丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3 (map4k3)作为自体免疫疾病、癌症、发炎及il-17相关疾 ...的制作方法
【专利摘要】本发明揭示用于鉴别治疗生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)介导的疾病的治疗剂的方法。揭示用于侦测以化合物调节GLK信号传导的方法。也揭示用于侦测自体免疫疾病及/或癌症的存在及/或严重程度的方法。
【专利说明】丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3 (MAP4K3)作为自体免疫疾
病、癌症、发炎及IL-17相关疾病的生物标记及治疗标的
【技术领域】
[0001 ] 本发明大体上是关于自体免疫性及癌症，且更特定言之，是关于自体免疫反应及GLK/PKC/NF- K B信号传导的调节，以及肿瘤转移。
[0002]本申请案主张2011年7月14日申请的美国临时申请案第61/508，057号的优先权，该案以全文引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0003]NF-κ B为负责调控细胞存活、生长及增殖的基因的主要转录因子。T细胞受体(TCR)接合将诱导NF- K B活化，此与宿主防御感染以及发炎、癌症及自体免疫反应的产生有关。PKC- Θ在IKK-NF- K B活化及T细胞功能中起关键作用。在TCR刺激时，PKC- Θ活化需要SLP-76。然而，负责SLP-76至PKC-Θ的信号传导及活化PKC-Θ的直接激酶仍不清楚。因此，在TCR诱导的NF-K B活化中的最关键问题为鉴别SLP-76与PKC- Θ之间的重要连接。
[0004]PKC- Θ活化需要其在T538处磷酸化。激酶I3DKl与PKC- Θ相互作用，且在TOKl缺乏的T细胞中，PKC- Θ在T538处的磷酸化有缺陷。因此，已提出I3DKl可能会使PKC- Θ在T538处直接磷酸化，但无明确证据表明TOKl在体外实验中直接磷酸化PKC-Θ。此外，PDKl可仅由CD28而非TCR信号传导来活化的观测结果，进一步排除了 TOKl为用于TCR信号传导所诱导的PKC-Θ活化的直接激酶的可能性。因此，在T细胞活化期间直接活化PKC-Θ的激酶仍难以捉摸。
[0005]GCK类激酶(GLK ;也称为丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3 MAP4K3)为MAP激酶激酶激酶激酶(MAP4K)的成员，而该MAP4K为Ste20样丝胺酸/苏胺酸激酶的子族。GLK含有一个N末端激酶结构、一个C末端枸橼同源结构(citron homology domain)及位于中间的若干个富含脯胺酸的基元。GLK对外界压力刺激产生反应，经由MEKKl及MKK4/SEK1来诱导Jnk磷酸化。GLK也经由在胺基酸处理之后活化在上皮细胞株中的mTOR下游效应子S6K1及4E-BP1来调控细胞生长。然而，GLK的调控机制及生理作用基本上未知。
[0006]因此，在此项技术中，迄今为止尚未解决的问题为解决与GLK的调控作用，尤其与前述GLK在TCR信号传导过程中的生理作用有关的机转仍未知。
【发明内容】
[0007]在一个态样中，本发明是关于一种用于鉴别供治疗生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)所介导的疾病的治疗剂的方法。该方法包含侦测由测试化合物进行的对GLK介导的信号传导的调节，其中该侦测步骤包含:a)在测试化合物存在下培养表现GLK的细胞，其中该调节是藉由量测GLK转录物或蛋白质的表现量、所产生的IL-17A的量或NF- κ B的活性来侦测；或13)在测试化合物存在下，使GLK蛋白在ATP存在下与其受质反应，其中该调节是藉由量测所产生的ADP的量、所消耗的ATP的量及/或经磷酸化的受质的量来侦测；或c)在测试化合物存在下培养表现GLK的癌细胞，其中该调节是藉由量测该等癌细胞的迁移/侵袭/创口愈合能力来侦测；或(1)在测试化合物存在下使GLK蛋白与其受质蛋白相互作用，其中该调节是藉由量测GLK与受质蛋白之间的相互作用来侦测?’及e)将在测试化合物存在下的该调节与对照相比较，鉴别用于治疗GLK介导的疾病的治疗剂。
[0008]在另一个态样中，本发明是关于一种用于侦测生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)介导的疾病的存在及/或严重程度的方法。侦测GLK介导的疾病的存在及/或严重程度可包含测定癌症的预后。该方法包含:a)自怀疑患有GLK介导的疾病或癌症的个体获得包含T细胞或癌细胞的样品；b)量测T细胞或癌细胞中GCK类激酶(GLK)的表现量；及c)测定GLK介导的疾病的存在及/或严重程度；其中与对照中GLK的表现量相比，T细胞中或癌细胞中GLK的表现量增加为个体有发展或患上GLK介导的疾病的风险或有癌症复发及/或转移风险的指示。该测定步骤可包含测定癌症的预后。
[0009]由以下较佳实施例的描述结合以下图式，此等及其他态样将显而易知，但可在不背离本发明的新颖概念的精神及范畴的情况下，可在其中进行变化及修改。
[0010]附图将说明本发明之一或多个实施例，且连同书面描述一起用以解释本发明的原理。只要有可能，整个图式中使用相同组件符号指示实施例的相同或类似组件。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1显示GLK与PKC- Θ在T538处直接相互作用且使其磷酸化。(a)在用GLKsiRNA或编码GLK的质体转染的Jurkat T细胞中NF- κ B报导体分析的荧光素酶活性。误差条为一式三份样品的标准偏差(s.d.)。(b)在⑶3刺激之后，小鼠原生T细胞的溶胞物中内源性GLK与PKC- Θ的共免疫沉淀(IP)。NS为正常血清。IB为免疫墨点。(c)经纯化Flag-GLK(表位标签-GLK)及GST-PKC-Θ蛋白的活体外结合分析。ppt为沉淀。(d)使用自经转染的HEK293T细胞分离的Flag-GLK及Myc-PKC- Θ (作为受质)的活体外激酶分析中GLK表现及GLK诱导的PKC-Θ磷酸`化的免疫墨点分析。Jurkat细胞的溶胞物中PKC-Θ的免疫墨点分析被显示为对照色带(右边两个泳道)。(e)使用经纯化Flag-GLK及GST-PKC-Θ蛋白的活体外激酶分析中GLK表现及GLK诱导的PKC- Θ磷酸化的免疫墨点分析。数据表示三个独立实验。
[0012]图2显示SLP-76为GLK的直接上游调控剂。(a)在⑶3刺激之后，小鼠原生T细胞的溶胞物中内源性GLK与SLP-76或PKC-Θ的共免疫沉淀。(b)经纯化Flag-GLK及Flag-SLP-76蛋白的活体外结合分析。(c、d)用空白载体或在有或无SLP_76shRNA的情况下用编码GLK的质体转染(d)，接着不作处理或用抗-CD3抗体处理的J14细胞(c)或JurkatT细胞(d)的溶胞物中Flag-GLK的活体外激酶分析。(e)用空白载体或编码SLP-76的质体加编码GLK或HPKl的质体转染的HEK293T细胞的溶胞物中SLP-76S376磷酸化的免疫墨点分析。箭头为SLP-76S376的磷酸化。数据表示三个独立实验。
[0013]图3显示GLK缺乏的原生T细胞在PKC- Θ -1KK活化及T细胞增殖方面有缺陷。(a、b)在CD3 (a)或CD3加CD28 (b)刺激之后，经纯化T细胞的溶胞物中GLK、p-PKC- Θ、PKC- Θ、IKK、p-Erk、Erk、p-PDKl、PDKl及微管蛋白的免疫墨点分析。(c)在用抗-CD3抗体且接着用离子霉素(1no)刺激的经纯化小鼠T细胞中钙指示剂Fluo-4的流动式细胞测量术。(d、e)自用抗-⑶3抗-体或PMA加离子霉素处理72小时的野生型或GLK缺乏的小鼠分离的⑶3+T细胞的[3H]胸苷并入分析(d)及CFSE型态(e)。显示了藉由Flowjo软件所分析的增殖指数(平均值土 s.e.m)。(f)在用空白载体(pCMV-GFP)或GFP-GLK转染的野生型及GLK缺乏的T细胞中的[3H]胸苷并入分析。WT为野生型；GLK-K0为GLK缺乏的小鼠。数据表示三个独立实验(误差条(d、f)，s.e.m.)。
