Rna扩增和/或rna标记用的rna依赖的rna聚合酶，方法及试剂盒的制作方法

专利名称：Rna扩增和/或rna标记用的rna依赖的rna聚合酶，方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种标记和/或引物依赖及非依赖核糖核酸(RNA)扩增用的 RNA依赖的RNA聚合酶，方法及试剂盒。特别是，应用于生物技术和医药 领域的病毒RNA、真核RNA、原核RNA和双链核糖核酸(RNA)。本发明 所涉及的扩增方法尤其适用于微阵列技术、siRNA的制备和通过检测病人样 品中的病毒RNA的病毒性感染的诊断。本发明所涉及的标记方法尤其适用 于通过亲和连接进行RNA的纯化，及适用于病毒RNA、真核RNA、原核 RNA和双链核糖核酸(RNA)的功能和/或结构特征的分子生物学研究中。
背景技术：
RNA是真核细胞和原核细胞中的一种重要成分。它参与多种重要的功 能转录，即基因组信息(脱氧核糖，DNA)的转译，将这种信息从细胞核 转移到细胞质(mRNA)，及翻译(即将转录信息分别翻译为氨基酸或蛋白质)。 RNA也可以形成所谓的转移-RNA，其为一种重要的翻译成分。RNA还是核 糖体的重要成分。这些都是细胞质中将信息翻译为蛋白质的结构体。过去的几十年中，RNA在生物技术领域中的重要性越来越突出，如微 阵列技术、miRNA(微小RNA)或siRNA技术(小干扰RNA)等新技术的发 展，他们在基础研究和应用研究领域中的相关性也越来越多。所有这些技术 都基于通过体外扩增而进行的RNA合成。目前为止，siRNA体外制备是通过化学合成或DNA依赖的RNA聚合酶， 如T7RNA聚合酶的帮助完成的。为此，两条互补的DNA链通过PCR合成， 所述的PCR采用含有T7启动子序列的引物。当DNA在T7 RNA聚合酶的 帮助下转录后，产生的互补RNA链在RNAseI的作用下杂交、酶切。RNA扩增在医学领域中，在病人样品中的病毒感染检测中具有重要作 用。世界上80X的病毒感染是由RNA病毒引起的，即病毒性病原体的基因组是由RNA组成的。比较重要的病原体有人类免疫缺陷病毒(HIV)，丙型 肝炎病毒(HCV)，甲型肝炎病毒，流感病毒(A、 B、 C)，还有禽流害虫病 毒，最近新鉴定的SARS病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒， 风疹病毒，和腹泻呕吐病毒(轮状病毒，沙波病毒和诺瓦克病毒)。目前为止，病人样品中RNA的检测分四步完成。从样品中回收RNA后， 按以下步骤进行检测1、 以cDNA为模板，通过RNA依赖的DNA聚合酶，即所说的转录酶， 进行RNA转录。引物为与被扩增序列具有特异性的寡核苷酸。引物和RNA 依赖的DNA聚合酶能使遗传材料以DNA的形式靶向扩增；2、 通过聚合酶链式反应(PCR)进行cDNA扩增；3、 PCR产物的纯化；4、 PCR产物的测序。RNA制备时，例如进行siRNA制备中的表达检测，是通过DNA依赖的 RNA聚合酶，例如T7聚合酶，将PCR产物转录为RNA。完成这些步骤一般需要18—24个小时。当然，还需要一定的"技巧"， 但并不是所有的研究机构都会掌握。另一种RNA扩增的方法是通过RNA依赖的RNA聚合酶复制完成，例 如噬菌体QJ3的RNA聚合酶(也称为Qfi复制酶)，脊髓灰质炎病毒RNA聚 合酶或丙型肝炎病毒RNA聚合酶。噬菌体Qfi的基因组是由通过RNA依赖的RNA聚合酶复制的一条单链 RNA (+)组成。Qi3复制酶通过单链RNA (+)产生一条单链RNA (-)拷 贝，该单链RNA还可以象单链RNA ( + ) —样作为模板。这样，就获得了 指数扩增。Qfi系统还用于核苷酸等分析物的检测(Chuetal. (1986), Nucleic Acids Research 14， 5591-5603; Lizardi et al. (1988), Biotechnology 6， 1187-1202)。然而，这些RNA依赖的RNA聚合酶需要一定的RNA序列来引发RNA 复制。而且，还需要依赖于一定的帮助蛋白来扩增RNA。由于这个原因， RNA依赖的RNA聚合酶不能扩增异源RNA。 '在现有技术中，RNA的3'端标记，只有在Eco//聚合A转移酶的帮助 下，通过ATP的参与才可以完成。用CTP， UTP和GTP标记RNA的方法还未见报道。 发明内容因此，本发明所解决的技术问题是提供一种标记和/或扩增病毒、真核和原核的单链、双链核糖核酸(RNA)用的RNA依赖的RNA聚合酶，方法及 试剂盒，它们更有效、快速。根据本发明，为解决上述技术问题的方案是提供一种用于RNA扩增和/ 或标记用RNA依赖的RNA聚合酶(以下也称为RdRP或3DpC)1)。其中，RNA 依赖的RNA聚合酶属于杯状病毒科^^//"'v/r/c/ae9家族的病毒，具有"右 手螺旋构象"("right hand conformation"),该RNA依赖的RNA聚合酶的氨 基酸序列由以下基序组成a. XXDYSb. GXPSGc. YGDDd. XXYGLe. XXXXFLXRXX含义如下 D:天冬氨酸 Y:酪氨酸 S:丝氨酸 G:甘氨酸 P:脯氨酸 L:亮氨酸 F:苯丙氨酸 R:精氨酸 X:任一氨基酸所说的"右手螺旋构象"("right hand conformation")是指蛋白质的三级 结构(构象)具有一个根据右手的手指、手掌和拇指的折叠。基序"XXDYS"就是所说的A基序，用于区分核糖核酸和脱氧核糖核酸。 基序"GXPSG"就是所说的B基序，该B基序在杯状病毒科 fa^'c/v/n^^ J家族的所有代表中是保守的。基序"YGDD"就是所说的C基序，该C基序代表酶的活性中心，该基序在金属离子配位中具有重要作用。基序"XXYGL"就是所说的D基序，该D基序是模板依赖的聚合酶的特征序列。基序"XXXXFLXRXX"就是所说的E基序，该E基序是RNA依赖的 RNA聚合酶的特征序列，在DNA依赖的聚合酶中不存在。 本发明的RNA依赖的RNA聚合酶具有以下功能 —Mg2+-或Mn、依赖的RNA依赖的RNA聚合酶活性，无DNA依赖性；一模板依赖性；一以同质聚合RNA (分别为poly (A)-RNA, poly (C)-RNA, poly (G)-RNA 或poly(U)-RNA)作为模板，在相应引物(例如分别为oligo(U)-RNA,oligo (G)-RNA， oiigo (C)-RNA或寡聚(A)-RNA)存在下，进行引物依赖的RNA合 成；一在提高GTP浓度的情况下，以poly (C)-RNA作为模板，进行非引物 依赖的RNA合成；一以异质聚合RNA作为模板，进行引物依赖或非引物依赖的RNA合成； 一末端转移酶活性，特别是UTP和CTP存在下，标记单链RNA模板3'-一山顺。