955927)给予了小于0.05的p-<直，然而》匕SNP并不在CFH内并且与CFH基因中的任何SNPs没有强LD(见图6B)。逻4尋回归结果逻辑回归显示包括来源于CFH和PLEKHA1的两个变量的附加^f莫型是预测疾病-受控情况的最好模型；表明两个基因都对于ARM显型重要。AIC标准也纟会出一个包括附加交互性条件的附加才莫型是下一个最好的才莫型(表7)，然而交互条件是不重要的(p-值=0.71)。获得CFH和PRSS11间交互性的相似结果，其中包括两个变量的附加模型似乎为最好的模型。GRK5/RGS10区域，仅带有CFHSNP的模型是最适合的模型，表明在模型中附加GRK5或RGS10并不提高对CFH基因分型疾病-控制情况的预测。表7通过逻辑回归的适合两-点模型的结果。每个才莫型的AIC,最合适模型的AIC的差异。文中为模型定义。位点1:rs800292(CF巧位点2模型AICAIC差异rsl537576MEAN822,523.65ADD1798.80ADD2821.222.35ADD799.10.26DOM1799.70.91DOM2820.121.24DOM799,20,37ADDINT800.92.07ADDDOM802.13.25DOMINT803.95.07rsl467813MEAN821.923.53ADD17卯.40ADD2823.625.25ADD■31.92DOM1799.30.91DOM2825.226.79DOM802.64.23ADDINT亂32.93ADDDOM804.96.54DOMINT805.26.83rs4146894MEAN823,0249,26ADD1799,2425.49ADD2801.4727.71ADD773.760DOM1■1626.41DOM2803.4429.68DOM776.442.68ADDINT775.621.87ADDDOM779.856.09DOMINT778.264.5rs7,6MEAN821.927.32ADD1798.43.78ADD2817.122.54ADD794.60DOM1799.34.69DOM281924.37DOM796.72.14ADDINT7961.43ADDDOM802.17.46DOMINT803.48.7547优势比和归因危险通过计算优势比(OR)和归因危险(AtO评估相关性的量级；获得的重要相关性(表8)与部分I和II的CCREL试验结果一致。PLEKHA1/LOC387715区域的两个最重要的SNPs为SNPsrs4146894(PLEKHA1)和rsl0490924(LOC387715);由于这些SNPs间的LD非常高(D'=0.93)4吏得这两个试-验具有高相关性(见图6A)。染色体10区域第三个最重要的SNP(rsl045216)是PLEKHA1内的非-同义SNP,并与rs4146894(D，=97)和rs10490924(D，=0.91)间具备高LD。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>我们获得了与CFH基因中已经报道的相似的结果和相似的OR和AR值(表8)。三个最重要的SNPs是rsl061170(Y402H变体)，rs800292(CFH中)和rsl853883(与rsl061170具有强LD,D，=91)。PLEKHA1/LOC387715中观察到的相关性量级与CFH和ARM间观察到的相关性水平非常相似；两个位点都具有非常低p-#_的结果(p-值O.OOOl)。OR和AR值也非常相似，在CFH中显性OR为5.29%(95%CI3.35-8.35)而PLEKHA1/LOC387715中为5.03(95%CI3.2-7.91)，CFH和PLEKHA1/LOC387715的显性AR分别为68%和57%。亚-型分析我们评估:渗出性疾病对比于对照，和地理性萎缩对比于对照的伊O势比和归因危险性(表9)。优势比和对应的p-值产生与CCREL等位基因试验相似的发现(表5和6)。我们发现存在地理性萎缩或脉络膜新生血管膜时的优势比没有主要不同。表9ARM亚型分析的OR和AR。OR和AR如果相应的p-值(cl]i-方阵试验，使用10000重复模拟的p-值)小于0.001时以黑体和下划线显示，而小于0.05时以黑体显示。SNP.等位基因表示测定的SNP和危险等位基因(对照中的主要等位基因)。RR表示危险等位基因的纯合子，RN表示危险等位基因的杂合子而NN表示正常等位基因的纯合子。斜体显示的SNPs是局部分型SNPs。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>我们对ARM家族的交联研究已经确定鉴定了染色体lq31和染色体10q26位点，和其他几个附加位点。多重交耳关研究已经重复了该发现并采用了运用ARM家族和非相关受影响个体和对照的聚焦SNP分析。染色体lq31，我们基因确认了已经被其他人才艮道的与CFH相关的强相关性(见Conley等，(2005)),并第一次显示CHF上对于交联信号的关键SNPs。有趣的是，我们的最小GISTp-值(<0.001)在rsl853883上，其与Y402H变量具有0.91的高DM直，而非H没的"疾病-相关"Y402H变量。这提高了CFH基因中其他潜在的ARM-相关变量受关注的和与Y402H具有高LD的可能性。我们对染色体10q26的研究已经暗示了两个潜在的位点，一个非常强-暗示^f立点，包4舌三个高交联基因，PLEKHA1,LOC384415,和PRSSll,和较弱强度-暗示位点，包括两个基因，GRK5和RGS10(图1)。GIST分冲斤并不支持PRSS11为ARM-相关基因，但也不完全排除其为潜在的候选。PLEHKA1具有最低的GIST-来源的p-值而LOC387715带有的SNP具有最强的相关4言号和最高的优势比。LOC387715和PLEKHA1的SNPs间的高连锁不平衡性，使得可以清楚的从统计分析中区分这些基因。然而，PLEKHAl/LOC387715位点对ARM的影响的量级可与CFH位点中所观察到的进行比较。与最近科学(Edwards等，2005;Haines等2005;Klein等，2005)中的研究才目4以，我Cl已经在我们的疾病-控制人群中发现CFH等位基因(杂合或纯合的)的优势比为5.30R(CI:3.4-8.4)而人群归因危险性为68%。相同模式，当考虑杂合和纯合个体时PLEKHA1/LOC387715位点的高-危险等位基因的优势比为5.0(CI:3.2-7.9)而高-危险等4立基因为57%。3口Klein等(2005)的发5见，疾病4空制研究中测定的<尤势险性进4于过渡评估。关于染色体1上的补体因子H(CFH)，相关性H据对于单一基因是非常强制性的，甚至CFH也在相关基因区域内。在多重独立组发现的相关数据之外，还有包4舌CFH的其他生物#史据，包括ARM病人玻璃体沉积的单倍位点。这样，我们也必须考虑我们对染色体10q26研究中鉴定的潜在ARM-易感基因的生物相关性。如以上说明的，GIST分析强烈暗示了PLEKHA1,特别是当包括基因分析中附加的额外的非-同义SNP时。PLEKHA1(GenBank丽—001001974,NM—021622,NP—001001974和NP—067635;M歸07772;UniGeneHs.287830)编码蛋白TAPP1,其具有404氨基酸并带有磷脂酰肌醇3，4,5-三磷酸肌醇-结合才莫体(PPBM)和两个plectstrinhomology(PH)区域。最后3个C-末端氨基酸已经预测与MUPP1的一个或一个以上13PDZ区域(类似于PRSS11内的PDZ区域)相互作用。Dowler和同事(Dowler等，2000Identificationofpleckstrin—homology_domain—containingproteinswithnovelphosphoinositide-bindingspecificities.BiochemJ351:19—31.)已经显示完整的TAPP1和C-末端PH区域特异地通过磷脂酰肌醇3，4-二磷酸(Ptdlns(3，4)P2),而非4Pf可其他石岸酸月几醇起作用。TAPPl，其与TAPP2的前300个氨基酸具有58%的一致性，显示了比TAPP2乂于Ptdlns(3,4)高5-4咅的亲和力，并且可以通过在PPBM区域内(第二PH区域的一部分)将保守arg212突变成亮氨酸消除该亲和力。TAPPl(和其相关物，Bam32和TAPP2)的最好的定义角色是淋巴细胞激活者。当脂磷酸酯酶(SHIP)与PI3KS(石寿月旨酰月几醇3-;敫酶)一同、激活时Ptdlns(3,4)优先招募至细月包膜上。SHIP4吏PIP3去石粦卧炎^i形成Ptdlns(3,4)P2。SHIP是淋巴细胞活性的阴性调节物，这样TAPP1(和TAPP2)可以是重要的阴性调节物和促有丝分裂信号和PI3K信号通路的阴性调控物。这样，与ARM紧密联系炎症过程的假设一致，可以通过监控局部淋巴细月包活性预测PLEKHA1和其蛋白TAPPl在眼中的作用。然而，我们仍需要确定位点中其他两个候选基因，LOC387715和PRSS11的生物真实性。4艮少知道关于LOC387715(GenbankXM373477和XP373477;UniGeneHs.120359)的生物性，除了显示其受限于在胎盘中表达。我们对人视网膜RNA的反转录试3全-验证了PLEKHA1和PRSSll的表达，4旦在标准条件下我们没有在^L网膜中测定到LOC387715的表达，虽然我们确证其在胎盘RNA的表达(数据未显示)。然而，我们不能排除LOC387715以非常低的水平在视网膜或视网膜色素上皮细胞中表达的可能性，或在非-眼组织中表达的可能性，如树突状细胞或迁移巨噬细胞可以是ARM发病才几制的一个因素。PRSS11(GenBank丽002775和NP002766;MIM602194和UniGeneHs.501280)是哺乳动物HtrA(高温需求A)丝氨酸蛋白酶家族的一个基因，其具有高度保守的C-末端PDZ区域(Oka等,2004HtrAlserineproteaseinhibitssignalingmediatedbyTGFfbetafamilyproteins.Development131:1041—1053)。这些分泌蛋白酶由于其与在高温下存活需要的和低温分子伴估活性的细菌型相同源而被最初鉴定。ATP-不依赖的丝氨酸蛋白酶活性被认为可降低高温下蛋白错误折叠。哺乳动物形式，HtrAl，不同于HtrA2，已经显示被类型III胶原质alphalC半蛋白选择'f生刺激。(Murwantoko等，2004BindingofproteinstothePDZdomainregulatesproteolyticactivityofHtrAlserineprotease.BiochemJ381:895—904)。类型III月交原质是bruch膜上的主要成分(占全部胶原质的35-39%)并且在一见网膜微血管基底膜中存在。