[0014]图4显示在GLK缺乏的小鼠中活体内T细胞依赖性免疫反应削弱。(a、b)自KLH免疫小鼠分离且活体外用KLH再刺激3天的KLH再刺激的淋巴结细胞的培养物上清液中的CFSE稀释度分析(a)以及IFN- y、IL_2及IL-4的ELISA分析(b)。显示了藉由FlowJo软件分析的增殖指数(平均值)。(c、d)在初次免疫的后14天(c)或二次免疫的后7天(d)，小鼠血清中硝基苯酚特异性抗体(NP特异性Ab)产生的ELISA分析，n=6。(e)在B6背景(约97%)中F5的GLK缺乏的小鼠及其野生型同窝出生仔鼠中的EAE诱发。显示了小鼠的临床评分(I至5)。n=7。(f)来自第14天的MOG免疫小鼠的脑及脊髓的浸润性TH17细胞(经⑶45闸控)的流动式细胞测量术。(g)MOG免疫小鼠的血清中IL-17含量的ELISA分析。n=6。(h)活体外分化的TH17细胞中产生IL-17的⑶4T细胞的流动式细胞测量术。(i)以3:1(左图)或9:1(右图)的比率用Treg细胞加经抗-⑶3涂布的珠粒培养的反应性T细胞中，由野生型或GLK缺乏的Treg细胞进行的⑶3+T细胞(用胞内染料CFSE标记)抑制，以CFSE稀释度呈现。数据以来自三个(图b、e、f及h)或两个(图a、c、d、g及i)独立实验的平均值土 s.e.m.形式呈现。*为P值〈0.05广为P值〈0.001。
[0015]图5显示在来自SLE患者的T细胞中诱导GLK表现及PKC- Θ -T538磷酸化。(a)来自49个SLE患者及35个健康对照(HC)的PBL中表现GLK(GLK+)的淋巴细胞的流动式细胞测量术分析；来自SLE患者的结果(SLEDAI=20)作为代表显示。(b) SLEDAI与来自所有SLE患者的表现GLK的T细胞的百分比之间的正相关性及显著回归(皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient):r=0.773 ;简单线性回归:Υ=_0.886+0.3901X,回归相关系数:经调整的R2=0.597，P值=1.08Χ10_17)。(c) SLEDAI与来自具有高GLK+百分比(≥21%)的SLE患者的GLK+T细胞的百分比之间的高相关性及显著回归。(n=16 ;皮尔逊相关系数:r=0.807 ;简单线性回归:Y=5.2085+0.2757Χ，回归相关系数:经调整的R2=0.626，P值=0.000159)。(d)来自5个随机取样的SLE患者及5个健康对照的PBL的溶胞物中GLK、P-PKC- θ、ρ-ΙΚΚ及微管蛋白的免疫墨点分析。各患者的SLEDAI示于图下方。针对微管蛋白校正相对倍数变化且示于图底部。(e)来自代表性SLE患者及健康对照的PBL中磷酸化-PKC- Θ或磷酸化-1KK阳性(经CD3闸控)细胞的流动式细胞测量术(参见图a)。数据表示至少三个独立实验(d、e)。
[0016]图6显示在TCR信号传导期间GLK诱导的PKC- Θ /NF- κ B活化的图解。在TCR连接反应之后，活化的Lck被募集至TCR复合物且使CD3的基于免疫受体酪胺酸的活化基元(ITAM)磷酸化，从而引起Zap70募集及活化。Zap70活化可诱导近端SLP-76信号传导复合物的组装。SLP-76与GLK直接相互作用且为GLK激酶活化所需。活化的GLK与PKC- Θ在T538处直接相互作用且使其磷酸化，从而引起PKC- Θ膜转位及激酶活化。活化的PKC- Θ又诱导IKK/NF- κ B信号传导级联的活化。在癌细胞中，GLK经由PKC/NF- κ B信号传导或非PKC依赖性信号传导来诱导迁移/侵袭/转移。
[0017]图7显示当TCR刺激时GLK会诱导T细胞中NF- κ B活化。(a)用抗-CD3抗体刺激15分钟的载体、GLK或GLK(KD)突变体表现型Jurkat T细胞的溶胞物中GLK、ρ-ΙΚΚ、IKK、p-Erk、Erk、p-mTOR、mTOR及微管蛋白的免疫墨点分析。(b)在TNF-α刺激之后，用空白载体或GLK siRNA转染的Jurkat细胞的NF- κ B报导体分析(左图)。在抗-⑶3刺激之后，用空白载体、编码GLK的质体或GLK siRNA转染的Jurkat T细胞的溶胞物中GLK及微管蛋白的免疫墨点分析。(c)自用抗-⑶3抗体刺激的表现Flag-GLK的J-TAg T细胞分离的GLK的活体外激酶分析。箭头为GLK自体磷酸化。IP为免疫沉淀。IB为免疫墨点。(d)在⑶3刺激30分钟之后用编码GLK或GLK(KD)突变体的质体转染的J-TAg T细胞的溶胞物中GLK、p-PKC- Θ、PKC- Θ及微管蛋白的免疫墨点分析。(e)用指定空白载体、编码GLK的质体、单独GLK或PKC- Θ siRNA或用编码GLK的质体加PKC- Θ siRNA转染的Jurkat T细胞的NF- κ B报导体分析。在有或无抗-CD3抗体的情况下刺激细胞2小时。数据表示三个独立实验。*为P值〈0.05广为P值〈0.001。图(b)及(e)中的误差条为一式三份样品的标准偏差(s.d.)。数据表示至少三个独立实验。
[0018]图8显示GLK与PKC-Θ相互作用。(a)用空白载体或者编码GLK的质体加或不加编码PKC- Θ的质体转染的HEK293T细胞的溶胞物中GLK及PKC- Θ的共免疫沉淀(IP)及免疫墨点(IB)分析。(b、c)用5 μ g/ml抗-CD3抗体刺激的表现Flag-GLK的J-TAg (b)或EL4 (c) T细胞的溶胞物中Flag-GLK及内源性PKC-Θ的共免疫沉淀(上图)。预免疫沉淀样品中GLK、p-PKC- Θ ,PKC- Θ及微管蛋白的免疫墨点分析(下图)。数据表示至少三个独立实验。
[0019]图9显示经由酪胺酸磷酸化介导GLK与SLP-76之间的相互作用。(a)用空白载体或编码SLP-76的质体加编码GLK的质体转染的HEK293T细胞的溶胞物中GLK及SLP-76的共免疫沉淀(IP)及免疫墨点(IB)分析。(b)用抗-⑶3抗体刺激的过度表现Flag-SLP-76的J-TAg T细胞的溶胞物中SLP-76及GLK的共免疫沉淀。(c)用Flag-GLK转染的J-TAgT细胞中抗-⑶3诱导的SLP-76/GLK/PKC- Θ相互作用的共免疫沉淀。(d)用编码SLP-76的质体加空白载体或编码GLK的质体转染的HEK293T细胞的溶胞物中GLK及SLP-76的共免疫沉淀。将细胞用/不用酪胺酸磷酸酶抑制剂过钒酸盐或丝胺酸/苏胺酸磷酸酶抑制剂冈田井酸(okadaic acid)预处理。数据表示至少三个独立实验。
[0020]图10显示TCR诱导的GLK活化不需要Vavl。自用或不用抗-⑶3抗体刺激30分钟的Vavl shRNA基因表现阻断的J`urkat T细胞(shVavl a_c)分离的Flag-GLK的活体外激酶分析。MBP被用作受质。数据表示至少三个独立实验。
[0021]图11显示在GLK缺乏的小鼠中T细胞发育正常。(a)基因捕获载体的结构。β-geo为与β -半乳糖苷酶及新霉素磷酸转移酶基因的融合物；SA为剪接受体；具有数字的方框为GLK的外显子；点线箭头为PCR的引子。(b)来自小鼠尾巴的基因组DNA中GLK野生型及突变体对偶基因的PCR分析。较高色带(1400bp)的PCR产物表示野生型(WT)对偶基因，且较低色带(1000bp)表示GLK突变体对偶基因。(c-e)来自野生型及GLK缺乏(GLK-KO)的小鼠的胸腺(C)、脾脏(d)及淋巴结(e)的T淋巴细胞的流动式细胞测量术分析。数据以平均值土s.e.m形式呈现。(f)用抗-⑶3-生物素及抗生蛋白链菌素刺激的小鼠T细胞的溶胞物中61^、？-?11^1、？^、1^(^及微管蛋白的免疫墨点分析。(g)经纯化T细胞中T细胞增殖的CFSE稀释度分析。也显示了藉由Flowjo软件分析的增殖指数(平均值土s.e.m)。数据表示至少三个独立实验(b至g)。