引物依赖的RNA扩增只在序列特异性引物的存在下才可以发生。扩增 是序列依赖性的，并通过AMP、 GMP、 CMP或UMP的参与而完成。非引物依赖性RNA扩增在不存在序列特异性引物的情况下发生，扩增 是序列依赖性的，通过AMP, GMP, CMP或UMP的参与而完成。由于末端转移酶活性，如ATP、 UTP、 CTP或GTP中的一种的多个核苷 酸被转移到RNA链的3'-末端，而不依赖所述RNA链的序列。本发明的RNA依赖的聚合酶惊人地能够以异源病毒、真核RNA、原核 RNA为模板进行体外扩增反应。无论正链和负链RNA，还是单链和双链RNA都可用于扩增。尤其是，本发明的RNA依赖的RNA聚合酶是杯状病毒科fO^"Wn'^d 家族病毒的RNA依赖的RNA聚合酶。杯状病毒科^:a//CZV/rW"d的基因组 是由多聚腺苷酸(+)链的单RNA链组成。在体外，杯状病毒的RNA依赖的 RNA聚合酶在复制过程中将杯状病毒的基因组RNA转录为一条(-)链反义 RNA(aRNA)。由此，产生了一条RNA-aRNA杂交链。随后，(-)链aRNA作 为模板，合成一条新的(+)链的基因组病毒RNA。本发明的更优选的实施方式中，RNA依赖的RNA聚合酶是人源和/或非 人源性杯状病毒的RNA依赖的RNA聚合酶。特别是诺瓦克病毒、沙波病毒、 水泡病毒属或兔病毒属的RNA依赖的RNA聚合酶，例如诺瓦克病毒 HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE株、沙波病毒pJG-Sap01株或水泡病毒属 FCV/Dresden/2006ZGE株的RNA依赖的RNA聚合酶。如本发明优选的实施例所述的RNA依赖的RNA聚合酶是一种蛋白质， 该蛋白质具有序列表SEQ ID NO 1、 SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的氨基 酸序列。SEQ ID NO 1是诺瓦克病毒-RdRP的氨基酸序列。 SEQ ID NO 2是沙波病毒-RdRP的氨基酸序列。 SEQ ID NO 3是水泡病毒属-RdRP的氨基酸序列。SEQ ID NO 1:鄉節,CT3Saja:^3KJSJiPKL缠TKFHRSSTTP:LP滩TYE鹏工能K 織鄉rTQACftSLE)Ki:TS&Giffi節舰IHDC:鄉GESFTGKLaDQAS腿;s;L GGLW滋HmHCVT磁RVG,繊&3ra,IISRyKYffim肪:mEW:D浩 SGVPCTS,S譚WI^IXCMiSEVT扁赃工卿歸SFYGBaera！1SEQ ID NO 2:PVL7卿ACT忍LLERTTSCG:PFVQGI;lcapyWDBE咖YTCTLANH:LEQA節鹏OTA/VSL7"L烈F^P股工VSCAlEICjSSWiEGYVKDIKPVTRGGLPSW VCP JVT AS ;C BmVL鹏jTS1'GLKPTAADB:SDAIKFTKTP WMCRTFTQT PHSVEMiD工TSITRQFYWLKaKRTO加SSl 鹏鹏AESAQIiEMAlAyASEQ ID NO 3:SHQPASLGSGDKICPKSI/TAI WDSLKWCgKT加PP節:LHRVQRML XD 7SRGQ3LWKACL、'ASQHQPSFYTSnCVYRLAEKAVBYESLHFEPPSYHSALE诺瓦克病毒、沙波病毒、水泡病毒属的RNA依赖的RNA聚合酶可以通 过重组产生，即通过编码诺瓦克病毒-RdRP、沙波病毒-RdRP或水泡病毒属 -RdRP的核苷酸的克隆，分别形成合适的表达载体，例如，pET-28 (Novagen)。携带编码病毒RdRP基因序列的表达载体转入合适的寄主生物体中表达。寄主生物体优选于原核生物，特别是大肠杆菌&c/^n'c力/a w//，或者是优选于真核寄主生物体，特别是啤酒酵母Sflc/wraw3^sce W5ae，或者优选于昆虫细胞(优选Sf9细胞)，这些都已被重组杆状病毒感染，这些寄主生物体都比较普遍用于蛋白质的表达。这些寄主生物体包含至少一个具有编码病毒RdRP基因序列的表达载体。如本发明的优选实施例所述，诺瓦克病毒-RdRP、沙波病毒-RdRP或水泡病毒属-RdRP与蛋白质序列在N端或C端融合，以便于RdRP融合蛋白在寄主生物体中表达后的纯化。特别是，该序列是一个所说的组氨酸标记，该组氨酸标记是由至少6个连续的组氨酸(His或H)序列组成。这样的组 氨酸标记允许通过镍柱或铜柱亲和层析，以已知的方式进行蛋白质纯化。与组氨酸标记融合的RNA依赖的RNA聚合酶的实施例中，是具有序列 表SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO 4是具有组氨酸标记(His-tag)的诺瓦克病毒-RdRP的氨基 酸序列。SEQ ID NO 5是具有组氨酸标记(His-tag)的沙波病毒-RdRP的氨基酸 序列。SEQ ID NO 6是具有组氨酸标记(His-tag)的水泡病毒属-RdRP的氮基酸序列。SEQ ID NO 4:S GVPCTS QWMSIAHWLI/TLCALSEVTKLS PDZ工,SLPS FYGSDETVSTSEQ ID NO 5:微Y，0TS 《LAn呢IiKPYTEPTA(3VraQliS5LJWTOTSS"i';rE'I"工工GTffiiS PBGVRALIjDITSITRQFYVfLKANRTSDP.SSPPAFDRQARSAQLEKALAYASEQ ID NO 6:MKVTrQXYDVTKPDISYKGl/ICKOLDSrriVieKCTRiLh-VSPAHTDDYDEClaDLLSSKWKIjATOGIGlaPHEYTIGIjKDEIaRPVEKVQEGKRRK.IIWGCDVGIVVDYSK節S，P柳鄉lD憶YFSD究叙tVDSAAKTiKSPP工MPMGVD鹏lTGnDSWOTTMK加VSDQIF旭LTAYGICT揚msVGPJ:EPIOT VVPrjKSTITRTPHGIIWIjLJMJGS工rP、QFYY工KGENSDDWKT:r邻T遊 TSRGQ。