进一步的研究已经报道了HtrAl的普遍表达，但具有与TGF-beta蛋白显示调控作用的区域相一致的时间和空间4争异'性。(DeLuca等，2004PatternofexpressionofHtrAlduringmouse'development.JHistochemCytochem52:1609-1617.)Oka和同事(Oka等，2004HtrAlserineproteaseinibitssingalingmediatedbyTgfbetafamilyproteins.Development131:1041-1053.)已经显示HtrAl可以抑制许多TGF-beta家》矣蛋白的信号，包4舌Bmp4，Bmp2和TGF-betal,可能通过抑制HtrAl分子蛋白酶活性所需的受体活性。ARM相关性的潜在重要性的一个线索来源于Hollbom等(2004)的研究，体外hRPE细胞中细胞循环-和ECM-相关蛋白的mRNAs对细胞因子的才目反4乍用。CurrEyeRes28:215—223在体夕卜i式一验中发;见存在TGF-betal和TGF-beta2及胶原III和胶原IV转录水平提高时将减少人RPE细胞增殖。通常，胶原III的升高将激活HtrAl并导致TGF-betal的第二抑制效应。然而，如果丝氨酸蛋白酶活性减少(由于减少合成或非功能性突变)，则此调控途径将被石皮坏，导致RPE细"包增殖潜力的过度减少，可能导致RPE萎缩或导致ARM发展的进一步变化。随年龄增长观察到bmch，s膜中可溶性类型III胶原质的逐渐减少，部分说明了个体老龄化中HtrAl活'l"生的常规减少。PRSS11和PLEKHA1在S见网膜中都表达，中心和周边^L网膜的SAGE封泥(GEO表达数据)，表明中心黄斑中两个基因的高水平转录(PLEKHA1比PRSS11更多)。多重研究(GEO特征才艮道)已经显示在多种细月包类型中当暴露于特殊—验证因子时PLEKHA1的表达显著地减少。作为比4交正常和ARM病人中受氧化威力办的真皮纤维原细力包的樣么阵列表达分析的一部分，已经对PRSS11进行了研究。在本研究中，一半的ARM样本(9/18)比4壬4可正常才羊本具有更<氐的Htral表达水平。ARM病人的非-眼别，而并非眼中的作为结果的或退化的改变。一些证据支持GRK5/RGS10位点。我们的Sau多点曲线直接跨越GRK5，我们最大的单-点Sall=3.86(rs555938)仅距GRK5着丝点206kb。GRK5/RGS10CIDR数据的GIST分析的p-值是0.004和0.006,小于PLEKHA1中的SNPp—<直(0.005)。使用我们的局部-基因分型样本，0!^:5位点的GISTp-值是o.012,与CFH中发现的Y402H变体的p-值具有可比性(p=0.011)。然而，CCREL分析对于GRK5SNPs不是非常重要而优势比是最不重要的。基于生物学i正才居，GRK5(GenBankNM005308heNP005299;UniGeneHs.524625;MIM600870;和Ph讓GKBPA180)是可能的ARM候选基因，其具有调控趋化嗜中性应答的作用和与Toll4受体的交互(HaribabuandSnyderman1993IdentificationofadditionalmembersofhumanG—protein-coupledreceptorkinasemultigenefamily.ProcatlAcadSciUSA90:9398-9402;FanandMalik2003Toll-likereceptor-4(TLR4)signalingaugmentschemokine—inducedneutrophilmigrationbymodulatingcellsurraceexpressionofchemokinereceptors.NatMed9:315-321.),其已经包括于ARM中(Zareparsi等，2005bToll—likereceptor4variantD299Gisassociatedwithsusceptiilitytoage-relatedmaculardegeneration.HumMolgenet12:1449-55)。GRK5的视网膜或RPE表达并非是因果性的特定相关因素，由于其可能是迁移淋巴细胞和巨噬细胞中GRK5的表达和功能，而其在ARM病原免疫/炎症途径的作用中是至关重要的。最强的GIST结果发生在rs2039488，其实际上定位于GRK5和RGS10之间，在两个基因的3，端。GRK5基因上的一些其他SNPs也具有小GISTp-值，而RGS10SNP具有非-重要GISTp-值。然而，我们不能完全排除RGS10中具有与rs2039488强交联不平衡的SNP的可能性。RGS10(GenBankNM001005339,NM002925,NP001005339和NP002916;UniGeneHs.501200;和MIM602856)是G蛋白偶联受体家族的一个成员，其已经涉及化学趋化-接到的淋巴细胞oratz等，2004Regulationofchemokine-inducedlymphocytemigraitonbyTGSproteins.MethodsEnzymol389:15-32.)并且其在树突状细胞中的表达(其已经在ARM-相关玻璃体床鉴定)受Toll-类似信号途径的调控(Shi等，2004Toll-likereceptorsignalingalterstheexpressionforegulatorofGproteinsignalingproteinsindendriticcells:implicationforGprotein-coupledreceptorsignaling.JImmunol172:5175-5184)。AMD和对照主体氧化-压迫纤维原细胞微阵列研究中TGS10和GRK5的表达显示了样本中的次要波动，但在对照和受影响病例之间没有明显差别。这并不必要i也降^氐ARM中这些基因的潜力，因为真皮纤维原细胞缺少具有TGS10-和/或GTK5-相关蛋白调控性的细胞群。我们已经关注于PLEKHA1/LOC387715内的高-危等^f立基因和染色体1上CFH的GRK5/RGS104立点间的潜在交互'f"生。这可能是第一个使用GIST测定这些交互性的报道，我们没有发现染色体10上的SNP数据可以占据染色体1的NPL数据的证据。相反，我们发现染色体10的NPL数据和CFH等位基因的SNP凄t:悟间没有相关性。Logistic回归分4斤也没有鉴定交互性，并显示简单的附加危险模型是最简单的。我们已经进行了一些最初的logistic分析，包括暴露于p及烟。由于先前对于吸烟和补体因子H生物性的关系的建议(Esparza-gordillo等，2004GeneticandenvironmentalfactorsinfluencingthehumanfactorHplasmalevel.Immunogenetics56:77-82.)及我们先前研咒发现吸烟和染色体10q26位点关系(Weeks等，2004),而进行了这些分析。从数据中，我们没有发现西亚和CFH或PLEKHA1/LOC387715位点间的联系，但我们仍研究了GRK5/RGS10位点的可能的交互性和不同模型策略。我们也测定了具有染色体1和10上SNPs的ARM亚型的相关性(表9)。我们发现存在地理性萎缩或脉络膜新生血管膜时优势比没有主要的差异，显示这些ARM位点可造成引发疾病任一末端阶段形式的通常病理途径。这并不4非除其作为其他的，如未描述的，i也理性萎缩或CNV发展的确定的特定危险性的遗传位点的可能性。概要的，这些SNP-基础的交联和相关性研究显示这些方法在鉴定病因等位基因和潜在ARM易感性基因的能力和限制性。这些遗传研究让我们确定造成疾病的基因和其变体，无论其是否为组织-特异表达的通过高密度SNP基因分型，从数百个初始GRK5和PLEKHA1中，我们已经缩减了染色体10q26发现的交联峰中的候选基因，但我们不能完全排除RGS10和/或PRSS11和LOC387715作用的可能性。对GRK5基因内的非-同义3，SNPs的附加基因分型可以帮助进一步区别GRK5和RGSIO，但其未建立因果性的确定形式。其他研究的重复(如CFH情况)可以关注于单一基因，《旦仍具有明显的可能性，即我们不能从相关性研究中获得进一步决定，或不能清楚地确定在染色体10q26上是否有超过2个ARM易感基因。然而，分子生物学家可以研究小鼠ARM模型中每一个候选基因的潜在作用并定4立疾病病理的因果作用。实施例2-实施例1的调查本实施例才是供了支持和确定实施例1提供的结论和发现的附加凄t据，其中PLEKHA1内的等位基因变体和4叚定LOC387715基因被定义为年龄-相关黄斑变性的危险因素。ARM的病因学是复杂的，环境和遗传易感性都起作用。相关性-基础的分析通常比交联-基础分析对于小遗传效应更壽丈感，并对于疾病-相关基因的作图更具价值性。(Cordell等(2005)GeneticassociationstudiesLancet.366，1121-1131.)使用非相关个体的疾病-乂于照相关性研究比家族-基础的研究具有优势，特别是预期使用多重定位遗传模型(Howson等，(2005)Comparisonofpopulationandfamily-basedmethodsforgeneticassociationanalysisinthepresenseofinteractingloci.Genetepidemiol.29,51-67.Risch等(2001)Implicationsofirmltilocusingeritanceofrgene-diseaseassociationstudies.TheorPopulBil.60，215-220.)，然而这些研究只于于疾病和对照群的研究策略具有潜在的4文感性。由于此原因，在人群中用不同的研究计划评估候选基因是有价值的。本实施例研究了补体因子H(CFH)基因，延伸长链脂肪酸-类似4(ELOVL4)基因，PLEKHAl基因，和两个区分队列中的假设LOC387715基因。CFH基因与ARM易感性的相关性已经在欧美血统才羊本中建立(Edwards等，(2005)，Haines等，(2005),klein等，(2005),Hageman等，(2005)，Conley等，(2005),Zareparsi等，(2005)以及来源于英国的样本-Sepp，T.等(2006)。补体因子H变体Y402H是吸烟者和非吸烟者中地理性萎缩和脉络膜新生血管的主要危险4员害物。InvestOphthalmolVisSci.47，536—540，Germany-Rivera等(2005)假设的LOC387715是年龄-相关黄斑64变性的第二主要易感基因，对疾病危险非依赖性地提供补体因子H。HumMolGenet.14，3227-3236,France-Souied等(2005)法国人群中与渗出性年龄-相关黄斑变性相关的Y402H补体因子H多态'〖生。