[0022]图12显示1'111及1'112的分化藉由61^缺乏而削弱。产生正^丫、产生11^-4及？(《?3阳性⑶4+T细胞的流动式细胞测量术。数据以平均值土 s.e.m形式呈现。数据表示至少三个独立实验。
[0023]图13显示在SLE患者中血清IL-17含量增加。(a) SLE患者及配对健康对照的型态。数据以平均值土 s.d形式呈现。(b) SLE患者及健康对照(HC)的血清中IL-17、TNF-a及IL-6的ELISA分析。
[0024]图14显示在GLK缺乏的小鼠中CIA的诱导削弱。⑷平均临床评分土SEM，比较了 GLK缺乏的小鼠与野生型(WT)小鼠之间的疾病发展。在胶原蛋白免疫之后，每周对动物评分一次。n=5。(B) 二次免疫之后第7天获得后腿关节。(C)藉由ELISA分析来测定免疫之后第7天来自GLK缺乏的小鼠及WT小鼠的血清IL-1 β含量。(D及Ε)藉由ELISA分析来测定二次免疫之后第7天来自小鼠的血清IL-6⑶及IL-17A(E)含量。*为p〈0.05广为p〈0.010
[0025]图15显示来自RA患者的周边血液T细胞中的GLK蛋白及mRNA含量增加。(A)来自5个随机取样的RA患者及两个健康对照(HC)的经纯化周边血液T细胞中GLK及磷酸化PKC-Θ (p-PKC- Θ )的免疫墨点分析。针对GAPDH校正GLK的相对倍数变化且示于图底部。(B) 11个RA患者与5个HC之间GLK表现量的比较。数据以针对GAPDH进行校正的GLK的相对倍数变化形式呈现。P=0.047。(C) 12个RA患者及13个HC的经纯化周边血液T细胞中GLK信使RNA (mRNA)的含量。数据表示为GLK与肽基脯胺酰异构酶A (PPIA) mRNA转录物的比率。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。p=0.0029。
[0026]图16显示来自RA患者的滑液及滑膜组织的T细胞中GLK的过度表现。(A)来自代表性RA及OA患者的滑液白血球中GLK及p-PKC- Θ的免疫墨点分析。(B)代表性RA及OA患者的滑液中经CD3闸控的GLK阳性T细胞的流动式细胞测量术分析。(C)两个RA及两个OA患者的滑膜组织中抗-GLK (蓝色)及抗-CD3(棕色)的免疫组织化学染色。箭头表示表现GLK的T细胞。
[0027]图17显示来自RA患者的滑液及周边血液的T细胞中GLK、PKC_ Θ及⑶3的共定位分析。(A)藉由TCS SP5 (LEICA)共焦`系统进行的RA及OA患者的滑液T细胞中GLK、PKC_ Θ及⑶3的共焦显微术。(B)藉由TCS SP5 (LEICA)共焦系统进行的RA患者及HC的周边血液T细胞中GLK、PKC- Θ及⑶3的共焦显微术。
[0028]图18显示RA患者的周边血液T细胞中GLK、p-PKC- Θ及p-ΙΚΚ的发炎性细胞激素含量及共存性增加。藉由ELISA分析来测定RA患者及健康对照中(A) TNF-a、(B) IL-6及(C) TGF-β的血清含量。(D)来自代表性RA患者及健康对照(HC)的周边血液白血球的GLK/p-PKC- θ /ρ-ΙΚΚ阳性细胞的流动式细胞测量术分析。对⑶3阳性T细胞闸控且接着藉由流动式细胞测量术进行分析。(E) 30个RA患者与24个HC的间经CD3闸控的T细胞中GLK表现的比较。误差条表示平均值的95%信赖区间。*为ρ〈0.05 ；**为ρ〈0.01。
[0029]图19显示表现GLK的T细胞频率与RA疾病活动度的相关性。显示了来自所有RA患者的以下的正相关性及显著回归:(A)压痛关节计数(TJC)与表现GLK的T细胞的频率之间(皮尔逊氏相关系数:r=0.500 ;简单线性回归:Y=0.274Χ-0.402，ρ=0.005) ； (B)红血球沉降速率(ESR)与表现GLK的T细胞的频率之间(皮尔逊氏相关系数:r=0.400 ；简单线性回归:Υ=1.113X+9.602，ρ=0.003) ; (C)C反应蛋白(CRP)与表现GLK的T细胞的频率之间(皮尔逊氏相关系数:r=0.330;简单线性回归:Y=0.059Χ-0.271, ρ=0.015)；(D)DAS28与表现GLK的T细胞的频率之间(皮尔逊氏相关系数:r=0.606 ;简单线性回归:Υ=0.065Χ+3.575，ρ=0.005)。(E)来自30个患者中的26个的DAS28与表现GLK的T细胞的频率之间的相关性及显著回归(皮尔逊氏相关系数:r=0.713 ;简单线性回归:Y=0.061X+3.6158，p=0.0000639)。
[0030]图20显示来自成人发作型史迪尔氏病(AOSD)患者及健康对照(HC)的T细胞中的GLK表现量。自I个AOSD患者(A)及I个健康对照(B)的周边血液获得⑶3+T细胞、⑶4+T细胞及CD8+T细胞中细胞内GLK产生的流动式细胞测量术等高线图的代表性实例。自24个活动期AOSD患者及12个HC获得循环的表现GLK的⑶3+T细胞的频率(C)。AOSD患者与HC之间GLK转录物的相对表现量的比较(D)。来自AOSD患者及HC的周边血液T细胞的溶胞物中GLK表现的免疫墨点分析(E)。活动期AOSD患者与HC之间GLK蛋白的相对表现量的比较(F)。横条表示中值。乍值是藉由曼-惠特尼U测试来测定。
[0031]图21显示来自患成人发作型史迪尔氏病(AOSD)的活动期患者及健康对照(HC)的包括IL-1 β (A)、IL-6 (B)、IL-17A(C)及TNF-α⑶的发炎性细胞激素的血清含量的比较。横条表示中值。?值是藉由曼-惠特尼U测试来测定。
[0032]图22显示来自24个成人发作型史迪尔氏病患者的循环的表现GLK的T细胞的频率与疾病活动度评分(A)及活动度参数之间的相关性，该等活动度参数包括血清铁蛋白含量⑶、C反应蛋白(CRP)含量(C)及可溶性介白素-2受体含量⑶，以及包括IL-1 β (E)、IL-6 (F), TNF-a (G)及IL-17A⑶的细胞激素的血清含量。藉由非参数斯皮尔曼氏秩相关性测试获得相关系数(Y )及P值。
[0033]图23显示在有效疗法之后12个AOSD患者中循环的表现GLK的T细胞含量、GLK蛋白以及转录物的表现量及可溶性介白素-2受体(SIL-2R)的血清含量的变化。数据以平均值土SEM形式呈现。*p〈0`.005(相对于治疗之前)，藉由威尔科克森符号秩测试测定。
[0034]图24显示来自自体免疫疾病患者的T细胞中的GLK过度表现。来自僵直性脊椎炎(AS)、休格连氏症候群(Sjdgren's syndrome, SS)、秃发症、成人发作型史迪尔氏病(AOSD)及视神经脊髓炎(NMO)患者的经纯化T细胞的溶胞物中GLK及GAPDH的免疫墨点分析。HC:健康对照。
[0035]图25显示来自格雷氏病患者的T细胞中的GLK过度表现。a.来自格雷氏病(GD)患者及健康对照(HC)的经纯化T细胞的溶胞物中GLK及GAPDH的免疫墨点分析。b.显示HC(n=3)与GD(n=7)之间的相对GLK表现的定量聚合酶链反应。
[0036]图26显示格雷氏病患者中GLK阳性T细胞的增长百分比。来自患格雷氏病(⑶)的个体及健康对照(HC)的周边血液的表现GLK的T淋巴细胞的流动式细胞测量术分析。
[0037]图27显示大多数过度表现GLK的T细胞为产生IL-17的细胞。a.藉由ELISA分析来测定SLE患者及健康对照的血清IL-17含量。b.来自代表性SLE患者(SLEDAI=12)的周边血液的GLK/IL-17双阳性T细胞(经⑶3闸控)的流动式细胞测量术分析。c.来自HC及SLE患者的T细胞(经⑶3闸控)中或T细胞子集(个别经闸控)中GLK/IL-17双阳性细胞的百分比。d.对双阴性、CD4阳性或CD8阳性T细胞进行闸控，且接着藉由流动式细胞测量术分析来自SLE患者的PBL的GLK/IL-17双阳性细胞。显示了不同子集中GLK/IL-17双阳性细胞的百分比。