L鄉ACLY站DHG滩FraKWRliAEKAVEYS曰L':HraPPSYHSALE HYNNQFNGTOTRSDQIDASVMTDLKCDVFEVLEHHHHHH本发明还提供本发明的RNA依赖的RNA聚合酶在扩增和/或标记或标志 RNA中的应用。本发明还提供利用本发明的RNA依赖的RNA聚合酶扩增RNA的方法， 其包括以下步骤a. RNA依赖的RNA聚合酶，在寡核苷酸引物例如寡RNA引物或寡DNA 引物存在或不存在的情况下，与RNA模板分别附着或退火；b. 通过RNA依赖的RNA聚合酶将RNA模板转录为反义RNA;c. RNA/反义RNA双链复合物分离为单链RNA; 本发明还提供一种进行RNA扩增用的试剂盒，其包括a、 本发明的RNA依赖的RNA聚合酶b、 合适的反应缓冲液c、 NTPsd、 选择组分，RNase抑制剂e、 选择组分，终止液本发明的一优选方法实施例中，RNA模板在每50 (il反应液中含1 到 4叱。核糖核苷酸(NTPs)ATP、 CTP、 GTP和UTP的浓度优选为0.1 pmol/l到 l|imol/l，更优选的为0.4(Limo1/1。本发明的RNA的扩增方法中，还可能使用 NTP类似物，例如荧光标记NTPs，生物素标记NTPs，或放射性标记NTPs， 如[P"]标记NTPs。本发明的RdRP的浓度优选为1 jnmol/1至lj 3|jmol/l。在本发明的一个更优选实施例中，该试剂盒包括a、 150 (imol/1的重组的序列表SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4的诺 瓦克病毒-RdRP禾口/或序列表SEQIDN0 2或SEQ ID NO 5的沙 波病毒-RdRP禾口/或序列表SEQIDN0 3或SEQIDN0 6的水泡 病毒属-RdRPb、 缓冲液50 mmol/1 HEPES， pH 8.0， 3 mmol/1醋酸镁或氯化锰(MnCl2)， 4mMDTTc、 10 mmol/1 ATP 、 10mmol/lCTP、 10 mmol/1 GTP、 10 mmol/1 UTPd、 RNase抑制剂e、 终止液4mol/l醋酸铵，100 mmol/1 EDTA该方法优选在pH值6.5至ij 8.5，温度2(TC到4(TC之间完成。在RNA 扩增的一优选实施例中，是与诺瓦克病毒-RdRP在3(TC温度下，或与沙波 病毒-RdRP在37。C温度下完成的，缓冲液条件为50 mmol/1 HEPES、 pH 8.0、 3 mmol/1醋酸镁或氯化锰、4 mmol/1 DTT。本发明的一优选实施例中，RNA/反义RNA双链复合物分离为单li RNA， 是通过热变性、化学变性和/或酶变性完成，例如具有分离双链RNA为单链 RNA活性的酶，如解旋酶。由于链的分离，单链模板又出现了，新一轮的扩增就产生了。通过使用具有将双链RNA分离为单链RNA能力的酶，反应可以维持在 等温条件下。本发明提供用于扩增RNA的试剂盒，其除了包括本发明所述的组分外， 还包含一种酶，例如解旋酶，他具有将双链RNA分离为单链RNA的能力。本发明的一实施例是一种引物依赖的RNA扩增的方法，其中至少一种 引物与RNA模板的一部分杂交，随后与本发明的RNA依赖的RNA聚合酶 退火，并被RNA依赖的RNA聚合酶根据RNA模板序列延长。关于引物，优选RNA引物或DNA引物，例如长度20到25个碱基， 优选浓度为O.l到l(imo1/1。关于RNA模板，例如病毒RNA，原核RNA和 真核RNA都可以使用。采用RNA引物、单链RNA模板进行引物依赖的RNA扩增的过程如图 1所示。在聚腺苷RNA，聚尿苷RNA，聚鸟苷RNA或聚胞苷RNA反应中分别优选使用poly-U-RNA 、 poly-A-RNA、poly-C-脂A或poly-G-RNA作为引物。 使用poly-U-RNA为引物，对细胞总mRNA进行特异性扩增是可行的。为此， 优选的poly-U-引物长度为20到24个碱基。被扩增的细胞mRNA可以采用 所说的微阵列的方法进行分析。本发明的序列特异性RNA扩增的方法也可用于病人样品中病毒RNA的 检测。为此，回收病人样品中细胞总RNA，病人样品中的病毒RNA通过RNA 引物与病毒RNA特异性的部分杂交而被扩增。病人样品，可以是例如液体、血液、血浆或体液等。该方法还适用于RNA病毒的检测，所述的RNA病毒在基因组、DNA 病毒和病毒RNA转录体的3'-末端具有poly-A尾。本发明所提供的进行引物依赖的RNA扩增方法的试剂盒包括a. 本发明的RNA依赖的RNA聚合酶b. 合适的反应缓冲液c. OTPsd. 选择组分，RNase抑制剂e. 选择组分，终止液优选的试剂盒包括a. 150 |imol/l的重组的序列表SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4的诺 瓦克病毒-RdRP和/或序列表SEQIDN0 2或SEQ ID NO 5的沙 波病毒-RdRP禾口/或序列表SEQIDN0 3或SEQIDN0 6的水泡 病毒属-RdRPb. 缓冲液50 mmol/1 HEPES， pH 8.0， 3 mmol/1醋酸镁或氯化锰(MnCl2)， 4mMDTTc. 10 mmol/1 ATP 、 10mmol/lCTP、 10 mmol/1 GTP、 10 mmol/1 UTPd. RNase抑制剂e. 终止液4mol/l醋酸铵，100 mmol/1 EDTAf. 0.1~3 pM引物(长度为15到20个碱基的同聚或异聚RNA或DNA寡核苷酸)本发明还提供非引物依赖的RNA扩增的方法，其中，没有引物与RNA 模板的一部分杂交，通过RNA依赖的RNA聚合酶根据RNA模板序列进行 延长反应。本发明还提供非引物依赖的RNA扩增的试剂盒，其包括a. 本发明的RNA依赖的RNA聚合酶b. 合适的反应缓冲液c. NTPsd. 选择组分，RNase抑制剂e. 选择组分，终止液本发明的方法实施例中，RNA依赖的RNA聚合酶与RNA模板的退火 是非引物依赖性的。单链RNA模板在不存在RNA引物的情况下发生非序列 依赖的RNA扩增的过程示意图见图2所示。本发明的进一歩实施例是非引物依赖的poly(C)-RNA扩增方法，其特征 是，没有引物与RNA模板的一部分杂交，GTP作为单核苷酸，GTP优选为 50 pM，通过RNA依赖的RNA聚合酶根据RNA模板的序列进行延长反应。在50 GTP存在下，基于poly(C)-RNA的非序列依赖的RNA合成的 示意性过程如图4所示。本发明的RNA扩增方法的应用有很多。 一方面，使病人样品中的病毒 性遗传物质的直接检测是可行的。