MolVis.1,1135-1140，Iceland-Magmisson等(2006)CFHY402H确证了软玻璃疵和两种严重形式AMD相似的危险。PloSmed.3,e5.和日本—Okamoto等(2006)日本人群中年龄-相关黄j汪变性谇卜体因子H多态性。Movis.12,156-158.三项研究支持了染色体10q26上的PLEKHA1/LOC387715位点(Rivera等(2005),JakobsdottirJr.等(2005)和Schmidt等(2006)吸烟强,!U也文变LOC387715牙口年龄一才目关黄J汪变寸生对目关l生。AmJHumGenet.78，852—864。Jakobsdottir等的研究。(2005)染色体10q26上年龄-相关黄斑病变易感基因。AmJHumGenet.77,389-407报道PLEKHA1/LOC387715位点与ARM状况重要相关，然而研究中使用的非依赖家族-基础的和疾病-对照人群的PLEKHA1和LOC387715间强i介廉不平衡意p未一个基因跨越另一个基因时将无法测定(Jakobsdottir,等，(2005))。自从Jakobsdottir等发表，假设LOC387715基因更类似于ARM易感基因的证据已经由Rivera等发表(2005)，其运用两个非依赖的疾病-对照样本(Rivera等，(2005))和Schmidt等运用家族基础和疾病-对照的研究。所有三个研究表明染色体10q26上区i或与ARMj青况的相关'l"生不依赖于CFH的牙目关寸生，其先前在所有三个人群中已经报道(Haines等(2005，Conley等，(2005),Rivera等，(2005))。t匕夕卜，基于Schmidt等由々研究，显示LOC387715位点的效果可以.净皮吸烟历史改变，Schmidt等(2006)。两项研究已经评估了ELOVL4在人类ARM中的潜在作用。Ayyagari等，(2001)评估年龄-相关黄斑变性病人的ELOVL4基因。OpthalmicGenet.22，233—239;平估了该基因并发现在4也们的零星疾病-对照分析中与ARM状况没有重要联系。然而，Conley等发现在我们的家族和零星疾病-对照分析中ELOVL4与ARM状况具有重要联系.Conley等(2005)。这些研究之间的差异可能涉及每个人群中渗出性ARM疾病的特征，因为Conley等发现ELOVL4与渗出性亚型特异相关。这些结果表明需要附加研究以建立或反马爻ELOVL4和ARM间的关系。本研究中釆用的两个队列是心血管健康研究(CHS),—种不将ARM状况作用研究因素的65岁以上人群-基础队列，Fried等(1991)。心血管健康研究设计和基本原理。AnnEpidemiol.l，263-276和年龄-相关眼病研究(AREDS)，在抗-氧化和4争干涉随才几受控临床试-睑的55至80岁个体队列，其中ARM状况作为研究的因素。年龄-相关眼病研究探索组(1999)。年龄-相关眼病研究(AREDS):i殳计-说明。AREDS才艮道第一号。控制临床试验。20,573-600。这些队列已经在先前被描述(Klein，R,等(2003)心血健康研究中早期年龄-相关黄斑病变。Ophthalmology。110,25-33和年龄-相关眼病研究探索组(2000)年龄-相关黄斑变性的危险因子。年龄-相关眼病研究中的疾病-对照研究年龄-相关眼病研究报道号3。Ophthalmology。107,2224-2232)。本研究i殳i十在两个3虫立的队列中以与ARM4犬况不同的研究策略评估CFH.ELOVL4，PLEKHA1，和LOC387715基因，并将发现整合入meta-分析。不考虑研究计划的ARM易感基因的相关性将进一步提高相关性为真实的证据，并提高基因的评估将在危险个体中被真实定义的可能性。缩写ARM-年龄-相关黄斑变性；GA-地理性萎缩；CNV=脉络膜新生血管膜；OR-优势比；PAR-人群归因危险度；ORd。m=显性效应优势比；ORrec=隐性效应优势比；ORhet-危险等位基因杂合体优势比；ORh。m=危险等位基因纯合体优势比。材#+和方法心血管健康研究(CHS)参与者-取样和显形CHS是对于65岁及更年长者i殳计的鉴定心血管疾病相关因子的人群-基础的，纵向研究。对进了了18年评估的队列中的造访和幸存者在第8年进行视网膜研究。在NC的Forsyth县；CASacramento县；MDWashington县；和PAPittsburgh进行社区-基础的召集。健康护理基金管理的医疗保险合格表^皮用于鉴定65岁和更年长者的个人。列表成员家族中65岁或更年长者也是适合的。入选标准为最小化并包括非-制度化，除了保留至少三年，可以给予信息赞同，无轮椅-限制，未接受收容所照顾，未4妄受肺瘤》丈疗或4匕疗。Fried等(1991)。CHS的DNA样本孚皮用于本研究。CHS主体4壬选眼睛S见网膜被拍照并经Dr.Gorin用前述相同分级模型进行分级，Weeks等(2004)年龄-相关黄斑变性lq31,10q26,和17q25区域内的易感基因连续证据基因组扫描。AmJJumGenet.75,174-189。分析^又包括高加索个体，其他ARM组的样本大小对于研究结果太小182例黑人对照但仅有3个病例，及其他种族的5个对照。所有用于分析的CHS病例(n=126)为，，类型A，,，其被进行临床分级最高标准模型Weeks等，(2004)。基于广泛的和/或结合3皮璃疣，色素改变(包4舌色素上皮细胞分离)，和/或末-阶^殳疾病的出现〔地理性萎缩(GA)和/或脉络膜新生血管(CNV)膜〕，本类的个体清楚地受ARM影响。非常少的CHS病例具有末阶段ARM，GA或CNV(表10);所以没有进4亍ARM特定亚型的分析。所有CHS对照(n-1，051)为AREDS级别1。少数潜在对照(n=22)具有不清楚的GA或CNV信号并从分析中排除。表10研究人群的特征。AREDS队列中平均年龄和表型分级基于最后一次眼底拍照的年龄。圆挂号内的数字表明根据AREDS分级方法的疾病严重度。CHS队列中平均年龄基于访问基线年龄，但视网膜评估在访问的第8年进行。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>年龄-相关眼病研究(AREDS)参与者-取J羊和显形AREDS是ARM的自然史和高剂量维生素和晶状体植入临床研究年龄-相关白内障的预期，多中心研究。AREDS研究中召集的男女个体注册年龄为55至80岁；这些个体要求不带有任何影响长期追踪的情况或疾病。入选标准为最小化并包括具有可进行眼底拍照的足够清晰的眼睛介质，并在任一眼没有ARM证据或一只眼具有ARM而另一只保持良好(20/30或更好)(年龄-相关眼病研究4果索组1999)。NEI-AREDS基因库的DNA样本被用于本研究。使用AREDS年龄-相关黄斑变性分级系统和基于最近造访的表型分级对ARM阶段进行分级。再一次，本分析中仅包括高加索个体，其他j羊组的才羊本大小对于研究结果而言太小仅有15个非洲美国人，2个西班牙人和3其他种族个体。AREDS病例(n=701)分纟且为级另'J3,4和5。级另'J3的AREDS主体(n=96)具有ARM^f旦并未患有末-阶,殳ARM,级别4的主体(n=266)—只眼患有末-阶#殳ARM而级别5主体(n=339)两眼都患有末-阶段ARM。AREDS对照(n=175)具有AREDS级别1(级别2个体在分析前一皮排除)。基因分型使用RFLP4支术对ELOVL4中的变体M299V(rs3812153)，CFH中的变体Y402H(rsl061170)和LOC387715内的变体S69A(rs10490924)进行基因分型。每个方法的引物，退火温度和限制性内切酶为ELOVL4为5，-AGATGCCGATGTTGTTAAAAG-3，(F,SEQIDNO:13),5，-CATCTGGGTATGGTATTAAC一3,(R,SEQIDNO:14),50。C和BspHI;CFH为5，-TCTTTTTGTGCAAACCTTTGTTAG-3，(F,SEQINNO:15)，5，一CCATTGGTAAAACAAGGTGACA-3，(R,SEQIDNO:16)，52。C和NlaIII;LOC387715为5，—GCACCTTTGTCACCACATTA-3，(F,SEQIDNO:17)，5，-GCCTGATCATCTGCATTTCT-3,(R,SEQIDNO:18)，54。C和PvuI1。使用5,夕卜切核酸酵Assay-on-DemandTaqMan方法(AppliedBiosystems公司)对PLEKHA1内的A320T变体(rs1045216)进行基因分型。使用ABI7000和SDS2.0软件(AppliedBiosystems公司)进行扩增和基因分型研究。对于本研究中进行的所有基因分型，每个变体都采用双-盲基因分型，使用原始数据或通过重-基因分型进行比專交和每个差异定位。相关性分析用等位基因-和基因分型chi-平方试验测定SNP-疾病相关性，4吏用100000重复才莫拟p-^直；当一种或一种以上期望细胞数少于5个时，使用Fisher's精确试-验。通过粗优势比(OR)和人群归因危险度(PAR)评估相关性强度。通常公式被用于计算PAR:PAR=Pr(OR-1)/(1+Pr(OR-1)),其中Pr是通常人群中危险因子的流行。Pr的评估来源于CHS对照；这是可能的，因为CHS主体不是以ARM疾病阶段为基础挑选的，并且CHS对照的凄t量巨大(n=1051)。处于比4交目的，评估年龄和性别的调整优势比(ORadj)。Logistic回归才莫型用于计算自然和调整的优势比，使用R(38)。对照组中最少频率等位基因^^认为是危险等位基因，将这些纯合子的危险等位基因(RR)和基线组(正常等位基因〔NN〕纯合子)比较，并将杂合子危险等位基因(RN)与基线组比较，计算OR和ORadj。显性(RR和RN对于于NN)和隐性(RR对比于RN和NN)的对比被评估。71PLEKHAl和LOC387715间的区别我们使用了单模标本方法(Valdes,A.M和Thomson,G(1997)Detectingdesease—predisposingvariant:thehaplotypemethod.AmJHumGenet.60,703-716)鉴定两个位点中的哪一个，PLEKHAl中的A320T或LOC387715中的S69A,^艮可能为10q26区i或内的实际疾病i秀病变体。单才莫标本的基础是简单和上乘的(对于数学研究，见Valdes和thomson(1997))。如果所有诱病变体都包括在单模标本内，那么特定的疾病-诱病单模标本中的中立变体在病例和乂t照中以相同比例出现，虽然实际频率可能不同。另一方面，3cT果所有i秀病变体都净皮鉴定，非-i秀病变体单模标本频率的相等率是不期望的。A320T-S69A单才莫标本的期望比例见以下表述，假设一个变体是ARM-诱病的而其他是中立变体。我们4i设A320T和S69A是染色体10q26PLEKHAl-LOC387715单才莫标本区域的ARM-诱病变体。四个可能的A320T-S69A为G-G,A_G,G-T,A-T.