[0038]图28显示Lck-GLK转殖基因(Tg)小鼠自发地发展自体免疫疾病。a.Lck-GLK Tg小鼠的表型:大部分Lck-GLK Tg小鼠显示虚弱的尾巴及后腿。GLK表现高的Lck-GLK Tg小鼠在13周龄时死亡。Lck-GLK Tg小鼠患上白内障及眼盲。b.及c.藉由ELISA分析来侦测Lck-GLK Tg小鼠的血清自体抗体。抗核抗体指示SLE。类风湿因子指示RA。
[0039]图29显示Lck-GLK转殖基因(Tg)小鼠显示出IL-17A含量增加。a.由ELISA分析来量测小鼠的血清细胞激素(5周龄)(n=8)。b.藉由Taqman探针使用即时PCR测定来自Lck-GLK Tg小鼠组的周边T细胞中GLK及IL-17A的mRNA含量(n=6)。
[0040]图30显示非小细胞肺癌中的GLK过度表现。来自肺癌患者的肺组织中GLK、p_IKK、p-mTOR的免疫墨点分析。n=20。T:肿瘤部分；N:正常部分。
[0041]图31显示食道癌中的GLK过度表现。来自患者的食道癌样品中GLK的免疫墨点分析。n=31。T:肿瘤部分；N:正常部分。
[0042]图32显示胰脏导管腺癌中的GLK过度表现。在正常胰腺及胰脏导管腺癌(PDA)中进行GLK染色。(A)正常胰腺、⑶I级PDA、(C) 2级PDA及⑶3级PDA的代表性影像均来自包埋石蜡的组织。原始放大倍数为X 20。
[0043]图33显示肝细胞癌中的GLK过度表现。在正常肝脏及肝细胞癌中进行GLK染色。(A)正常肝脏、(B) I级肝细胞癌、(C)3级肝细胞癌及(D) (C)的放大影像的代表性影像。原始放大倍数为X 20。
[0044]图34显示乳癌中的GLK过度表现。在正常乳房及乳癌中进行GLK染色。(A)正常乳房、(B) 2级T2N0M0期乳癌、(C) 2级T2N1M0期乳癌的代表性影像。原始放大倍数为X 20。
[0045]图35显示神经胶母细胞瘤中的GLK过度表现。正常脑组织、人类神经胶母细胞瘤(II级至IV级)及两种脑肿瘤 细胞株(U-87MG及T98G)中GLK蛋白表现的免疫墨点分析。
[0046]图36显示在非小细胞肺癌患者中GLK蛋白表现高可预示早期复发。在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中GLK蛋白含量高(GLK高)与早期复发相关。
[0047]图37显示GLK过度表现可增强自发性侵袭。用载体(上图)、GLK (中图)或shRNA-GLK(下图)短暂转染H1299细胞，保持24小时。转染之后，藉由侵袭小室(transwell)分析来检查此等细胞。10%至10%血清为自发性侵袭。0%至10%血清为血清诱导的侵袭。
[0048]图38显示GLK的过度表现可促进细胞迁移(创口愈合)。用指定质体转染H1299细胞且培养直至汇合。用P200吸液管尖端以直线刮擦细胞单层产生“创口”且藉由用生长培养基洗漆细胞来移除创口的碎片。培育指定时间点之后，在相差显微镜(phase-contrastmicroscope)下获得影像。
[0049]图39显示使用ATP-GL0?激酶套组(a)或ADP-GL0?激酶套组(b)或放射性激酶分析(c)对自BL21大肠杆菌(E.coli) (His-GLK-KD)或自Sf9昆虫细胞中的杆状病毒(GST-GLK)分离的GLK激酶结构域(GLK-KD)重组蛋白进行的活体外激酶分析。
[0050]图40显示GLK与PKC- Θ之间的相互作用。(a)短暂转染的HEK293T细胞中CFP-GLK与YFP-PKC-Θ之间的直接相互作用的FRET分析。(b)藉由放大发光亲近均质分析(ALPHA)测定的短暂转染的HEK293T细胞的溶胞物中Flag-GLK与Myc-PKC- Θ之间的相互作用的信号。
【具体实施方式】[0051]定义
[0052]本说明书所使用的术语一般具有其在此项技术中、在本发明的上下文中及在使用每一术语的特定上下文中的普通含义。用于描述本发明的某些术语将在下文或在说明书别处进行讨论，以向从业者提供关于本发明的描述的额外指导。为方便起见，可例如使用斜体字及/或引号突出某些术语。使用突出对术语范畴及含义没有影响；无论术语是否突出，在相同上下文中其范畴及含义均相同。应了解相同情况可以一种以上方式表达。因此，对于本文所讨论的该等术语中的任一者或多者，可使用替代性语言及同义词，无论术语在本文中是否经详细描述或讨论，其均不具有任何特殊意义。提供某些术语的同义词。一或多个同义词的叙述并不排除其他同义词的使用。在本说明书中任何地方使用实例(包括本文所讨论的任何术语的实例)仅为说明性的，且决不限制本发明或任何例示术语的范畴及含义。同样，本发明不限于本说明书中给出的各种实施例。
[0053]除非另外定义，否则本文中所使用的所有科技术语均具有与一般熟习本发明所属领域的技术者通常所了解相同的含义。在出现矛盾的情况下，以本文献(包括定义)为准。
[0054]如本文所用，“大约”、“约”或“大致”一般应意谓在给定值或范围的20%内，较佳在10%内，且更佳在5%内。本文给定的数字量为近似值，意谓若未明确说明，则可表示术语“大约”、“约”或“大致”。
[0055]视上下文而定，术语“对照”可指健康、正常的样品或细胞，或指在不存在测试化合物下所进行的测试。将自患者个体的T细胞获得的量测值与自健康正常个体的T细胞获得的对照量测值相比较。将自患者的癌细胞获得的量测值与自相同患者或健康正常个体的非肿瘤组织样品的非癌症、正常细胞获得的对照量测值相比较。
[0056]术语“GLK信号传导”是指GLK介导的信号传导，也即GLK-PKC- Θ -1KK-NF- κ B-1L17A 信号传导。
[0057]FLAG标签或FLAG多肽为可使用`重组DNA技术添加至蛋白质中的多肽蛋白质标签。FLAG标签可用于需要藉由抗体识别的许多不同分析中。FLAG标签的肽序列为:N-DYKDDDDK-C。myc标签为可使用重组DNA技术添加至蛋白质中的源自c_myc基因产物的多肽蛋白质标签。myc标签的肽序列为:N-EQKLISEEDL-C。
[0058]当GLK及PKC-Θ蛋白用允许荧光能量由一个荧光探针转移至另一个的不同的兼容性荧光探针标记时，在GLK结合于(也即以物理方式缔合于)PKC-Θ蛋白时发生荧光能量转移。第一荧光探针具有较低激发波长，且第二荧光探针具有较高激发波长。第一荧光探针的发射波长与该较高激发波长重迭，且因此将激发第二荧光探针且导致在较高波长下发射。若测试化合物干扰GLK结合于PKC- Θ，则不会出现荧光能量转移，且不会出现较高波长的荧光发射。
[0059]本文所用缩写的全名如下:复发性风湿症(PMRA);佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA);周边血液白血球(PBL);生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)。
[0060]本发明是关于发现GLK在TCR信号传导级联中的作用。已发现GLK为直接连接SLP-76至PKC-Θ的信号传导的激酶。
[0061]智人生发中心激酶相关蛋白激酶(GLK)的胺基酸序列为SEQ ID NO: 1，且核苷酸序列为SEQ ID N0:2。褐家鼠(Rattus norvegicus)有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3 (Map4k3)的胺基酸序列为SEQ ID NO: 3，且核苷酸序列为SEQ ID N0:4。蛋白激酶C Θ (人类)的胺基酸序列为SEQ ID NO:5且核苷酸序列为SEQ ID N0:6。小家鼠(Mus musculus)蛋白激酶C Θ的胺基酸序列为SEQ ID NO:7且核苷酸序列为SEQ ID N0:8。
[0062]筛检化合物的方法
[0063]基于蛋白质的分析:放射性/非放射性活体外激酶分析
[0064]放射性活体外激酶分析:重组GLK蛋白与10 μ Ci [Y」2Ρ]ΑΤΡ、4 μ g髓鞘碱性蛋白(MPB)及500 μ M冷ATP于35 μ I激酶缓冲液中在室温培育40分钟。藉由12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-page)分离样品；且藉由台风(Typhoon)扫描仪定量并入受质中的放射性标记的磷酸酯。