为此，回收细胞总RNA，使用RNA引物 进行任何RNA序列的扩增。病毒核苷酸的检测可以通过与特异性探针的杂 交来完成。另一个应用涉及RNA的非特异性扩增(非RNA引物依赖的)， 这种应用使迄今未鉴定的病毒和新的病毒突变体的检测成为可能。进一步的应用涉及微阵列技术，该技术的目的是检测细胞的差异表达。 该技术是通过细胞转录体即mRNA的检测来完成。基于细胞混合物，为了在 微阵列中进行杂交检测，本发明允许使用poly(U)寡核苷酸的mRNA的特异 性扩增。本发明的进一步应用的领域为体外siRNA的制备，该反应是在T7聚合 酶的帮助下完成。为此，1. 使用T7启动子引物，通过PCR方法，合成两条互补的DNA双链；2. DNA在T7聚合酶的帮助下转录后，两条互补的RNA链杂交；3. 通过RNAseI将两条链酶切。根据现有技术，这些步骤通常需要24到48小时，而且需要一定的技巧。 相反，本发明允许以RNA序列为起始，没有必要的PCR步骤、体外转录和 RNA杂交(这些不是最佳歩骤)，而可以直接、高效并简单地制备双链RNA。本发明还提供一种采用本发明的RNA依赖的RNA聚合酶标记RNA的 方法，包括以下歩骤a. RNA依赖的RNA聚合酶与待标记的RNA退火；b. 在待标记的RNA的3'-末端添加至少一个核苷酸； 本发明还提供一种完成本发明的标记RNA的方法的试剂盒，包括a. 本发明的RNA依赖的RNA聚合酶b. 合适的反应缓冲液c. CTP或UTP或ATP或GTPd. 选择组分，RNase抑制剂e. 选择组分，终止液RNA模板3'-末端的示意性标记过程如图3所示。 优选的试剂盒包括g. 150 |imol/l的重组的序列表SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4的诺瓦克 病毒-RdRP禾口/或序列表SEQIDN0 2或SEQ ID NO 5的沙波病毒 -RdRP和/或序列表SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6的水泡病毒属-RdRPh. 缓冲液50 mmol/1 HEPES， pH 8.0， 3 mmol/1醋酸镁或氯化锰(MnCl2)， 4 mM DTTi. 10 mmol/1 ATP 、 10mmol/l CTP、 10 mmol/1 GTP 、 10 mmol/1 UTP j. RNase抑制剂k. 终止液4mol/l醋酸铵，100 mmol/1 EDTA。
以下结合附图和实施例对本发明做进一步阐述。附图如下

图1:序列依赖的RNA扩增流程图； 图2:非序列依赖的RNA扩增流程图； 图3: RNA模板的3'-末端标记流程图；图4:以poly(C)-RNA为起始，在50 (iM GTP存在下，非序列依赖的 RNA合成流程图；图5:诺瓦克病毒3D—在五.co/Z.中的表达与纯化。(A) 在￡. co//. 3DP。'中表达的具有C-端His标记的纯化的重组诺瓦 克病毒3D—的SDS-PAGE分析。3DpQl、野生型诺瓦克病毒 3DP°'、 m3D一、在活性位点(YGD343GD344G)具有突变的诺瓦 克病毒3DP。1。 M，分子量标记(KDa)。(B) 采用用于C-端具有His-tag的蛋白质检测的pentahistidine抗 体(Qiagen单克隆鼠抗体)对纯化的重组诺瓦克病毒3D— 进行Western-blot分析。3D—、野生型诺瓦克病毒3D一、在 活性位点(YGD343GD344G)具有突变的诺瓦克病毒3D一。 M， 分子量标记(KDa)。图6:用诺瓦克病毒3DP。'进行RNA合成。(A) RNA的合成是在合成的亚基因组RNA (sG-RNA)作为模 板，在野生型诺瓦克病毒3Dp°'或在活性位点(YGD343GD344G)有突变的诺瓦克病毒3D-存在下进行的。反应产物用非变性琼脂糖凝胶分析，采用自显影观察。T7， 合成的亚基因组RNA由采用T7在体外转录产生。(B) 用溴化乙锭对同一凝胶进行染色，反应产物通过UV透射 照明观察。与m3DP。1反应，而不是与野生型3D一反应的 时候，可见带源于反应中合成的亚基因组RNA。 M， RNA 分子重量标记。(C) 采用诺瓦克病毒3D一体外RNA合成的反应产物的链分离 分析。该反应产物是采用诺瓦克病毒3D—(3D一)进行RNA 合成过程中产生的，该合成过程采用合成的亚基因组 RNA (sG-RNA)作为模板。反应产物在非变性(0.5 M;左 侦IJ)的甲醛琼脂糖凝胶或变性(1.25M;右侧)的甲醛琼 脂糖凝胶下观察。T7，合成的亚基因组RNA使用T7体 外转录产生。M， RNA分子重量标记。图7:诺瓦克病毒3D—合成产物的Northern blot分析。(A) RNA合成是在合成的亚基因组RNA(sG-RNA)作为模板，在野生型诺瓦克病毒3DP°'或在活性位点(YGD343gD344c)有突变的诺瓦克病毒3D—存在下完成。反应产物经溴化 乙锭染色后，在非变性琼脂糖凝胶上分析，UV透射照 明观察。T7，合成的亚基因组RNA釆用T7体外转录。 M， RNA分子重量标记。如果是与m3DP。1 ，而不是与野 生型3D—反应，可见带源于反应中使用的模板。(B) (-)链RNA探针与诺瓦克病毒3DP。1的合成产物的杂交。 T7，采用T7体外转录制备的亚基因组RNA。 sG-RNA， 作为模板的合成亚基因组RNA。 3DP°'，野生型诺瓦克病 毒3D一。诺瓦克病毒3D—在活性位点(YGD343GD344G) 具有突变。图8:诺瓦克病毒3DP°'活性的浓度的依存性，温度的依存性和时间变化 分析。在所有反应中使用亚基因组RNA作模板。(A) 诺瓦克病毒3D—活性的浓度依存性。诺瓦克病毒3D—的浓 度(pM)作为指示。反应在3(TC下进行2小时。每种浓度分别用三个独立的试验所得的均值和标准偏差分析。(B) 诺瓦克病毒3D一活性的时间变化分析。[a-32P]UMP的掺入 作为标记。反应在30°C， 3pM诺瓦克病毒3D一的条件下进 行。每一个时间点分别用三个独立的试验所得的均值和标准 偏差分析。(C) 诺瓦克病毒3D—活性的温度依存性。[cx-32P]UMP的掺入作 为标记。反应时间^J'2小时。每种浓度分别用三个独立的试 验所得的均值和标准偏差分析。(D) 诺瓦克病毒3D一活性对金属离子的依存性。RNA的合成是 在3pM诺瓦克病毒3D一，亚基因组RNA作为模板(0.024 iaM)，增加的浓度(0.5歪U 3 mM)的MgAcO、 MnCl2或 FeS04存在下反应2小时。