如果A320T是因果位点而S69A是中立位点，我们表示为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>但是如果S69A是因果位点而A320T是中立位点，我们表示为对照-r)]l尸"对照病例病例(2a)(2b)其中f表示对照或病例中特定单冲莫标本的频率。对所期望的^1设为Hqp:PLEKHA1中的A329T变体对于PLEKHA1-LOC387715单才莫标本区域完全导致ARM易感。H。l:PLEKHA1中的S69A变体对于PLEKHA1—LOC387715单才莫标本区域完全导致ARM易感。PLEKHA1-LOC387715单才莫标本区域马1回这些^^殳表明试-睑的变体不足以单独导致PLEKHA1-LOC387715单才莫标本区域的ARM易感。四个2x2偶然事件表可以源于7^式la，lb,2a,口2b:表la未暴露的暴露的表lb未暴露的暴露的对照病例/(G-G)/(G-G)/(G-T)对照病例/(A-G)/(A-G)/(A-T)/(A-T)表.2a未暴露的暴露的表2b未暴露的暴露的对照病例/(G-G)/(G-G)/(A-G)/(A-G)对照病例/(G-T)/(G-T)/(A-T)Hop时我们在偶然事件表la和lb寻找同质性，HoL时我们在偶然事件表2c和2d寻找同质性。从每个偶然事件表可以计算调整的chi-平方统计以产生耳关合统计。对于Hop统计是源于7^式la和lb的最大chi-平方。对于HoL统计是源于^仝式2a和2b的最大chi-平方。然而，由于来源于每《且偶然事件表的统计的依赖性，联合统计的分布还不清楚。独立性的缺失来自于(1)诱病位点多种等位基因的测定，和(2)-秀病和非-诱病位点的连锁不平衡性。这两种情况是必然的，(1)因为变体通常具有超过一个等位基因，并且(2)因为，如果变体是完全连锁平衡，则不需要区分他们的依赖相关信号。作为数据中依赖性的结果，需要随后进行诱病位点等位基因置换试验(无效假设)。我们根据诱病位点等位基因将单模标本分组(每两个人)。然后病例-对照标签在每个组中顺序改变并对每个重复对计算联合统计。该置换过程类似于LiH提出的方法(2001)(Apermutationprocedureforthehaplotypemehtodforindentificationofdesease-predisposingvariants.AnnHumGenet.65:189-196)。定相基因分型是不可用的，单才莫标本必须进行非单模标本基因分型。单模标本频率在对照和病例中分别评估。程序SNPHAP(39)用于每个主体中单才莫标本频率和定相单模标本。SNPHAP使用EM运算法则计算非定相基因分型数据中最大相似的评估单才莫标本频率。个体单模标本分配的后期可能性超过A320T和S69A每个单模标本的94%。表11给出了评估的单模标本频率。表11PLEKHA1中A320T和LOC387715中S69A单模标本频率(SNPHAP程序评估)。给出了源于AREDS和CHS队列的评估。A320T-S69A单模标本AREDSCHS对照病例对照病例G-G0.39280.28020.39090.3188G-T0.17900.41490.19240.3294A_G0.41860.27920.38940.3337A-T0.00960.02570.02720.0180交互性分析交互性分析分三步第一，我们测试CHS和AREDS才羊本中CFH内Y402H和LOC387715内S69A的交互遗传戋文应，然后我75们测试CHS和AREDS样本中具有吸烟史的Y402H和S69A的交互性，最后我们计算三个危险因子中的联合ORs。我们使用了North等l是供的模型策略(North,B.V.，Curtis，D.andsham,P.C.(2005)Applicationoflogisticregressiontocase-contolassociationstudiesinvolvingtowcausativeloci.HumHered.59,79—87)。一系歹'JLogistic回归才莫型^式用于AREDS和CHS数据组以发现最佳描述CFH和LOC387715联合效应的模型。对于每个基因分型，可进行附加效应的模型(ADDl,ADD2和ADD-BOTH)，和整合显性效应的才莫型(DOM1,DOM2和DOM-BOTH)是适合的。ADDl才莫型^f又包4舌CFH的附加效应的条件x,，Y402H基因分型TT编码为-1,基因分型CT为0，基因分型CC为1。ADD2才莫型仅包括LOC387715的附加效应的条件X2，S69A的基因型GG编码为-1,基因型GT为0,基因型TT为1。ADD-BOTH才莫拟了CFH和LOC387715的联合附加效应。DOM1整合了ADDl的显性效应，并包括x,和z,，Y402H上的CT基因型编码为0.5,TT和CC基因型为-0.5。DOM2才莫型相识的整合ADD2的显性效应，并包括X2和z2，S69A上的基因分型GT编码为0.5,基因分型GG和TT为-0.5。DOM-BOTH模拟了CFH和LOC387715的联合显性效应。模拟CFH和LOC387715间交互性的三个进一步的模型是适合的ADD-INT包括了产物条件x,X2，ADD-DOM包括x,X2，x，*z2和Z,X2，DOM_INT包括X^X2，Xi*Z2，Zi*X2，和z!*z2。以上模型策略经修饰以研究CFH和吸烟的联合效应，及LOC387715和吸烟的联合效应。修饰方法与Schmidt等(2006)使用的才目同，以测i式LOC387715禾口吸烟间的交互'l"生。编石马i殳计与上述相同，除了/人不吸烟者编码为0而永远吸烟者为1。适合于CFH和吸义因的才莫型为ADD1,SMOKE，ADD1-SMOKE,DOMl，ADD1-SMOKE-INT，和DOM1-SMOKE-INT，而适合于LOC387715和吸烟的才莫型为ADD2，SMOKE,ADD2-SMOKE,DOM2,ADD2-SMOKE-INT，和DOM2-SMOKE-INT。所有才莫型通过Akaike，s信息标准(AIC)进行比较。AIC差别<2的模型被认为是无差别的(North,B.V.，Curtis，D.和Sham,P.C.(2005)Applicationoflogisticregressiontocase-controlassociationstudiesinvolvingtwocausativeloci.HumHered.59,79-87),并且带有更少参数的模型被选为简单的模型。因为年龄和性别的调整不影响对Y2402H或S69A的ORs的评估(表12和13)，并为了保留尽可能少的参数，所以当模型交互作用是对这些协变量不进^f调整。基于上述的交互分析结果，计算联合ORs。表12评估原始ORs,对应于95。/。CIs,和PARs,未调整年龄和性别<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>注意N表示正常等位基因而R表示危险等位基因。位点等位基因定义为对照中最少频率的等位基因。显性效应的OR比较了带有一个危险等位基因(RN和RR基因分型)的个体和正常等位基因纯合子个体(NN)。隐性效应的OR比较了带有RR基因分型的个体和带有一个正常等位基因的个体(NN和RN基因分型)。杂合-和纯合0Rs比校了带有一个UN)和两个(RR)危险等位基因的个体与带有NN基因分型个体。GA-地理性萎缩。CNV=脉络膜新生血管膜APOE分析先前的研究已经才艮道了阿朴脂蛋白E(APOE)基因在ARM中的4呆护和有害效应。等位基因可能具有保护效应(Klaver,C.C等(1998)GeneticassociationofapolipoproteinEwithage—relatedmaculardegeneration.AmJHumGenet.63,200—206;Schmidt,S等(2000)associationoftheapolipoproteinEgenewithage-relatedmaculardegeneration:possibleeffectmodiflcationbyfamilyhistory,age,andgender.MolVis.6,287-293;Schmidt,S等(2002)Apooledcase-controlstudeyoftheapolipoproteinE(APOE)geneinage—relatedmaculopathy.OphthalmicGenet.23,209-223;Baird,RN.等(2004)Theepsilon2andepsilon4allelesoftheapolipoproteingeneareassociatedwithage-relatedmaculardegeneration.InvestOphthalmolVisSci.45,1311—1315andZareparsi,S,等(2004)AssociationofapolipoproeinnEalleleswithsusceptibilitytoage-relatedmaculardegenerationinalargecohortfromasinglecenter.InvestOphthalmolVisSci.45,1306-1310)，而最j氐频率的等位基因，s2,可能增加ARM的危险(Klaver,C.C等(1998)和Zareparsi,S等(2004)。APOE变体通过CHS基因分型，并且其与ARM的相关性在本研究中被评估。个体通过APOE基因分型划分为APOE-s3/s3基因分型，和APOE-s2和APOE-s4携带者(分别表示为APOE-￡2/*和APOE-￡4/*);带有APOE-s2/s4基周分型的个体都包括在APOE-￡2/*和APOE-￡4/*组中。Chi-平方试-睑用于测试对照和病例的基因分型中，APOE-s3/e3和APOE—￡2/*,及APOE—s3/s3和APOE-￡4/*分布的差异。Meta-分析我们进行了meta-分析方法从先前发表的CFH和LOC387715的报道和这里表述的两个报道来汇集评估OR。分析最初数据，假设关系-研究变化是随机引起的，并且使用混合-效应模型。在混合-效应模型中，汇集OR的最大相似评估值是个体评估值的平均数，由其变量的反转加权，汇集OR的变量通过个体重量总和反转进4亍评估。以R进行纯合子的Meta-分析(RdevelopmentCoreTeam(2005)R:Alanguageandenvironmentforstatisticalcomputing.RFoundationforstatisticalComputing,Vienna，Austria)。纯合的假i殳由chi-平方试验鉴定。然而，纯合子的试-验显得缺少力度，因此，为了比较，我们也在随机效果组汇集OR。使用限制性最大相似性(REML)方法进行杂合子的Meta—分4斤，力口SASProcMixed戶斤进4亍的(SASsoftwarerelease8.2[SASInstituteInc.,Cary,NC，USA])。