[0065]非放射性活体外激酶分析:非放射性活体外激酶分析是在96孔白色微量多孔盘Proxiplate (拍金埃尔默(PerkinElmer),波士顿(Boston),马萨诸塞州(MA))中以 100 μ I总体积进行。为测定在GLK激酶反应后产生的ADP量，重组GLK蛋白(2yg;自大肠杆菌或经杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞分离)与10 μ g MPB及2 μ M ATP于25 μ I激酶缓冲液中在室温培育40分钟。添加ADP-Glo?试剂(25 μ I ;普洛麦格(Promega))。在培育40分钟后，添加激酶侦测试剂(50 μ I)且培育30分钟。由EnVision多标记读取器(珀金埃尔默生命科学部(PerkinElmer life Science))测量发光强度。为测定在GLK激酶反应后所消耗的ATP量，重组GLK蛋白(0.2-1 μ g)与10 μ g MPB及2 μ M ATP于25 μ I激酶缓冲液中在室温培育40分钟。添加ATP-Glo?试剂(25 μ I ；Promega)，培育10分钟。由EnVision多标记读取器(PerkinElmer life Science)测量发光强度。
[0066]基于细胞的分析:藉由IL-17A ELISA或NF- κ B活性报导体分析来测定使用稳定的经GLK转染的细胞进行的药物筛检。
[0067]建立稳定的经GL`K转染的细胞:使用Neon (氖)转染系统(InvitrogenCorporation),将GLK质体及p_NF_ κ B一Luc-潮霉素质体转染至Jurkat细胞内。为选择稳定的经GLK转染的细胞，在含有新霉素的RPM1-1640中培养GLK转染的细胞至少2周。
[0068]IL-17A酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)。在RPMI培养基(200 μ I)中培育稳定的经GLK转染的Jurkat细胞(在96孔盘中每孔106个)72小时。藉由人类IL-17AELISA(PeproTech)测定上清液中的IL-17A含量。
[0069]荧光素酶报导体分析的NF- κ B活性:将IO6个稳定的经GLK转染的Jurkat细胞再悬浮于60 μ I RPMI培养基加60 μ I溶解/荧光素酶缓冲液(Promega)中。数据表示萤火虫荧光素酶活性的平均值，误差条为S.D.。
[0070]Transwell迁移及侵袭分析=Transwell迁移分析是使用接种于未涂布的顶部腔室(24孔培养插入板(insert);孔径8 μ m ;美国康宁Corning Costar)中且培养16小时的IX IO5个细胞。侵袭分析是使用在涂布基质胶的顶部腔室(BD Bioscience)上且培育24-48小时的I X IO5个细胞。用棉签刮去保留于transwell上侧的未侵袭细胞。藉由4%三聚甲醛快速固定在培养插入板过滤器下侧上的细胞10分钟，且接着用1%结晶紫染色20分钟。在光学显微镜下对在过滤器下侧上的细胞数进行计数。结果表示为每10个领域的迁移或侵袭性细胞的数目。
[0071]创口愈合分析(细胞迁移):用载体(无转殖基因的空白载体)、pCIneo-GLK(具有GLK转殖基因的质体)或shRNA-GLK (具有GLK转殖基因的shRNA的质体)转染人类肺癌H1299细胞。应使此等细胞单层完全汇合。用p200吸液管尖端制造两个平行的刮痕创口。使用相差显微术观测创口。在O至24小时过程内，以规律的时间间隔获取在创口相交处侧面的两个区域的影像。
[0072]蛋白质-蛋白质相互作用分析:荧光共振能量转移(FRET)分析及放大发光亲近均质分析(ALPHA ；PerkinElmer)。
[0073]荧光共振能量转移(FRET)分析:用CFP-GLK及YFP-PKC- Θ质体转染HEK293T细胞，且24小时后使用EnSpire 2300多标记读取器(Perkin Elmer)测定荧光强度。在432nm下激发CFP ;量测所得在485nm下发射的荧光强度。在485nm下激发YFP ;量测所得在540nm下发射的荧光强度。在432nm下激发FRET信号；量测所得在540nm下发射的荧光强度。
[0074]放大发光亲近均质分析(amplified luminescent proximity homogeneousassay, ALPHA):AlphaScreen 结合分析是在 384 孔白色 Proxiplate (PerkinElmer,波士顿(Boston),马萨诸塞州(MA))中以20 μ I总体积进行。AlphaScreen Flag侦测套组是来自PerkinElmer Life Science。AlphaScreen供体珠粒是以涂布Flag (表位标签)的形式提供，且使受体珠粒与抗-Myc抗体接合。在384孔培养盘(5微升/孔)中将经纯化Flag-GLK加Myc-PKC- Θ或Flag-SLP-76加Myc-GLK混合在一起。若使用HEK293T转染株，则每孔添加0.2 μ g溶胞物。添加受体珠粒(5微升/孔)且培育30分钟。随后添加供体珠粒(5微升/孔)且培育3小时。由EnVision多标记读取器(PerkinElmer life Science)测定ALPHA信号。供体及受体珠粒的最终浓度为20 μ g/ml。所有稀释均在HEPES缓冲液(IOmMHEPES (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、150mM NaCl (氯化钠)、0.05%Tween_20 (吐温 _20)、0.5mMDTT(二硫苏糖醇))中进行。
[0075]发现GLK过度表现与癌症及转移相关。该GLK介导的癌症及转移不涉及哺乳动物雷帕霉素标的(mTOR)。本发明是关于以下发现=GLK-PKC- Θ -1KK-NF κ B-1L-17信号传导路径适用作癌症预后生物标记及GLK介导的疾病的治疗标的。
[0076]在一个态样中，本发明是关于一种用于鉴别供治疗生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)介导的疾病的治疗剂的方法。该方法包含侦测由测试化合物进行的对GLK介导的信号传导的调节，其中该侦测步骤包含:a)在测试化合物存在下培养表现GLK的细胞，其中该调节是藉由量测GLK转录物或蛋白质的表现量、所产生的IL-17A的量或NF-κ B的活性来侦测；或13)在测试化合物存在下，使GLK蛋白在ATP存在下与其受质反应，其中该调节是藉由量测所产生的ADP的量、所消耗的ATP的量及/或磷酸化的受质的量来侦测；或c)在测试化合物存在下培养表现GLK的癌细胞，其中该调节是藉由量测该等癌细胞的迁移/侵袭/创口愈合来侦测；或(1)在测试化合物存在下使GLK蛋白与其受质蛋白相互作用，其中该调节是藉由量测GLK与受质蛋白之间的相互作用来侦测?’及e)将在测试化合物存在下的该调节与对照相比较，鉴别用于治疗GLK介导的疾病的治疗剂。GLK与受质蛋白(诸如PKC-Θ蛋白)之间的相互作用可藉由使用荧光共振能量转移(FRET)分析或放大发光亲近均质分析来量测。
[0077]在前述步骤d)中，受质可包含PKC-Θ蛋白，且该等GLK及PKC-Θ蛋白经不同的兼容性荧光探针标记，一个探针的荧光激发及发射波长高于另一个探针，且该经调节的缔合藉由较高荧光发射波长下的变化来侦测。
[0078]ATP可为非放射性ATP或可用放射性同位素标记。GLK蛋白与受质的相互作用可在细胞内或在活体外于试管中发生。GLK介导的疾病可选自由自体免疫疾病、发炎性疾病、癌症及癌症转移组成的群。受质可选自由PKC-Θ蛋白及髓鞘碱性蛋白(MBP)组成的群。测试化合物可选自由RNAi分子、微RNA、反义分子及小有机分子组成的群。表现GLK的细胞可包含表现GLK的T细胞，及/或表现GLK的癌细胞可包含表现GLK的肺癌细胞。表现GLK的细胞可包含过度表现GLK的细胞，诸如过度表现GLK的T细胞，及/或表现GLK的癌细胞可包含过度表现GLK的癌细胞，诸如过度表现GLK的肺癌细胞。