[a-32P]UMP的掺入作为标记。每种浓度分别用三个独立的试验所得的均值和标准偏差分析。 图9:基于同质聚合模板的RNA合成的引物依赖的引发。RNA的合成是在互补RNA寡核苷酸引物存在(黑带)或不存在(灰带)的情况下完成。 [a-32P]CMP, [a-32P]AMP, [a-32P]GMP或[a-32P]UMP的掺入，在TCA沉淀、 G/C玻璃纤维滤纸收集后检测。用掺入率表示。 图10:诺瓦克病毒3D—的末端转移酶活性。(A) 为了检测末端转移酶活性，将3 fiM诺瓦克病毒3DP。'在3(TC 孵育2小时，亚基因组RNA(sG-RNA)作为模板(0.024 ^M)， [a-32P]ATP、 [a-32P]GTP、 [a-32P]CTP或[a-32P]UTP标记。 反应产物在非变性琼脂糖凝胶上分析，自显影观察。(B) 诺瓦克病毒3DP。'的转移酶活性的时间变化实验是以亚基因 组RNA作为模板。反应如(A)中所述，但用[a-"P]UTP作为 标记的核苷酸，在显示的时间点(sec)停止，反应产物在非 变性琼脂糖凝胶上通过自显影观察。T7，使用T7体外转录 产生合成的亚基因组RNA。(C) 采用3 pM诺瓦克病毒3Dpd，亚基因组RNA作为模板情况 下，RNA合成的时间变化实验。反应在3(TC温度下孵育， 在显示的时间点(sec)停止，反应产物在非变性琼脂糖凝胶 上通过自显影观察。T7，使用T7体外转录产生合成的亚基 因组RNA。 P，诺瓦克病毒3D^的合成产物。图11:采用诺瓦克病毒3DP。'进行全长亚基因组多聚腺苷酸化RNA的 引物依赖性复制。所有反应中使用合成的亚基因组多聚腺苷酸化RNA作模 板。反应产物在甲醛琼脂糖凝胶上分析，通过自显影进行观察。(A) 反应在寡(U)2Q RNA引物作为指示(mM)的情况下进行。 M，标记(体外转录亚基因组多聚腺苷酸化RNA)。(B) 反应在与poly(A)尾附近序列互补的RNA寡核苷酸存在下 进行。RNA寡核苷酸引物浓度(mM)作为指示。M，标记(体外转录亚基因组多聚腺苷酸化RNA)。 图12:诺瓦克病毒反亚基因组RNA的RNA合成的从头起始。 合成的反亚基因组RNA在所有反应中作为复制模板。RNA反应产物经 溴化乙锭染色后，在非变性琼脂糖凝胶上分析，并通过UV透射照明观察。 (A) Lanes 1至lj 3:分别为在野生型3cf。1、突变3d一存在下，及没有3d—存在情况下RNA的合成。Lanes 4到6:分别为野 生型3d一和与3'-端互补的RNA寡核苷酸存在下，突变3cT1 和与3'-端互补的RNA寡核苷酸存在下，及与3'-端互补的 RNA寡核苷酸存在但没有诺瓦克病毒3dP。i存在情况下，RNA 的合成。Lanes7到9:分别为野生型3dp°'和与3,-端互补的 DNA寡核苷酸存在下，突变3d一和与3，-端互补的DNA寡 核苷酸存在下，及与3'-端互补的DNA寡核苷酸存在但没有 诺瓦克病毒3cP'存在情况下，RNA的合成。T，模板RNA。 R，复制产物。M， RNA分子量标记(Kb)。 (B)复制产物的链分离分析。反应产物在溴化乙锭染色后，甲醛 琼脂糖凝胶上分析，通过UV透射照明观察。Lanes 1和2， 分别为模板(反亚基因组RNA)和诺瓦克病毒3cT'复制产 物。M， RNA分子量标记(Kb)。 图13:同质多聚模板上RNA的非引物依赖性从头合成的引发。RNA 的合成是分别在poly(rG)、 poly(rU)、 poly(rC)和poly(rA)为模板，冷CTP、 ATP、 GTP和UTP存在(黑带)下或不存在(灰带)下完成的。从TCA沉 淀后，并从G/C玻璃纤维滤纸中收集后，检测[a;P]CMP、 [a-32P]AMP、 [a-32P]GMP或[a-32p]UMP的掺入，用掺入率表示。图14:使用诺瓦克病毒RNA聚合酶对病毒RNA和真核RNA进行扩增。 (A) 自显影显示[a^P]UMP的掺入。反应l，亚基因组诺瓦 克病毒RNA;反应2，在RNA的5'-端有60个核苷酸缺失 的亚基因组诺瓦克病毒RNA;反应3,在RNA的3，-端有 60个核苷酸缺失的亚基因组诺瓦克病毒RNA;反应4，在 RNA的5'-端和3'-端有60个核苷酸缺失的亚基因组诺瓦克 病毒RNA;反应5和反应6，阴性对照；反应7，亚基因 组诺瓦克病毒RNA (血清型l);反应8，亚基因组诺瓦克 病毒RNA (血清型2);反应9，真核生物JTenopw /aev^ 的elF4基因的RNA;反应10，亚基因组诺瓦克病毒DNA; 反应11 ， J^"o; ^ 的elF4基因的T7转录RNA;反应12，阴性对照。(B) [a-，]UMP掺入的量化。反应编号是指图14 (A)中的 样品。图15:沙波病毒3D—在五.co/z'.中的表达和纯化。(A) 在五.^//.中表达的并带有C-端His-tag的纯化的重组沙 波病毒3D—的SDS-PAGE分析。3D一、野生型沙波病毒 3D—、 m3Dp°'、活性位点(YG34犯D344c)有突变的沙波病毒 3D—。 M，分子量标记(KDa)。(B) 采用用于C-端具有His-tag的蛋白质检测的 pentahistidine抗体(Qiagen单克隆鼠抗体)对纯化的重组 沙波病毒3D一进行Western-blot分析。3D一、野生型沙波 病毒3Dpol、 m3Dp°'、在活性位点(YGD343GD344G)具有突 变的沙波病毒3D—的。M，分子量标记(KDA)。图16:沙波病毒3D一活性的浓度依存性、底物依存性、温度依存性和金 属离子依存性。在所有的反应中，都使用亚基因组RNA作为模板。(A) 沙波病毒3D一活性的浓度依存性。RNA合成是在0.024 pM RNA，沙波病毒3D—浓度增加(从0.0到5.0 (iM)的条件 下进行。[a-32P]UMP的掺入作为指示。反应在37。C进行2 小时。(B) 沙波病毒3D—活性的底物依存性。RNA合成是在3 jiM沙 波病毒3DP。J，亚基因组RNA模板浓度增加(从0.00到0.100 ^M)的条件下于37'C进行2小时。[a-32P]UMP的掺入作为(C) 沙波病毒3D-活性的温度依存性。反应在3(TC或37t:温 度下进行，在显示的时间点停止。所有反应中，沙波病毒3Dpd 的浓度为3 nM。 [a-32P]UMP的掺入作为指示。(D) 沙波病毒3D一活性的金属离子依存性。RNA合成是在3 沙波病毒3DpQl，亚基因组RNA作为模板(0.024 (iM)，MgAcO 或MnCl2的浓度增加(从0.5至(J 5mM)条件下，37°C反应2 个小时。