汇集的RELM评估值与DerSimonian-Laird评估值一致(Dersimonian，R.和Laird,N.(1986)Meta—analysisinclinicaltrials.ControlClinTrials.7,177-188和vanHouwelingen,H.C.,Aernds，L.R.和Stijnen,T.(2002)Advancedmethodsinmeta-analysis:multivariateapproachandmeta=regression.StatMed.21，589-624)。VanHouwelingen等的SAS编码经^修饰以进行杂合子分析。CFH中的Y402H变体已经在11项研究中发王见与ARM强烈相关(Edwards,A.O.等(2005)ComplementfactorHpolymorphismandage-relatedmaculardegeneration.■Science.308，421-424;Haines,J丄.等(2005)ComplementfactorHvariantincreasestheriskofage-relatedmaculardegeneration.Science.308,419-421;Klein,R丄等(2005)ComplementfactorHpolymorphisminage—relatedmaculardegeneration.Science.308,385-389;Hageman,GS.等(2005)AcommonhaplotypeinthecomplementregulatorygenefactorH(HFl/CFH)predisposesindividualstoage—relatedmaculardegeneration.ProcNatlAcadSciUSA;Conley,Y.R等(2005)Candidategeneanalysissuggestsaroleforfattyacidbiosynthesisandregulationofthecomplementsystemintheetiologyofage-relatedmaculopathy.HumMolGenet.14,1991-2002;Zareparsi,S.等(2005)StrongassociationoftheY402HvariantincomplementfactorHatlq32withsuscptibilitytoage-relatedmaculardegeneration.AmJHumGenet.77，149-153;Sepp,T.等(2006)ComplementfactorHvariantY402Hisamajorriskdeterminantforgeographicatrophyandchoroidalneovacularizationinsmokersandnonsmokers.InvestOphthalmolVisSci.47,536—540;Rivera,A.等(2005)HypotheticalLOC387715isascondmajorsusceptibilitygeneforage—relatedmaculardegeneration，contributinginependentlyofcomplementfactorHtodiseaserisk.HumolGenet.14，3227-3236;Souied,E.H.等(2005)Y402HcomplementfactorHpolymorphismassociatedwithexudativeage-relatedmaculardegenerationintheFrenchpopulation.MolVis.ll,1135-1140;Mag画son，K.P.等(2006)CFHY402HconferssimilarriskofsoftdrusnandbothformsofadvancedAMD.PLOSMed.3，e5andJakobsdottir,J,等(2005)Suscepibilitygenesforage-relatedmaculopathyonchromosome10q26.AmJHumGenet.77,389—407);11项研究中的2项是我们的，所以仅仅4吏用源于Jakobsdotir等(2005)文章的结果，其凭所有比对，进行meta-分析。Klein等(2005)研究使用一'卜组AREDS样本，Magnusson等(2006)的文章4又仅报道了基于ORs的等位基因并且无基因分型价值。因此不包4舌这两个研究。Haines等(2005)的结果研究包括了汇集的纯合-和杂合子ORs;基因分型价值不可用于评估对照的显性和隐性效应。三个研究已经报道单模标本LOC387715高相关变体，S69A，(Rivera,A.等(2005);Jakobsdottir,等(2005);Schmidt等(2006)和Schmidt(2006)吸烟强烈地影响LOC387715和年龄—相关黄扭王病变的耳关系。AmJHumGenet。递交)。所85有三个LOC387715的报道包括于meta-分析中。所有CFH和LOC387715研究参与者都为非-西班牙欧洲和欧美后裔白人。表14和15描述了分别包括CFH和LOC387715meta-分析的研究。表14CFH中Y402Hmeta-分析研究特征^Tf^平均年龄研究和样本大小&f±SD)b%男性尸-值C等位基因频率Edwards等"1研究样本对照病例重复样本对照病例Haines等。对照病例Zareparsi等对照.病例Hageman等f样本对照病例Iowa样本对照病例Jakobsdo他等对照病例Rivera等g悴本移、列样本昭'"例1312255917018549527561627254913110843461179333537367.6(7.6)72.7(10,1)68.1(9.0)78.2(7.9)2:55S:6868.8(8.6)71.3(8.9)78.4(7.4)79.5(7.8)72.6(8.9)68.9(8.8)76.2(5.3)76.3(6.9)68.3(8.1)75.0(7.5)425835654739383645350.990.420.280.640.110.150.230,860.700.220.260.42<0.010.300.480.130.3400.5530.3900.5440.3380劍0.3440.5380.3360.5890.3100.6130.38205950.3580.617常*病i对病通重样本平均年龄jjy^ce，^i^目研究和样本大小af±SD)b%男性i3-值频率a基于全部基因分型人群数量的样本大小，其中基因分型数量对于全部样本大小是可用的，不包括遗失的数据。b平均年龄和对应的标准偏差，或其他源自常规文献的概括统计。c当基因分型数量可用时，给出了源自exct试验(用RGeneticspackage执行)的p-值。dEdwards等文章的两组数据在meta-分析中合并，合并的对照和病例HWEp-^f直分别为0.53和0.36。eHaines等文章的结果包括在杂合-和纯合子个体的Orsmeta-分析中。样本大小基于全部个体数量，不包括CFH中Y402H的遗失基因分型数据。87Souied等对照病例Sepp等对照病例AREDS(1vs,345)对照病例CHS对照病例74.6(6.3)74.3(8.0)42380.210.300.3020.56475.8(7.8)80.3(6.9)42450.140490.3630.60776.5(4.4)79.5(5.2)49420.250,030.3580.61270.3(3.9)73.2(4.S)43440.550.710.3270.4951123397<ui946479o1f随常规文献之后，不包4舌Hageman等文章的两组数据。gRivera等文章的两组婆t」悟在meta-分才斤中合并，合并的对照和病例HWEP-值分另'J为0.03和0.09。表15LOC387715中S69A的meta-分析研究特征样本平均年龄HWECT等位基因研究和样本大小4(土SDV1免男性P-值频率a基于全部基因分型人群数量的样本大小，其中基因分型数量对于全部样本大小是可用的，不包括遗失的数据。b平均年龄和对应的标准偏差，或其他源自常规文献的纟既括统计。88Jakobsdottir等对照病例Rivera等d样本照例样本照、问Schmidt等。对照病例AREDS(1vs.345)对照病例CHS对照病例106456594759328361186758172柳995〗2072.6(8.9)68.9(8.8)76.2(5.3)76,3(6.9)68,3(8.1)75'0(7.5)66.7(8.1)76.8(7.7)76.5(4.4)79，5(5.2)70.3(3,9)73,2(4.8)47(K210.193390.060.485380.300,196360.140.417450.750二15350.010.460430.550.24735<0.0]0.427490.450.189420.990.44]43440,410，240.2200.354常对病复对病通重c当基因分型数量可用时，给出了源自exct试-验(用RGeneticspackage执行)的p-值。dRivera等文章的两纽Jt才居在meta-分才斤中合并，合并的对照和病例HWEp—^直分另ij为0.31和0.01。emeta-分析中仅级别1的主体分类为对照(级别2的主体净皮抛弃)。在Schmidt等的通常研究中级别2的个体为对照。对照的平均年龄和男性％来源于文献并基于级別1和2。结果为进一步评估ARM中的CFH，ELOVL4,PLEKHA1,和LOC387715,我们从AREDS和CHS研究中对四个基因的先前寺艮道SNPs进行基因分型。在AREDS研究中使用全部701非西班牙白人ARM病人和175AREDS研究对照，在CHS研究中l吏用全部126非西班牙白人ARM病人he1051对照，对每个凄t据组进行分别分析(见，表10样本大小和其他数据特征，及表16基因分型频率)。主体最后随i方时的疾病阶IS:是评估AREDS项目的初始终点。AREDS主体包括级别1的对照和单眼或双眼发生中度ARM和重度ARM的病例(级别3-5)。为保持一致性，ARM疾病阶段由一位专家，在8-年随访中，使用单眼的，非扩瞳眼底拍照评估。主要CHS病例具有中度ARM，包括带有或不带有色素上皮细月包改变的多重^皮璃疣(等同于AREDS级别3),一,J、部分病例具有地理性萎缩(GA)或力永络膜新生血管膜(CNV)及除去带有严重黄斑外^皮璃疣病例的AREDS级别1对照。表16AREDS和CHS队列中ARM阶段基因分型分布。显示了国际HapMap项目的CEU人群(《光他州的北欧和西欧家族居民)；平估1直比^介。AREDS病例为级别3-5而AREDS对照为级别1。表17中每个级别和亚型的基因分型数量是可用的。这里提供了HapMapCEU人群的描述。