[0079]自体免疫疾病可选自以下不同疾病:全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、成人发作型史迪尔氏病(adult-onset Still' s disease)、葛瑞夫兹氏病(Graves' disease)、休格连氏症候群(Sjogren' s syndrome)、僵直性脊椎炎、视神经脊髓炎、自体免疫性脑脊髓炎及秃发症。癌症可选自以下不同疾病:肺癌、食道癌、神经胶母细胞瘤、胰脏癌、乳癌及肝癌。在本发明的一个实施例中，该癌症为一类GLK蛋白介导的癌症且与哺乳动物雷帕霉素标的(mTOR)蛋白质无关(或不涉及)。
[0080]在另一个态样中，本发明是关于一种用于侦测生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)所介导的疾病的存在及/或严重程度的方法。侦测GLK介导的疾病的存在及/或严重程度可包含测定癌症(诸如肺癌)的预后。该方法包含:a)自怀疑患有GLK介导的疾病或癌症的个体获得包含T细胞或癌细胞的样品；b)量测T细胞中或癌细胞中GCK类激酶(GLK)的表现量 '及c)测定GLK介导的疾病的存在及/或严重程度；其中与对照中GLK的表现量相t匕，T细胞中或癌细胞中GLK表现量的增加为个体有发展或患上GLK介导的疾病的风险或有癌症复发及/或转移风险的指示。该测定步骤可包含测定癌症的预后。在本发明的一个实施例中，癌细胞中GLK表现量的增加与哺乳动物雷帕霉素标的(mTOR)蛋白质无关。
[0081]该量测步骤可包含量测T细胞中GLK蛋白的表现量,及/或藉由免疫墨点分析、流动式细胞测量术分析及/或免疫组织化学进行。或者，该量测步骤可包含量测GLK转录物的表现量，其可进一步包含针对管家基因校正所量测的GLK转录物的表现量，以获得经校正的GLK转录物表现量。
`[0082]实例
[0083]不意欲限制本发明的范畴，下文给出了本发明实施例的例示性仪器、装置、方法及其相关结果。应注意，为方便读者，在实例中可使用标题或副标题，其决不应限制本发明的范畴。此外，本文提出并揭示了某些理论；然而无论其对抑或不对，其决不应限制本发明的范畴，只要本发明在不考虑任何特定理论或操作方案的情况下可根据本发明进行实践即可。
[0084]1.GLK藉由活化T细胞中的PKC-Θ来控制自体免疫性及NF-κ B信号传导
[0085]方法及材料
[0086]GLK缺乏的小鼠。GLK基因剔除的129小鼠胚胎干细胞纯系(纯系RR0270)是购自EUCOMM且在台湾的基因体医学国家型科技计划(National Research Program forGenomic Medicine)的基因转殖小鼠模型核心实验室(Transgenic Mouse Model Core)被注射至C57BL/6胚胞中，产生嵌合小鼠。所有动物实验均在国家卫生研究院(NationalHealth Research Institutes)根据由 IACUC 批准的方案进行。
[0087]患者及健康对照。对49个基于美国风湿病学会(American College ofRheumatology)准则而诊断为患有全身性红斑狼疮(SLE)的患者进行研究。让所有患者到台中荣民总医院(Taichung Veterans General Hospital, TVGH)的过敏、免疫学及风湿病学部门。登记35个健康个体作为对照。该研究获TVGH的人体试验审查委员会(Institutional Review Board)批准,且自所有患者获得书面知情同意书。
[0088]抗体、质体及经纯化蛋白质。藉由蛋白质A-琼脂糖凝胶层析法自小鼠腹水纯化出抗小鼠⑶3 ε (145-2C11)及抗人类⑶3 ε抗体(0ΚΤ3)。藉由用不同胜肽注射兔子来产生抗GLK,HPKUp-Erk (Τ202/Υ204)、Erk、p_SLP_76 (S376)及 SLP-76 的抗体。抗-p-PKC- θ (T538)及抗-p-PKC-Θ (S695)抗体是来自北部生物技术公司(Upstate Biotechnology, Inc)。抗-PKC- Θ (C-19)、抗-p-PKC- Θ (S676)、抗-Vavl (D-7)、抗-Vav2 (E-12)及抗-Vav3 (K-19)抗体是来自圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology, Inc)。抗-Flag(M2)、抗-Myc、抗-HA及抗微管蛋白抗体是来自SIGMA。抗-p-1KK(S181)、抗-p-PDKl (S214)、抗-1KK及抗-PDKl抗体是来自细胞信号传导(Cell Signaling)。用于细胞内染色的抗-p-PKC-θ (T538) (19/PKC)抗体是来自 BD Pharmingen0 抗-p-mTOR 及抗-mTOR 抗体是来自艾碧康(Abeam)。
[0089]GLK、无活性GLK突变体(KD)及Flag-SLP-76的表现质体如先前所述。藉由将个别 cDNA 分别次选殖至 pCMV6-AC-Myc、pCMV6-AC_HA 及 pCMV6_AC_GFP 载体(OriGeneTechnologies)中来构筑标记Myc的PKC- Θ、标记HA的GLK及标记GFP的GLK。由国家型干扰性核醣核酸核心实验室(National RNAi Core Facility)建立shRNA质体。NF-κ B报导体质体(pNF-kB-Luc)及校正的质体(pRL-TK)是购自普洛麦格(Promega)。
[0090]对于活体外结合分析，分别自Flag-GLK转染及Flag-SLP-76转染的HEK293T细胞中分离并纯化出GLK及SLP-76蛋白，随后进行Flag胜肽溶离。经纯化的由Sf9昆虫细胞中的杆状病毒表现的重组GST-PKC-Θ是购自SignalChem。
[0091]短暂转染及T细胞活化。对于短暂转染分析，使用Neon(氖)转染系统(InvitiOgenCorp.)转染细胞。有关个别细胞株或原生细胞的具体设定如下:对于Jurkat T及J14细胞株，1420V、30毫秒的持续时间及I个脉冲；对于EL4细胞，1080V.50毫秒的持续时间及I个脉冲；对于原生T细胞，2000V、20毫秒的持续时间及2个脉冲。为诱导T细胞活化，在37°C下用5 μ g/ml抗-⑶3抗体刺激J-TAg及EL4细胞指定时间。为诱导原生T细胞活化，用3μ g/ml抗-⑶3-生物素(500A2` ；eBioscience)加3μ g/ml抗生蛋白链菌素(SIGMA)刺激3X106个经纯化T细胞。
[0092]活体外激酶分析。使用抗-Flag的琼脂糖珠粒，由未经刺激或经抗-⑶3刺激的Jurkat T或J-14细胞溶胞物(80 μ g)使Flag-GLK免疫沉淀。将抗-Flag的免疫沉淀物用溶解缓冲液洗涤三次并用激酶缓冲液洗涤一次，或使其经历Flag肽溶离以纯化Flag-GLK。在室温下用35 μ I含500 μ M冷ΑΤΡ、4 μ g髓鞘碱性蛋白及有或无10 μ Ci [Y -32PlATP的激酶缓冲液培育抗-Flag-GLK珠粒或经纯化Flag-GLK达40分钟。藉由聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样品。藉由免疫墨点分析或藉由台风(Typhoon)扫描仪(GE)定量受质中放射性标记的磷酸酯的并入来侦测受质的磷酸化。