[a-32P]UMP的掺入作为指示。图17:使用沙波病毒3D—进行RNA合成。(A) 在添加或不添加3 寡(U^ RNA引物，并且在野生型沙 波病毒3D,3DP。')或作为指示，在活性位点有突变的3D— (m3Dp°'， YGD343cD34犯)的存在下，检测用合成的亚基因组多聚 腺苷酸RNA (sG-poly(A)-RNA)作为模板的RNA的合成。 反应产物在溴化乙锭染色后，在非变性琼脂糖凝胶上分析， 并用UV透射照明观察。使用m3D—而不是野生型3D—情 况下，或者不添加寡(U)2oRNA引物情况下，这些反应中的可 见剩余带源于合成的亚基因组RNA模板。T7,使用T7体外 转录产生合成的亚基因组RNA。 M， RNA分子量标记。(B) 使用沙波病毒3Dpd进行体外RNA合成的反应产物的链分 离分析。该反应产物是采用亚基因组多聚腺苷酸 RNA(sG-poly(A)-RNA)作为模板，沙波病毒3D—(3D—)参与 的RNA合成而产生的。反应产物在变性甲醛琼脂糖凝胶上观 察。T7，使用T7体外转录产生合成的亚基因组RNA。 M， RNA分子量标记。图18:反亚基因组沙波病毒RNA的RNA合成的从头起始。(A) RNA合成是在合成的反亚基因组RNA(anti-sG-RNA)作 为模板，野生型沙波病毒3D一(3D,或活性位点有突变的3dPQl (m3D一、 YGD343GD344G)作为指示的情况下进行。反应产物经溴化乙锭染色后，在非变性琼脂糖凝胶上分 析，并用UV透射照明观察。反应中采用的m3D一而 不是野生型3D一 ，可见的剩余带源于反应中使用的合 成的反亚基因组RNA模板。T7，使用T7体外转录产生 合成的亚基因组RNA。 M， RNA分子量标记。(B) 使用沙波病毒3D—体外RNA合成的反应产物的链分离 分析。该反应产物是采用合成的反亚基因组 RNA(anti-sG-RNA)作为模板，沙波病毒3D一参与的 RNA合成而产生的。反应产物在变性甲醛琼脂糖凝胶上 观察。T7，使用T7体外转录产生合成的亚基因组RNA。 M， RNA分子量标记。图19:沙波病毒3Dpd的末端转移酶活性。为了检测末端转移酶活性，将3 ^M沙波病毒3DP。'或活性位点具有突变 的3DP。'(m3DP。')在亚基因组RNA(sG-RNA)作为模板(0.024 ^M)， [a-32P]ATP、 [a-32P]GTP、 [a-32p]CTP或[a-32p]UTP(0.024 ^iM)作为指示的存在下，37。C反 应2小时。反应产物在非变性琼脂糖凝胶上分析，自显影观察。T7，使用T7 体外转录产生合成的亚基因组RNA。图20:沙波病毒3D—在同质聚合模板存在下，RNA合成的从头起始。 RNA合成是通过将poly(G)-RNA, poly(U)-RNA, poly(C)-RNA和 poly(A)-RNA模板分别与[a-32p]CTP、 [a-32P]ATP、 [a-32P]GTP或[a-32p]UTP 孵育，并分别在有或没有3 ^Moligo(C)20、 oligo(A)加、oligo(G)2Q或oligo(U)20 RNA引物的情况下完成的。与此同时，RNA也可以在没有寡RNA引物，而 分别在50 )aM冷CTP、 ATP、 GTP和UTP并以poly(G)-RNA、 poly(U)-RNA、 poly(C)-RNA或poly(A)-RNA为模板的情况下合成。掺入[a-32P]CMP， [oc-32P]AMP， [a-32P]GMP或[a，P]UMP作为指示。图21:水泡病毒属3D—在五.co/z'.中的表达和纯化。(A)在E co/z'.中表达具有C-端His-tag的纯化的重组水泡病毒 属3D—的SDS-PAGE分析。经Ni-NTA柱亲和纯化后，片 段11到19的浓度和片段14相同。M，分子量标记(KDa)。 图22:采用水泡病毒属3D一的RNA合成。(A) RNA合成是在合成的亚基因组多聚腺苷酸RNA (sG-poly(A)-RNA)作为模板，添加和不添加3 fiM oligo(U)20 RNA弓l物，并在野生型水泡病毒属3D—(3DP。1) 存在下完成。反应产物在非变性琼脂糖凝胶上分析，自显 影观察。T7，使用T7体外转录产生合成的亚基因组RNA。 M， RNA分子量标记。
具体实施方式
实施例l:重组诺瓦克病毒-RdRP的制备方法。诺瓦克病毒-RdRP的cDNA是通过诺瓦克病毒的克隆pUS-NorII(GenBank accession number: AY741811 )进行PCR获得的。该cDNA被克隆到 pET-28b(+)载体(Novagen)，然后对该表达载体进行测序，并转化到E co// CL21 (DE3)pLysS。细胞在37°C的Luria-Bertani培养基中孵育，该培养基中 含卡那霉素(50mg/1)。在光学密度0.6(OD600)下，通过添加异丙基-卩-D-硫代 半乳糖苷(IPTG)到最终浓度lmM，诱导蛋白质表达。然后在25匸温度下 孵育过夜。从250 ml培养物中获得的细胞抽提物用4m磷酸盐缓冲液(PBS) 和1 % Triton X 100 (sigma)水洗一次。细胞用Dnase酶(10 U/ml) 37。C下处理 15分钟，超声处理，并在40 ml结合缓冲液(20 mM Tris/HCl、 pH 7.9、 500 mM NaCl、 5mM咪唑)中悬浮。在4300rpm， 4"C温度下，离心40分钟，获得清 晰的裂解液。具有His6-tag的诺瓦克病毒-RdRP与镍一次氮基三乙酸 (Ni-nitrilotriacetic acid) (NTA)琼脂糖凝胶基质(Novagen)相连接，该琼脂糖 凝胶基质已用结合缓冲液预平衡。所得的连接蛋白用含有60 mM咪唑的结合 缓冲液洗涤，用含有1 M咪唑的结合缓冲液洗脱。洗脱的蛋白质用缓冲液 A(25 mM Tris-HCl、 pH 8.0、 1 mM卩-巯基乙醇、100 mM NaCl、 5 mM MgCL2、 10%甘油、0.1% Triton X)透析。采用基于双缩脲反应的BCA蛋白质检测试 剂盒(Pierce)测定蛋白质浓度。该酶在终体积为50 %的甘油中悬浮，并在 -2(TC保存。 实施例2:采用诺瓦克病毒-RdRP进行非序列依赖型RNA的扩增。 由0.5-1 iugRNA模板、10pl反应缓冲液(250mMHEPES、 pH8.0、 15 mM醋酸镁、20 mM DTT)、 50 U RNase抑制剂(RNAsin， Promega)、 ATP, CTP， GTP， UTP各0.4 mM、实施例1中制备的3 诺瓦克病毒-RdRP组成的反 应混合物(50 pi),在30。