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>表17ARM阶段，AREDS和CHS对照中基因分型分布_AREDS__CHS对照病例(n-701)级别4(n=266)级别5(n=339)基因(变体)级别l级别2*级別3仅仅对照病例和基因分型(n-175)(n=63)(n=96)所有GACNV所有GACNV(n=1051)(n=126)C冊(Y402H)~"TT75192146132752122540629CT7235391182172147405240853CC26936101254913936529328AU17363962655914833888129907110fiLOVW(M299V)AA118557520447115249709782692AG43"71750103065142317931GG01623920251Al166629326059148323861201030124(A320T)GG5724421112565169347335551AG7831451142561434648957AA33"7634721176618316All168629325957147328831251027124(S69A)GG1U4035105225977302660153GT5719441263174171447035149TT4315316148913334318ADm62942625914733787129995120注意-基因分型排序NN-RN-RR，其中N是正常等位基因而R是危险等位基因。危险等位基因定义为对照中最少频率的等位基因。GA4也理性萎缩。CNV=脉络膜新生血管膜。a级别2AREDS主体未包括在分析中。相关性分析每个基因，CFH,ELOVL4,PLEKHA1和LOC387715,与ARM的相关性通过chi-平方统计评估。每个基因的效应级别通过优势比(ORs)和人群归因危险性(PARs)评估。为评估与早期和严重ARM最相关的基因，使用AREDS数据分布对每个级别和亚型(GA和CNV)计算ORs。91CFH:AREDS和CHS队列中，CFH中Y402H变体与ARM具有重要相关性(P^O.OOOOl)(表18)，由我们早期的发现验证(Conley等(2005)和Jakobsdottir等(2005))和其他(Edwards等(2005;Haines等(2006);Klein等(2005)和Rivera等(2005))。CFH中Y402H的ORs评估表明变体对于ARM所有阶段，和严重的ARM,GA和CNV形式具有相似危险性(图7和表12)。表18等位基因和基因分型相关性试验结果。P-值<0.05为黑体。aFisher，sexact试验的2-边p-值。b双眼具有GA的ARM病例。c双眼具有CNV的ARM病例。<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>带有两个高危险ARMC等位基因与带有一个C等位基因相比，具显示存在等位基因-剂量效益(表12和图8)。尽管带有2个C等位基因具有更高的危险性，但由于通常人群中CT基因型比CC基因型具有更高频率，故人群归因危险性(PAR)与两个危险等位基因相似。源于CHS数据组的评估PAR显示CT和CC记一行分别解释了非-西班牙白人中27%和25%的ARM。ELOVL4:ELOVL4中M299V变体与AREDS才羊本中;参出性ARM重要相关(P=0.034)(表18),与我们先前的发现一致(Conley,Y.P等(2005))。然而，没有ORs在95%重要水平具有统计学重要性(图7和9和表12)。这些结果不排除ELOVL4在ARM中的潜在作用，但也不对其强烈支持。较少数量的渗出性ARM个体不支持CHS队列中的亚型分牙斤。PLEKHA1和LOC387715:在AREDS和CHS数据组中LOC387715的S69A变体与ARM存在的具有重要牙目关'〖生(P^O.00001)(表18),确i正了我力']早期的发it见(Conley,Y.P等(2005)和Jakobsdottir,J等(2005)和其他(Edwads,A.O等(2005);Haines,J.L等(2005);Klein,R.J等(2005);Rivera,A等(2005)禾口Schmidt,S等(2006))。OLEKHA1中的A320T变体，其定位于与LOC387715相同的单才莫标本区域，在AREDS样本中具有重要性(P=0.00004)但在CHS样本中仅具有界线重要性(P=0.08)。A320T和S69A间的交写关不平衡性程度在AREDS(D，=0.66)和CHS(D，=0.65)对照中具有统计学重要性。为了鉴定PLEKHA1或LOC387715中哪个基因，更可能为定位的真实ARM-诱病变体，我们应用的单才莫标本方法(Valdes，A.M和Thomson,G.(1997)Detectingdesease-predisposingvariants:thehaplotypemethod.AmJHumGenet.60，703-716)。才艮据单模标本方法，在含有所有诱病变体的单模标本中，中性变体等位基因相关频率^皮期望与病例和对照的相同。基于运用本方法的结果显示LOC387715中的S69A，而非PLEKHA1中的A32OT，是ARM-诱病变体(见这里的"PLEKHA1和LOC387715的区别，)。此外，通过无效假设的置换试验Ho:LOC387715中的S69A变体完全导致了PLEKHAl-LOC387715单才莫标本去也的ARM易感性，没有被排除(AREDS数据中P=0.92，CHS数据中P=0.45)，而在相似假设中A320T被排除(AREDS数据中P^O.0001,CHS中P=0.0002)。LOC387715中的S69A变体显示了与CFH中Y402H不同的危险模式。在区分严重疾病的AREDS数据中，显示相比于中度ARM的危险性，变体可充分增加严重ARM的危险性(图7和10〔图11给出了PLEKHAl的完全结果〕和表12)。例如，带有一个或两个T等位基因的级别3的AREDS病例OR，为3.07(95%CI1.92-5.17，而带有一个或两个T等位基因的，双眼具有CNV的AREDS病例OR为7.21(95%CI4.24-12.27)。与CFH相似，S69A显示了在GT和TT基因分型人群归因危险性中无显著差异的等位基因-剂量效应(表12和图10)。因为S69A中仅有四个AREDS对照是TT纯合子，源于常规logistic回归的，隐性和纯合子对照的点评估和置信区间将与精确回归评估值比较(适合SAS软件版本8.2的才莫型〔SASInstituteInc.，Cary,NC,USA))。这些量化4全测没有发现点评估(基于PAR评估)94和置信区间低限(基于与ORs的比较)间有明显区别，但可信区间上限则较高(结果未显示)。交互分析我们4吏用logistic回归才莫型建立CFH和LOC387715，CFH和吸烟，及LOC387715和吸烟间的联合作用。选择了一系列的模型以挑选出最相似和最简化的模型。如North等(2005)描述，使用Akaike信息标准(AIC)评估模型。当鉴定了最简化的模型时我们评估危险因子的联合ORs。对每个队列计算分离评估值。为时AREDS样本数量最大化，进行无亚型或亚级分析；级别3-5的AREDS病例与级别1的AREDS只于照比4交。在先前文献(Jakobsdottir(2005))中我们没有发现CFH和PLEKHA1/LOC387715位点间的联合效应；独立乘法效应(附加于log-测量)可最好地描述两个位点间的联合作用。Rivera等(2005)才艮道LIC387715中S69A独立于CFH中的Y402H起租用。Schmidt等)I(2006a)也获得相似的最简化才莫型，在此，再一次，本才莫型对于AREDS和CHS数据组是最简化的(表19)。计算Y402H和S69A中危险基因分型的联合交互ORs以进一步理解两个位点间的联合作用(表20)。不考虑严重性，使用所有病例，AREDS数据显示在一个位点具有危险等位基因杂合子并在另一个^f立点具有非-危险等4立基因纯合子的个体比在两个位点都无危险等位基因的个体具有更高的ARM易感性(CT-GG联合基因分型，OR2.8,95%CI1.6-5.0;TT-GT4关合基因分型，OR3.2，95%CI1.7-6.0)。如果在两个位点都为杂合子时ARM的危险性将加倍(CT-GT耳关合基因分型，OR7.2,95%CI3.8-13.5)，并且在至少一个^f立点为危险等^f立基因纯合子时危险性升高。CHS数据的联合ORs显示了相似的模式，但仅具有一个危险等位基因时将充分的增加危险性(CT-GG联合基因分型，OR1.3，95%CI0.6-2.7;TT—-GT耳关合基因分型，OR1.2,95%CI0.5-2.8)。表19通过logistic回归的适合双-因子模型结果。在"材料和方法-交互分析"章节给出了详细的模型定义。AIC差异是最适合模型的ARC差异。最简化的模型以黑体显示。最适合的才莫型(最低AIC)的AIC差异=0。双因子模型AREDS数据CHS数据AICAIC差异AICAIC差异Y402H(因子1)和S69A(因子2).ADD1799.377.9652.717.6ADD2786.1647656.021.0ADD-BOTH723.01.7635.10.0DOM1801.279.8654.419.3DOM2786.965.5656.021.0DOM-BOTH726.55-1636.31.3ADD-INT721.40.0635.80.8ADD-DOM724.33.0638.83.8DOM-INT,,,637.82.8Y402H(因子i)和吸烟.(经常vs.从不)ADD1787.36.0677.30.0SMOKE848.367.0700.623.3ADDl掘OKE781.30.0679.11.8D0M1789.38.0679.01.7ADD1-SM0KE-INT783.21.8678.31.0DOMl-SMOKE-INT786.65.3681.94.6S69A(因子2)和吸烟'(经常VS.从不)ADD2774.06.1745.60.1SMOKE842.975.0765.219.8ADD2-SMOKE767.90.0747.31.8DOM2774.76.7745.50.0ADD2-SMOKE-INT769.71.8749.13.7DOM2-SMOKE"INT772.44.4748.93.497<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>注意n③w。u在两个位点完全分型的对照数量，n。ases-在两个位点完全分型的病例数量。ORy4g2h=S69A基因分型交叉平均Y402H的OR,ORS69A=Y402H基因分型交叉平均S69A的OR。aOR至少一个位点的个体纯合子。最近的研究(Schmidt等(2006a))报道了基因型S69A和吸烟间的强烈统计关联，基于二元(经常vs.