[0093]流动式细胞测量术分析。用PMA加离子霉素刺激细胞2小时，且再用蛋白质转运抑制剂(Golg1-stop)处理2小时。收集细胞，用冷PBS洗涤且于冰上用指定抗体染色30分钟。对于临床样品分析，在无任何其他刺激下，立即用Golg1-stop处理PBL，且接着在室温下用抗-表面标记染色。对于细胞内染色，将PBL于200 μ I Cytof ix/Cytoperm缓冲液(BDBiosciences)中渗透2小时且用Perm-Wash缓冲液洗漆,且接着用抗体(1:50稀释液)培育2小时。使用以下抗体进行染色:抗-mCD3-APC(145-2Cll)、抗-mCD3-FITC(145_2Cll)、抗-Foxp3-PE (150D)、抗-1FN Y-FITC(XMG1.2)、抗-1L-4-PE (I IBl I)及抗-1L-17A-PE(TC11-18H10.1)抗体是购自 BioLegend ;且抗-mCD4_ 太平洋蓝(RM4-5)、抗-hCD3-PECy7 (SK7)及抗 _hCD19_PE (SJ25C1)抗体是购自 BD Pharmingen。使用 FACSCantoII流动式细胞仪(BD Biosciences)收集数据且藉由FlowJo软件进行分析。
[0094]活体内T细胞介导的免疫反应及EAE的诱发。各实验中所用的小鼠为6至10周龄的性别匹配的同窝出生仔鼠。如先前所述量测来自经免疫小鼠的抗原特异性(KLH)抗体、ThI及Th2细胞激素的产生。如所述诱发EAE。
[0095]活体外T细胞分化分析。自小鼠的淋巴结纯化出⑶4+⑶25_细胞。在涂有抗-⑶3 (2 μ g/ml)及抗-⑶28 (3 μ g/ml)抗体的48孔培养盘中，在500 μ I培养基中培养细胞(2.5Χ105个)。对于 Treg 分化，细胞系于含有 10ng/ml IL-2、10ng/mlTGF-β、2.5 μ g/ml抗-1L4及2.5 μ g/ml抗-1FN- y抗体的培养基中培养。对于TH17分化，细胞系于含有20ng/ml IL_6、5ng/ml TGF-β、50ng/ml IL_23、5μ g/ml 抗-1L4 及 5 μ g/ml 抗-1FN-gamma 抗体的培养基中培养。对于ThI分化，细胞系于含有5ng/ml IL-12及I μ g/ml抗-1L4抗体的培养基中培养。对于Th2分化，细胞系于含有10ng/ml IL-4及I μ g/ml抗-1FN Y抗体的培养基中培养。
[0096]活体外抑制分析。自小鼠的脾脏及淋巴结负选择小鼠CD4+T细胞。在第二轮纯化中，使用磁耦合抗小鼠⑶25抗体自⑶4+T细胞分离⑶4+CD25+T (Treg)细胞。将Treg细胞添加至⑶3+T细胞(最终浓度为每500 μ I含2 X IO5个细胞)，且接着用抗-⑶3抗体刺激72小时。
[0097]统计方法。藉由史都登氏t试验法(Student, s t_test)测定P值。对于获自临床样品的数据的分析，最初采用皮尔逊相关性(r)。采用临床样品的流动式细胞测量术数据的简单线性回归来显示表现GLK的T细胞的百分比与SLE患者的SLEDAI之间的统计上显著的相关性。
[0098]结果:
[0099]GLK直接磷酸化且活化PKC- Θ
[0100]藉由Jurkat T细胞中GLK过度表现或GLK siRNA基因表现阻断，随后抗-⑶3刺激来研究GLK在TCR信号传导中的作用(图1a及图6)。Jurkat T细胞中抗-CD3诱导的NF- κ B活性及IKK磷酸化(而非Erk或mTOR活化)受GLK siRNA或GLK的激酶死亡(KD)突变体抑制且藉由GLK过度表现而增强(图1a及图7a、b)。此外，在I分钟时TCR信号传导诱导GLK激酶活性且在30分钟时达峰值(图7c)。此等发现表明GLK与TCR诱导的NF-kB活化有关。因为SLP-76调控Erk与IKK路径，所以SLP-76不可能为GLK的标的。因此检查GLK对PKC- Θ活化的作用，PKC- Θ为TCR信号传导中IKK-NF- κ B上游及SLP-76下游的一种关键调控蛋白。PKC-Θ磷酸化受GLK调控(图7d);因此，检查GLK是否藉由靶向PKC- Θ来活化IKK-NF- κ B路径。在抗-⑶3刺激时，PKC- Θ siRNA基因表现阻断可消除GLK诱导的NF- κ B活化(图7e)，从而表明GLK靶向PKC- Θ以诱导NF- κ B活化。
[0101]为解决在T细胞信号传导期间GLK是否可直接磷酸化且活化PKC- Θ，使用共免疫沉淀分析来研究在TCR信号传导期间GLK是否与PKC-Θ相互作用。⑶3刺激可诱导原生T细胞中内源性GLK与PKC-Θ之间的相互作用，且GLK-PKC-Θ相互作用伴随有PKC-Θ活化(图lb)。使用HEK293T、Jurkat及EL4细胞株也观测到类似结果(图8a_c)。在活体外使用经纯化GLK及PKC-Θ蛋白的结合分析进一步证实了 GLK与PKC-Θ之间的直接相互作用(图1c)。为测定GLK使PKC- Θ磷酸化的位点，检查PKC- Θ在T538、S676及S6954处的磷酸化，其为PKC- Θ的三个主要磷酸化位点。T538磷酸化对于PKC- Θ激酶活化及随后的NF- κ B活化最为关键。使用免疫沉淀的Flag-GLK及Myc-PKC- Θ进行活体外激酶分析显示，GLK使PKC- Θ在T538处而非在S676或S695处磷酸化(图1d)。
[0102]在使用经纯化GLK及PKC- Θ蛋白的活体外激酶分析中，PKC- Θ -T538被GLK直接磷酸化(图1e)。当一起考量时，结果表明在TCR信号传导期间GLK与PKC- Θ直接相互作用且使PKC-Θ在T538处磷酸化。
[0103]SLP-76为GLK的直接上游调控蛋白
[0104]SLP-76为T细胞中的关键骨架蛋白且为TCR诱导的PKC-Θ-1KK活化所需2。要求知道在TCR信号传导中SLP-76是否为GLK的直接上游调控蛋白。⑶3刺激诱导了原生T细胞中内源性GLK与SLP-76之间的相互作用(图2a)。SLP-76-GLK相互作用先于GLK-PKC- Θ相互作用及PKC- Θ活化。使用Jurkat及HEK293T细胞也观测到类似结果(图9a_c)。此外，SLP-76与GLK之间的相互作用是经由酪胺酸磷酸化介导(图9d)。使用经纯化GLK及SLP-76进行活体外结合分析证实了该两种蛋白质之间的直接相互作用(图2b)。接着，研究SLP-76是否为GLK活化所需。在SLP-76缺乏的J14细胞(图2c)及SLP-76 shRNA转染的Jurkat细胞(图2d)中使藉由CD3刺激所诱导的GLK激酶活性消除。先前的报告证实Vavl与SLP-76相关且与PKC- Θ移位有关，表明Vavl可控制PKC- Θ活化。因此，研究Vavl是否调控GLK活化。然而，TCR诱导的GLK激酶活化不受Vavl shRNA基因表现阻断影响(图9)。此等数据排除了在TCR信号传导中GLK激酶活化的调控中Vavl的涉及。由于另一种MAP4K，也即HPK1，也由SLP-76活化且又藉由诱导SLP-76-S376磷酸化来负调控SLP-76活化，故需要知道GLK是否与SLP-76的负反馈调控有关。SLP-76-S376磷酸化仅由HPKl而非由GLK诱导(图2e)，从而表明GLK不会发生反馈以负调控SLP-76。此等研究结果表明SLP-76在TCR信号传导期间与GLK直接相互作用且活化GLK。
[0105]GLK控制活体内T细胞介导的免疫反应
[0106]为研究GLK在活体内的作用，产生GLK缺乏的小鼠(图lla、b)。在GLK缺乏的小鼠中T细胞发育正常(图llc-e)。在原生T细胞中研究GLK缺乏对TCR信号传导的作用。与先前的观测(图1) 一致，在CD3(图3a)或CD3-CD28协同刺激(图3b)时，在GLK缺乏的T细胞中PKC- Θ及IKK的磷酸化消除。相比之下，Erk及TOKl活化不受GLK缺乏影响(图3b)。Lck、LAT及PLC Y I的磷酸化以及Ca2+信号传导也未受影响(图1lf及图8c)。由于NF- κ B信号传导调控T细胞增殖，故也使用[3H]胸苷并入及CFSE染料稀释分析来研究GLK对T细胞增殖的作用。GLK的缺乏显著阻断了由CD3刺激而非由PMA加离子霉素刺激所诱导的T细胞增殖(图3d、e ;图1lg)。因为PMA及离子霉素绕过近端的TCR信号传导，所以此结果表明GLK活性是由TCR近端信号传导复合物诱导。GLK缺乏的T细胞的细胞增殖减少，此外由异位表现的GLK可恢复其细胞增殖(图3f)。此等数据证实GLK对于T细胞增殖很重要。