C反应2个小时。添加50jil终止液(4M乙酸铵、100 mM EDTA)终止反应。苯酚-氯仿抽提法进行纯化，或采用MEGAclear试剂 盒(Ambion)，根据厂家说明进行纯化。转录产物经溴化乙锭染色后，在TBE 缓冲液配制的琼脂糖凝胶上进行UV透射照明法观察。也可以使用甲酰胺琼 脂糖凝胶。 实施例3:采用基因特异性RNA引物，诺瓦克病毒-RdRP进行序列依赖型RNA扩增。由0.5 1 )Lig RNA模板、10 (i反应缓冲液(250 mM HEPES、pH 8.0、 15 mM 醋酸镁、20 mM DTT)、 50 U RNase抑制齐U(RNAsin， Promega)、 ATP, CTP， GTP, UTP各0.4 mM、 0.1 1 基因特异性RNA引物、实施例1中制备的3 诺瓦克病毒-RdRP组成的反应混合物(50 W)，在30。C反应2个小时。添加 50 ^tl终止液(4 M乙酸铵、100 mM EDTA)终止反应。苯酚-氯仿抽提法进行纯 化，或采用MEGAclear试剂盒(Ambion)，根据厂家说明进行纯化。转录产物 经溴化乙锭染色后，在TBE缓冲液配制的琼脂糖凝胶上进行UV透射照明法 观察。也可以使用甲酰胺琼脂糖凝胶或脲/聚丙烯酰胺凝胶。实施例4:采用多聚U引物，诺瓦克病毒-RdRP进行细胞mRNA扩增。 由0.5 1 |Lig RNA模板、10 jul反应缓冲液(250 mM HEPES、pH 8.0、 15 mM 醋酸镁、20 mM DTT)、 50 U RNase抑制剂(RNAsin， Promega)、 ATP, CTP, GTP, UTP各0.4mM、 0.1~1 [iMpoly-(U)2。-引物、实施例1中制备的3iiM诺瓦克 病毒-RdRP组成的反应混合物(50 pl)，在3CTC反应2个小时。通过添加50 pi 终止液(4M乙酸铵，100mMEDTA)才终止反应。苯酚-氯仿抽提法进行纯化， 或采用MEGAclear试剂盒(Ambion)，根据厂家说明进行纯化。转录产物经溴 化乙锭染色后，在TBE缓冲液配制的琼脂糖凝胶上进行UV透射照明法观察。 也可以使用甲酰胺琼脂糖凝胶。 实施例5:采用诺瓦克病毒-RdRP进行siRNA的制备。由0.5 1 jug RNA模板、10 ]ul反应缓冲液(250 mM HEPES、pH 8.0、 15 mM 醋酸镁、20 mM DTT)、 50 U RNase抑制剂(RNAsin， Promega)、 ATP, CTP， GTP, UTP各0.4 mM、实施例1中制备的3 诺瓦克病毒-RdRP组成的反应混 合物(50|11)，在30。C反应2个小时。添加50pl终止液(4M乙酸铵、100 mM EDTA)终止反应。苯酚-氯仿抽提法进行纯化，或采用MEGAclear试剂盒 (Ambion)，根据厂家说明进行纯化。转录产物经溴化乙锭染色后，在TBE缓 冲液配制的10X聚丙烯酰胺凝胶上通过UV透射照明法观察。也可以使用甲 酰胺琼脂糖凝胶。也可以使用"wwrW-RNA。实施例6:采用诺瓦克病毒-RdRP进行RNA标记由0.5 1 fig RNA模板、10 pi反应缓冲液(250 mM HEPES、pH 8.0、 15 mM 醋酸镁、20 mM DTT)、 50 U RNase抑制剂(RNAsin， Promega)、 0.4 mM的 ATP或CTP或GTP或UTP、实施例1中制备的3 诺瓦克病毒-RdRP组 成的反应混合物(50 iu])，在30。C反应2个小时。添加50 fil终止液(4 M乙酸 铵、100mMEDTA)终止反应。苯酚-氯仿抽提法进行纯化，或采用MEGAclear 试剂盒(Ambion)，根据厂家说明进行纯化。转录产物经溴化乙锭染色后，在 TBE缓冲液配制的10%聚丙烯酰胺凝胶上通过UV透射照明法观察。也可以 使用甲酰胺琼脂糖凝胶。也可以使用"rmor^-RNA。采用诺瓦克病毒-RdRP，通过poly(C)-poly(G) RNA杂交进行RNA合成。 由0.5~1昭RNA模板、10 jil反应缓冲液(250 mM HEPES、pH 8.0、 15 mM 醋酸镁、20mMDTT)、 50 U RNase抑制剂(RNAsin， Promega)、 50 fiM GTP、 实施例i中制备的3 (LiM诺瓦克病毒-RdRP组成的反应混合物(50 W)，在3(TC 反应2个小时。添加50 pi终止液(4 M乙酸铵、100 mM EDTA)终止反应。苯 酚-氯仿抽提法进行纯化，或采用MEGAclear试剂盒(Ambion)，根据厂家说 明进行纯化。转录产物经溴化乙锭染色后，在TBE缓冲液配制的10%聚丙 烯酰胺凝胶上通过UV透射照明法观察。也可以使用甲酰胺琼脂糖凝胶。也 可以使用arwomi-RNA。
权利要求
1. 一种扩增和/或标记RNA用的RNA依赖的RNA聚合酶，其特征在于，所述的RNA依赖的RNA聚合酶具有“右手螺旋构象”，该RNA依赖的RNA聚合酶的氨基酸序列包括以下基序a.XXDYSb.GXPSGc.YGDDd.XXYGLe.XXXXFLXRXX含义如下D天冬氨酸Y酪氨酸S丝氨酸G甘氨酸P脯氨酸L亮氨酸F苯丙氨酸R精氨酸X任一氨基酸
2. 如权利要求1所述的RNA依赖的RNA聚合酶，其特征在于，所述 的RNA依赖的RNA聚合酶是杯状病毒科(O^c/vzW^e)家族的一种病毒的 RNA依赖的RNA聚合酶。
3. 如权利要求2所述的RNA依赖的RNA聚合酶，其特征在于，所述 的RNA依赖的RNA聚合酶是杯状病毒科(Cfl/^'Wn'^^)家族的人类和/或 非人类病原病毒的RNA依赖的RNA聚合酶。
4. 如权利要求3所述的RNA依赖的RNA聚合酶，其特征在于，所述 的RNA依赖的RNA聚合酶是诺瓦克病毒、沙波病毒、水泡病毒属或兔病毒属的RNA依赖的RNA聚合酶。
5. 如权利要求4所述的RNA依赖的RNA聚合酶，其特征在于，所述 的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶是诺瓦克病毒株如 HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE的诺瓦克病毒株、或沙波病毒株如pJG-SapOl 的沙波病毒株、或水泡病毒株如FCV/Dresden/2006/GE的水泡病毒株的RNA 依赖的RNA聚合酶。