从不吸烟)和连续比较(吸烟年份)。我们在AREDS和CHS数据组中没有重复出此发现(表19)。AREDS样本的结果显示Y402H和吸烟间的联合效应以独立多重效应最能"i兌明，而无明显的显性或交互步丈应。另一方面，描述CHS数据的最佳模型仅包括Y402H附加效应。AREDS才羊本的结果显示S69A和p及烟间的联合步丈应以独立多重岁丈应最能"i兌明，而无明显的显'l"生或交互岁爻应。CHA数4居表明了仅带有S69A的才莫型。当吸烟暴露为连续变数(吸烟年份)并且S69A基因型以附加形式编码时，CHS数据中的交互条件是不重要的(P二0.40)。吸烟年份在AREDS研究中并不适用。为进一步研究基因和吸烟的耳关合效应，从AREDS凄t据中评估每个基因的危险基因型和吸烟的联合ORs(表21)。结果表明，在吸烟者中评估任《可危险基因型(Y402H和S69A)对于ARM的危险性时，两个基因都比吸烟对于ARM危险性具有更充分的影响力。适合于应用的两个4莫型和简单chi-平方试-睑(P=0.71)显示CHS数据中吸烟的主要作用是不重要的(二元分析)。<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>病例和3540对照。结果确i正在非-西班牙白人中C等^f立基因增加ARM的危险性(图12和表22)。当研究中假设同质性时，汇集的评估值比任何个体研究具有更狭窄的CI,及杂合-和纯合子ORs的非-重叠CI:ORhet=2.43(95%CI2.17-2.72)及0Rh。m=6.22(95%CI5.38-7.19)。当在异质性下执行分析时，点评估^f直充分的相似并且CIs更广泛。固定效应才莫型下的Leave-one-out灵敏性分析显示没有研究对于汇集评估具有重要影响(表22)。Rivera等(2005)的研究比其他任何研究更强地改变了评估值；当包括研究时，ORd咖和ORhet降低大约0.2，而ORrec和ORhom升高了大约0.2。Rivera等(2005)的研究是源于HWE(P=0.03)，对照组中，基因型分布的唯一研究。在病例和对照中等位基因和基因型分布，在研究中相当相似。然而，CHS病例的基因型分布与其他研究不同，并且与其他队列相比TT危险基因型的频率更低(图13)。<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>LOC387715的meta-分析S69A在ARM中的危险相关性meta-分析包括5个独立数据组(包括这里报道的CHS和AREDS队列(图14和表15)。结果分析了所有欧洲或欧洲美国人种的3193病例和2405对照。LOC387715的研究比CFH的研究更具异质性；ORd。m和ORhet在研究中明显不同(分别为PO.01和0.02)。结果支持了先前T等位基因与增加ARM危险性的相关性的发现(表23)。带有两个T等位基因比带有一个T等位基因具有充分更高的危险性；在联结-研究变量中，ORhet和ORh。m分另寸为2.48(95%CI1.67—3.70)和7.33(95%CI4.33—12.42)。在所有对照人群和所有ARM人群中的基因型分布相似，除了CHSARM人群(图15)。表23LOC387715S69Ameta-分析结果。从个体研究和所有汇集研究中；平估ORs(95%CIs)。显示了leave-one—out敏感性分析结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>研究中ORs纯合子试验P-值当从所有研究汇集评估中去除一项研究时的汇集点评估差异(A)(固定效应模型中)实施例1发现后，CFH和PLEKHA1/LOC387715基因与ARM的相关性主要发现已经发表。许多才艮道建立了CFH中Y402H编码改变与ARM的强相关性，并且三个报道发现LOC387715中S69A编码改变与ARM的相关性，其与Y402H相关性量级相似。这些基因在染色体上的定位，CFH在lq31而LOC387715在10q26,由家族-基础交联研究一致鉴定(Seddon,J.M等(2003);Majewski，J等(2003);Iyengar,S.K等(2004);Weeks,D.E等(2001)Age-relatedmaculopathy:anexpandedgenome-widescanwithevidenceofsusceptibilitylociwithinthelq31and17q25regions.AmJOphthalmol.132，682-692;^Veeks,D.E等(2004);Klein，M丄等(1998);和Kenealy,S丄等(2004))。由于Y402H研究和三个S69A研究的主要目的特别针对寻找(和发现)ARM复杂病源学的基因，可能会过度评估Y402H和S69A总危险等位基因效果的大小。因此，分析基于ARM情况的带有最小包括和排除标准的独立疾病-对照队列，AREDS和CHS队列。AREDS队列不具有包括基于眼病情况标准的健康-相关的包括和排除标准；然而，影响和非-影响个体被登记(Age-RelatedEyeDiseaseStudyResearchGroup(1999)TheAge-RelatedEyediseaseStudy(AREDS):designimplications.AREDSreportno丄ControlClinTrials.20,573-600)。CHS队列是人群-基础的队列，其运用了带有最小包括和排除标准的65岁和更年长的3土区-基础的召集个体(Fried等(1991))。在随访的8年中进4亍^L网膜评估，并且i见网膜疾病不作为召集的因素。给定两个研究中研究目的的差异，两个队列中候选基因相关性的重复强烈支持了其在ARM病理学中的病因。我们-评估了四个基因的相关'J"生，CFH(lq31)，ELOVL4(6Q14),plekahl(10q26),和LOC387715(10q26).CFH和LOC387715在AREDS和CHS队列中都具有与ARM的重要相关性(PS0.00001)。两个基因都显示了ARM危险性等位基因-剂量效应，并且支持两个基因的l虫立多重才莫型在AREDS和CHS队列中是最筒化的。PLEKHA1基因中A320T的编码改变，临近并且与10a26上LOC387715具交联不平衡性，在AREDS队列中与ARM明显相关(P=0.00004)而非CHS队列中(P=0.08)。这些基于对AREDS和CHS队列运用单模标本方法的结果，联合了Rivera等的发现(2005)，其首次使用条件单模标本分析并测定视网膜中LOC387715的弱表达，及Schmidet等(2006),其仅测定了PLEKHA1上樣t弱的相关信号，强烈地表明10q26上LOC387715中的S69A是主要的ARM-诱病变体。单模标本方法的结果显示10q26上PLEKHA1可能不充分导致ARM-易感性；然而PLEKHA1中的A320T及S69A和其他未知变体不能作为病因单模标本被排除。AREDS和CHS队列中CFH和LOC387715基因与ARM相关性的重复，其中两个队列具有不同的研究i殳计，进一步强烈支持了其在ARM中的相关性。需要根据两个队列的不同考虑PLEKHAl在AREDS和CHS队列中不同的发现。除病例和对照人群研究的差异之外，视网膜变化的评估，视网膜发现的文献，ARM的流-f亍在两个队列间具有差异。CHS研究中，目艮底拍照仅在4壬选的一只眼中进行，并且没有扩大瞳孔拍照，而这些限制将肯定地影响测定疾病病理学的灵敏性，索然其更易影响早期视网膜改变的测定。全部CHS队列中8年随访评估的严重ARM比例大约为1.3%(Klein,R.，Klein,B.E.,Marino,E.K.,Kuller，L.H.，Furberg,C.，Burke，G.L.和Hubbard,L.D.(2003)Earlyage-relatedmaculopathyinthecardiovascularhealthstudy.Ophthalmology.110,25—33)而在AREDS中大约为17%(Age-RelatedEyeDiseaseStudyResearchGroup(2000)),并且两个队列间严重ARM疾病病理学分布的不同可以导至丈发王见的不同，特别是当一个基因更容易影响疾病发展时。此外，两个队列间最重要的不同是视网膜拍照的时间。AREDS参与者在随访评估的基线时进行;现网膜拍照，而CHS参与者在登记8年或更久后进行视网膜拍照，但是他们可能至少为73岁。可能参与CHS的视网膜评估在世者将偏离特定类型研究的人群要求。也需注意AREDS队列中，除了未影响组，分类中的主体将运用维生素和矿物质进行临床试鸟全以评估其在ARM发展中的作用。该效应还未明确。如先前说明，许多已经研究了ARM遗传病原学的研究被设计以优化鉴定ARM和ARM候选基因试验的基因组定位易感基因区域。利用这些回顾研究以评估归因危险性将导致过度评估。^艮道的诡异危险性范围对于CFH中的Y42H变体为43%至68%(Edwards等(2005);Haines等(2005);jakobsdottir(2005);和Schmidt等(2006)),LOC387715中的S69A变体为36%至57%(Jakobsdottir(2005)和Schmidt等(2006))。有趣的是，CHS人群中调整的人群归因危险性(PARs)比先前才艮道的更低CFH中Y402H变体为38%而LOC387715中S69A变体为25%(表13)。由于主要CHS病例具有调整的ARM,从CHS数据得出的PAR评估值与先前研究的评估值不完全匹配，其具有严重ARM的病人比例被认为更高。然而，其与使用级别3的AREDS病例i平估《直对目匹配。这些;平估Y直在先前发表的PARs范围内CFH中Y402H为49%,LOC387715中S69A为46%。这些发现4夸表明归因于这两个易感变体的ARM危险性可能^f氐于先前i殳想，基于ARM情况的CHS队列是不确定的。需要预期的设计以更准确；平估相关危险性，其大约通过ORs从回顾病例-对照设计评估，并对应于PARs。我们不能重复出全部ARM与ELOVL4的相关性(Conley等(2005))。带有渗出性ARM的个体数量可以让我们进行AREDS中的亚型分析，而非CHS队列。亚型分析对于ELOVL4特別重要，我们先前的发现表明了ELOVL4在渗出性ARM中的作用；其在AREDS队列中(微弱地)支持。在两个队列中ELOVL4在ARM易感性中缺少强烈相关性和明显ORs，并且Ayyagari等才艮道了相关性的缺少，难以表明ELOVL4在ARM易感性中其充分的作用。测定所有ARM的OR为0.6的能力是可信的，其类型I错误率为5%,次要等位基因频率为0.15，人群流行性为6%,能力在AREDS中为~81%,CHS中69。/。。相同条件下，在渗出性ARM中测定相同效应的能力在AREDS凄丈据中仅为~53%。因此ELOVL4在所有ARM中其作用的可能性4艮小，但不能排除其在渗出性ARM中具轻微作用。