[0107]接着研究GLK是否在活体内T细胞介导的免疫反应中起重要作用。使用矾作为佐剂，用匙孔螺血氰蛋白(KLH)( 一种T细胞依赖性抗原)使野生型及GLK缺乏的小鼠免疫。KLH再刺激之后，来自经KLH免疫的GLK缺乏的小鼠的T细胞显示出增殖减低(图4a)。此外，在来自GLK缺乏的小鼠的经KLH再刺激的脾T细胞中，包括干扰素-Y (IFN- Y )、介白素2(IL-2)及IL-4的细胞激素的含量也显著降低(图4b)，从而表明活体内T细胞活化削弱。在GLK缺乏的小鼠中，一次及二次免疫之后血清中抗原特异性抗体的产生也大大减少(图4c、d)。此等结果表明GLK为发动免疫反应及抗体产生所需。
[0108]GLK缺乏的小鼠对自体免疫性具有抗性
[0109]实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)主要由产生IL-17的⑶4+T淋巴细胞(TH17)介导n。PKC-Θ缺乏致使EAE及TH17反应改善。因为GLK使PKC-Θ活化，所以藉由使用实验性自体免疫性脑脊髓炎模型来研究GLK在Th17介导的自体免疫疾病中的作用。GLK缺乏的小鼠几乎不显示任何症状，而其野生型同窝出生仔畜则发展严重实验性自体免疫性脑脊髓炎(图4e)。在GLK缺乏的小鼠中，第14天时经免疫小鼠的脑及脊髓中的浸润性淋巴细胞中TH17细胞的百分比显著较低(图4f)。另外，在GLK缺乏的小鼠中，血清中IL-17的效价也显著较低(图4g)。为研究GLK缺乏的小鼠中Th17反应缺乏是否为T细胞固有的效应，测定GLK缺乏的未处理T细胞的活体外Th17分化潜能。一贯地，Th17细胞以及ThI及TH2细胞的活体外分化因GLK缺乏而减少(图4h及图12)。活体外Treg分化不受GLK缺乏影响(图12);然而，GLK缺乏的Treg细胞呈现出较高的活体外抑制活性(图4i)。此等结果表明，活体内GLK缺乏会保护小鼠免于发展Th17介导的自体免疫疾病。在GLK缺乏的T细胞中，有缺陷的TCR信号传导及Th17分化以及增强的Treg功能可在GLK缺乏的小鼠的抗性中起关键作用。
[0110]人类SLE中GLK诱导的PKC- Θ活化
[0111]TH17介导的发炎也在人类自体免疫疾病全身性红斑狼疮(SLE)中起重要作用。因为在GLK缺乏的小鼠中自体免疫诱导及Th17反应减弱且GLK使PKC- Θ -1KK路径活化，所以研究GLK-PKC- Θ -1KK-1L-17级联是否与人类SLE有关。检查自49个SLE患者及35个配对的健康对照分离的周边血液白血球(PBL)中的GLK表现及PKC- Θ -1KK活化(图13a)。流动式细胞测量术分析显示，自SLE患者新近分离的PBL中表现GLK的T细胞(而非B细胞)的百分比显著增加(图5a)。表现GLK的T细胞的百分比与SLE疾病活动指数(SLEDAI)相关(图5b ;皮尔逊相关系数:r=0.773)。值得注意的是，与GLK在正常范围内的患者(r=0.451 ；表1)相比较，三分之一(16/49)的GLK表现型(GLK+)T细胞百分比高(≥21%)的SLE患者显示出较高的相关性(r=0.807 ;图5c，表1)。在SLE患者中GLK蛋白的表现量也增加(图5d)。此等结果表明，对于30%的患者而言，GLK过度表现与SLE发病有关。表1显示不同SLE患者子集中SLEDAI与GLK +T细胞百分比之间的相关性的比较。
[0112]表1
[0113]
【权利要求】
1.一种用于鉴别治疗生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)介导的疾病的治疗剂的方法，其包含侦测测试化合物调节GLK介导的信号传导，其中该侦测步骤包含: a)在该测试化合物存在下培养表现GLK的细胞，其中该调节是由测量GLK转录物或蛋白质的表现量、所产生IL-17A的量或NF-K B的活性侦测；或 b)在该测试化合物存在下，使GLK蛋白在ATP存在下与其受质反应，其中该调节是由测量所产生ADP的量、所消耗ATP的量及/或磷酸化受质的量侦测；或 c)在该测试化合物存在下培养表现GLK的癌细胞，其中该调节是由测量该等癌细胞的迁移/侵袭/创口愈合侦测；或 d)在该测试化合物存在下使GLK蛋白与其受质蛋白相互作用，其中该调节是由测量该GLK与该受质蛋白之间的相互作用侦测；及 e)将在该测试化合物存在下的调节与对照相比较，鉴别用于治疗GLK介导的疾病的治疗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中该GLK介导的疾病是选自由自体免疫疾病、发炎疾病、癌症及癌症转移组成的群。
3.如权利要求1所述的方法，其中该受质是选自由PKC-Θ蛋白及髓鞘碱性蛋白组成的群。
4.如权利要求1所述的方法，其中该测试化合物是选自由RNAi分子、微RNA、反义分子及小有机分子组成的群。·
5.如权利要求1所述的方法，其中该等表现GLK的细胞包含表现GLK的T细胞，及/或表现GLK的癌细胞包含表现GLK的肺癌细胞。
6.如权利要求2所述的方法，其中该癌症为一类GLK蛋白介导的癌症且与哺乳动物雷帕霉素标的蛋白质无关。
7.如权利要求2所述的方法，其中该自体免疫疾病是选自由以下组成的群:全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、成人发作型史迪尔氏病、葛瑞夫兹氏病、休格连氏症候群、僵直性脊椎炎、视神经脊髓炎、自体免疫性脑脊髓炎及秃发症。
8.如权利要求2所述的方法，其中该癌症是选自由以下组成的群:肺癌、食道癌、神经胶母细胞瘤、胰脏癌、乳癌及肝癌。
9.如权利要求1所述的方法，其中在步骤d)中，GLK与该等受质蛋白间的相互作用是使用荧光共振能量转移分析或放大发光亲近均质分析测量。
10.如权利要求1所述的方法，其中在步骤d)中，该受质包含PKC-Θ蛋白，且该等GLK及PKC-Θ蛋白用不同的兼容性荧光探针标记，一个探针的荧光激发及发射波长高于另一探针，且该经调节的缔合是藉由在较高荧光发射波长下的变化侦测。
11.一种用于侦测生发中心激酶(GCK)类激酶(GLK)介导的疾病的存在及/或严重程度的方法，其包含: a)自怀疑患有GLK介导的疾病或癌症的个体获得包含T细胞或癌细胞的样品； b)测量该等T细胞或癌细胞中GCK类激酶(GLK)的表现量；及 c)测定该GLK介导的疾病的存在及/或严重程度； 其中与对照中GLK的表现量相比,该等T细胞或癌细胞中GLK的表现量增加指示该个体有发生或患上该GLK介导的疾病的风险或有该癌症复发及/或转移风险。
12.如权利要求11所述的方法，其中该GLK的表现量增加与哺乳动物雷帕霉素标的蛋白质无关。
13.如权利要求11所述的方法，其中该测量步骤包含测量GLK蛋白的表现量。
14.如权利要求13所述的方法，其中该测量步骤是藉由免疫墨点分析、流动式细胞测量术分析及/或免疫组织化学进行。
15.如权利要求11所述的方法，其中该测量步骤包含测量GLK转录物的表现量。
16.如权利要求15所述的方法，其进一步包含将所测量的GLK转录物表现量针对一种管家基因正规化以获得经正规化的GLK转录物表现量。
17.如权利要求11所述的方法，其中该GLK介导的疾病是选自由自体免疫疾病、发炎疾病、癌症及癌症转移组成的群。
18.如权利要求1所述的方法，其中该等表现GLK的细胞包含过度表现GLK的细胞，及/或表现GLK的癌细胞包含过度表现GLK的癌细胞。
19.如权利要求1所述的方法，其中该ATP为非放射性的。
20.如权利要求1所述 的方法，其中使该GLK蛋白与该受质相互作用在试管内发生。
【文档编号】C12Q1/02GK103827310SQ201280034960
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2011年7月14日
【发明者】谭泽华, 庄怀佳 申请人:财团法人国家卫生研究院