6. 如权利要求4所述的RNA依赖的RNA聚合酶，其特征在于，所述 的RNA依赖的脂A聚合酶是序列SEQ ID NO 1 、 SEQ ID NO 2、 SEQ ID NO 3、 SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的蛋白质。
7. —种使用如权利要求1至6任一项所述的RNA依赖的RNA聚合酶 进行RNA扩增的方法，包括以下歩骤a. RNA依赖的RNA聚合酶与RNA模板在寡核苷酸引物存在或 不存在下退火；b. 通过RNA依赖的RNA聚合酶将RNA模板转录为反义RNA;c. 将RNA/反义RNA双链复合物分离为单链。
8. 如权利要求7所述的RNA扩增的方法，其特征在于，RNA/反义RNA 双链复合物分离为单链是通过热变性、化学变性和/或酶分离完成。
9. 如权利要求8所述的RNA扩增的方法，其特征在于，RNA/反义RNA 双链复合物分离为RNA单链的酶分离是由一种具有将双链RNA分离为单链 RNA活性的酶完成。
10. 如权利要求7至9任一项所述的引物依赖的RNA扩增的方法，其 特征在于，至少使用一种与RNA模板的一部分杂交的引物;RNA依赖的RNA 聚合酶退火后，该引物通过RNA依赖的RNA聚合酶，根据RNA模板序列 被延长。
11. 如权利要求10所述的引物依赖的RNA扩增的方法，其特征在于， 同质聚合或异质聚合RNA引物或DNA引物用作引物。
12. 如权利要求11所述的引物依赖的RNA扩增的方法，其特征在于， 所述的引物为poly-U-RNA、poly-A-RNA、poly-C-RNA或poly-G-RNA引物， 或任意同质聚合寡RNA引物。
13. 如权利要求7至9任一项所述的引物依赖的RNA扩增的方法，其特征在于，没有与RNA模板的一部分杂交的引物，RNA依赖的RNA聚合 酶退火后，通过RNA依赖的RNA聚合酶，根据RNA模板序列被延长。
14. 如权利要求7至9任一项所述的非引物依赖的poly(C)-RNA扩增的 方法，其特征在于，不含有与RNA模板的一部分杂交的引物，GTP为单核 苷酸，在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下，根据RNA模板的序列被延长。
15. 采用如权利要求1至6任一项所述的RNA依赖的RNA聚合酶，进 行RNA标记的方法，包括以下步骤a. RNA依赖的RNA聚合酶与待标记的RNA退火；b. 在待标记RNA的3'-末端添加至少一个核苷酸。
16. 如权利要求1至6任一项所述的RNA依赖的RNA聚合酶在RNA 扩增和/或RNA标记中的应用。
17. —种用于权利要求7所述的RNA扩增的试剂盒，包括以下成分a. 如权利要求1一6任一项所述的RNA依赖的RNA聚合酶；b. 合适的反应缓冲液；c. NTPs;d. 选择组分，RNase抑制剂；e. 选择组分，终止剂。
18. —种用于权利要求9所述的RNA扩增的试剂盒，包括以下成分a. 如权利要求1 一6任一项所述的RNA依赖的RNA聚合酶；b. 合适的反应缓冲液；c. NTPs;d. 选择组分，RNase抑制剂；e. 选择组分，终止剂；f. 解旋酶。
19. 一种用于权利要求10所述的引物依赖的RNA扩增的试剂盒，包括 以下成分a. 如权利要求l一6任一项所述的RNA依赖的RNA聚合酶；b. 合适的反应缓冲液；c. NTPs;d. 选择组分，RNase抑制剂；and Biotechnology, 52, Oundong, Yusong-gu， Daejeon, K0rea)进行了保7藏，保藏 编号为KCTC 10831 BP。冻存核移植胚胎并在需要时可以将核移植胚胎熔化后使用。而且，可以通过将本发明的犬科动物的核移植胚胎移植到代孕母体中生产活体后代而生产克隆的犬科动物。优选地，将本发明的核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中。可以通过本领域任何公知的方法进行移植，优选地，可以使用导管来移植克隆胚胎。在本发明的一个实施例中，首先通过将本发明的核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中生产得到了克隆狗"Snuppy"和"NT-2『(见实施例6)。然而，本发明的一个测试实施例表明如果将本发明的核移植胚胎移植到代孕母体 的子宫中，代孕母体不会怀孕(见测试实施例4)。这说明在生产克隆狗时， 优选将核移植胚胎移植到输卵管中。并且，在将核移植胚胎移植到代孕母体中时，核移植胚胎可以处于1-细胞期、2-细胞期或4-细胞期。核移植胚胎在移植到代孕母体之前可以一直 培养在25^1用矿物质油覆盖的mSOF微滴中。因此，本发明提供了克隆的犬科动物。该克隆的犬科动物具有与核供体 细胞或供体完全相同的基因特性。在本发明的一个实施例中，按照本发明的 方法生产了克隆狗并且采用微卫星分析法分析了其基因特性(见测试实施例 1)。结果发现本发明的克隆狗具有与核供体细胞或供体完全相同的基因特 性(见表6)。如前文所述，本发明提供了一种生产克隆的犬科动物的方法。因此本发 明有助于兽医学、人类学和医学方面研究的发展，如优良犬科动物的繁殖、 稀有或濒危犬科动物的保护、异种移植和疾病动物模型。
全文摘要
本发明涉及一种以基本依赖或不依赖方式，RNA扩增和/或RNA标记用的RNA依赖的RNA聚合酶，方法及试剂盒，特别是，应用于生物技术和医药领域的病毒RNA、真核RNA、原核RNA和双链核糖核酸(RNA)。所述的RNA依赖的RNA聚合酶具有右手螺旋构象，并由以下序列部分的氨基酸序列组成a.XXDYS、b.GXPSG、c.YGDD、d.XXYGL、e.XXXXFLXRXX，含义如下D天冬氨酸、Y酪氨酸、S丝氨酸、G甘氨酸、P脯氨酸、L亮氨酸、F苯丙氨酸、R精氨酸、X任一氨基酸。本发明所涉及的扩增方法尤其适用于微阵列技术、siRNA的制备和通过检测病人样品中的病毒RNA的病毒性感染的诊断。本发明所涉及的标记方法尤其适用于通过亲和连接进行RNA的纯化，及适用于病毒RNA、真核RNA、原核RNA和双链核糖核酸(RNA)的功能和/或结构特征的分子生物学研究中。
文档编号C12N9/12GK101228268SQ200680027028
公开日2008年7月23日 申请日期2006年7月25日 优先权日2005年7月25日
发明者卡特里·耶格尔, 恩诺·雅各布斯, 沃尔弗拉姆·鲁道夫, 雅克·罗哈严 申请人:德累斯顿工业大学