使用QUANTO进行能力评估(Gauderman,W.J和Morrison,J.M(2006)QUANTO1.1:Acomputerprogramforpowerandsamplesizecalculationsforgenetic-epidemiologystudies，http:〃hvdra.use.edu/gxe)AREDS和CHS数据支持CFH中Y402H和LOC387715中S69A在ARM易感性中的独立作用。这两个变体的多重危险才莫型是基于AREDS和CHS队列评估的最简化的；本模型也由我们先前文献，jakbsdottir等(2005)以及Rivera等(2005)表明的数据和Schmidt等(2006a)提供。当Y402H和S69A中为此案等位基因数量上升时ARM危险性表现出增长(表20)。在CFH和LOC387715发现前，吸烟是已知的最重要ARM-相关危险因素之一。吸烟通常作为ARM的修正危险因子被接受；VanLeeuwen等提供了ARM流行病学综述并讨论了吸烟作为ARM危险因子的i仑点(vanLeeuwen,R.Klaver，C.C，Vingerling,J.R，Hofman,A.禾口deJong,P.T.(2003)Epidemiologyofage—relatedmaculopathy:areview.EurJEpidemiol-18,845-854)。Schmidt等(2006)最近报道了LOC387715和吸烟在ARM中的统计学重要交互性。其凄t据显示LOC387715在ARM中的相关性最初源于中度吸烟者中的基因影响。我们自己的交互性分析不支持此发现，而AREDS数据表明S69A和吸烟的联合作用是多重的。通过我们的meta-分析结果进一步支持了CFH和LOC387715在ARM易感性中的作用。Meta-分析，其包括本文章中报道的CHS和AREDS队列，表明在CFH或LOC387715中带有一个或两个危险基因拷贝将增加ARM的危险，而带有两个拷贝者危险性更高。所有研究的联合结果和每个独立研究中的结果是非常紧密的(图12和14)。Meta-分析的一个已知限制是出版偏差易感性。通常，此类偏差是未报道的阴性发现的结果(Normand，S丄.(1999)Meta-analysis:formulating,evaluating,combining，andreporting.Statmed.8,321-359)。对于CFH和LOC387715,所有发表的研究已经报道了与ARM的相同趋势的强相关性，在CFH中危险等位基因是编码组氨酸的等位基因，而LOC387715的危险等位基因是编码丝氨酸的等位基因。如杲重要相关性是假-阳性结果时，期望显示随机趋势的统计重要相关性出版物是优选的。(Lohmueller,K.E.，pearce，C丄.，pike,M.，Lander,E.S.和Hirschhorn，J.N.(2003)Meta-analysisofgeneticassociationstudiessupportsacontributionofcommonvariantstosusceptibilitytocommondisease.NatGenet.33,177-182)。因此CFH和LOC387715与ARM的相关性一致性是出片反偏差的结果。虽然我们的统计分析结果与LOC387715是10q26上的主要ARM-相关基因，其;殳有i正明因果关系。CFH在ARM病原学中的可能病因作用已经进一步由其蛋白在ARM病人的J皮璃疾沉积〃f立置和在补体激活途径中的作用而支持。关于LOC387715，目前对该基因的生物性知道4交少并且不知其蛋白如4可影响ARM易感性。直到最近显示LOC387715的表达限制于胎盘中，但报道在视网膜中微弱表达(Rivera等(2005))，其开启了基因组织-特异作用的可能性。综述，本实施例中的结果继续支持了CHF和LOC387715在ARM病原学中的作用，不考虑病人是如何确定的，这两个基因与ARM高度相关。在AREDS和CHS队列中对PLEKHAl和ELOVL4评估显示这些基因在ARM易感性中更少地体现作用。CFH和LOC387715基因在ARM发病机理中以多重途径独立起作用，并且在任一位点为危险等位基因的个体纯合子是最高危险性的。以上对本发明进行了描述，本领域中的普通技术人员将理解可以在条件，形式和其他参凄t的广泛和相等范围内4丸行相等4喿作而不影响本发明的范围或其任4可方面。权利要求1.一种鉴定高危发生年龄-相关黄斑病变的人类主体的方法，包括在来源于主体的核酸样本中鉴定与发生年龄-相关黄斑变性危险性相关的染色体10q26上的等位基因变体的存在。2.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体发生在染色体10q26位点的PLEKHAl/LOC387715/PRSS11。3.才艮才居4又利要求1的方法，包括^人来源于主体的核酸才羊本中鉴定PLEKHA1和LOC387715中的一个或两者中等位基因变体的存在。4.才艮据4又利要求1的方法，其中等位基因变体对应于单核甘酸多态性rs4146894。5.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体对应于LOC387715中的Ser69Ala。6.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体对应于定义为rs10490924的单核甘酸多态性。7.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体对应于定义为rs1045216的单核甘酸多态性。8.根据4又利要求1的方法，其中等4立基因变体对应于一个或一个以上定义为rsl882907的单核甘酸多态性。9.根据权利要求l的方法，其中等位基因变体对应于一个或一个以上定义为rs760336的单4亥甘酸多态性。10.4艮据权利要求1的方法，其中等位基因变体对应于一个或一个以上定义为rs763720的单核甘酸多态性。11.根据权利要求l的方法，其中等位基因变体对应于一个或一个以上定义为rs800292的单核甘酸多态性。12.根据权利要求l的方法，其中等位基因变体对应于一个或一个以上定义为rsl483883的单核甘酸多态性。13.根据权利要求l的方法，其中等位基因变体对应于一个或一个以上定义为rsl853886的单核甘酸多态性。14.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体是PLEKHA1中的等位基因变体。15.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体是LOC387715中的等位基因变体。16.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体是产生一种非_功能基因产物并改变基因产物表达的突变体。17.根据权利要求16的方法，其中突变是一个或一个以上移码突变，启动子突变和剪切突变。18.根据权利要求1的方法，进一步包括从主体核酸样本中鉴定补体因子H等位基因变体的存在。19.根据权利要求11的方法，其中等位基因变体是对应于定义为rsl853883的单核甘酸多态性补体因子H。20.根据权利要求l的方法，其中使用核酸扩增方法定义等位基因变体。21.根据权利要求20的方法，其中核酸扩增方法包括PCR,反转录PCR(RT-PCR),等温扩增，基于核酸序列扩增(NASBA),5，荧光核酸方法(例如TAQMAN方法)，核酸信标方法和it环扩增中的一种。22.根据权利要求l的方法，其中使用阵列定义等位基因变体。23.才艮据;f又利要求22的方法，其中阵列包括一种或一种以上用于在来源于主体的核酸样本中，鉴定包括一种或一种以上单4亥甘酸多态'l"生，rs4146894，rsl045216，rsl0490924,rsl882907,rs760336,rs763720,rs,292，rsl483883和rsl853886的等位基因变异的存在的试剂和序列。24.根据权利要求22的方法，其中阵列包括一种或一种以上用于在来源于主体的核酸样本中，鉴定包括两种或多种单核甘酸多态性，rs4146894,rsl045216,rsl0490924，rsl882907，rs760336，rs763720,rs800292,rsl483883和rsl853886的等位基因变异的存在的试剂。25.根据权利要求1的方法，其中等位基因变体发生在染色体10q26位点的PLEKHAl/LOC387715/PRSS11。26.—种包括底物的阵列，包括在可鉴定的位点中在来源于主体的核酸样本中鉴定与发生年龄-相关黄斑变性危险性相关的染色体10q26上的等位基因变体的存在的一种或一种以上试剂。27.才艮据权利要求26的阵列，其中等位基因变体对应于定义为rs4146894，rsl045216,rsl0490924，rsl882907,rs760336,rs763720，rs800292,rsl483883和rsl853886中一种或一种以上的单核甘酸多态性。28.根据权利要求26的阵列，其中等位基因变体发生在染色体10q26位点的PLEKHAl/LOC387715/PRSS11。29.才艮据^K利要求26的阵列，其中等位基因变体对应于定义为rs4146894,rsl045216，rsl0490924，rsl882907，rs760336,rs763720,rs800292，rsl483883和rsl853886中一种或一种以上的单核甘酸多态性。30.4艮据权利要求29的阵列，包括了试剂，用于鉴定来源于主体的核酸样本中对应于定义为rs4146894，rsl045216,rs10490924，rsl882907,rs760336,rs763720,rs800292，rsl483883和rsl853886中一种或一种以上的单核甘酸多态性的等位基因变体的存在。31.根据权利要求26的阵列，其中试剂包括了特异鉴定PLEKHAl或LOC387715中等位基因变体的引物或探针。32.根据权利要求26的阵列，其中阵列包括了特异鉴定PLEKHAl或LOC387715中等4立基因变体的在测序引物。33.根据权利要求26的阵列，其中包括对PLEKHA1或LOC387715中的一个或两者有特异性的两个或多个反应孔和PCR引物组。全文摘要基因PLEKHAL和LOC387715中的等位基因变异在这里作为年龄相关黄斑变性(ARM)危险因子被识别。因而提供了一种方法用于识别个体中发生ARM的危险性，包括识别PLEKHAL和/或LOC387715中含有等位基因变异体。相关的设备，如阵列，经鉴定可用于实施这些方法。文档编号C12Q1/68GK101495651SQ200680027015公开日2009年7月29日申请日期2006年6月7日优先权日2005年6月8日发明者丹尼尔·E·威克斯,特玛麦·S·马何-费瑞瑟,约翰纳·加科伯斯多缇尔,罗伯特·费瑞尔,耶维特·P·孔利,迈克尔·B·高瑞申请人:匹兹堡大学