沙门氏菌和大肠杆菌的培养基和培养方法以及用于检测沙门氏菌和大肠杆菌的方法
【专利摘要】在实施例中公开了培养基、用于补充培养基的成分和用于培养生物样品的方法。在实施例中，所述方法是用于检测细菌的方法，并且在实施例中所述细菌包含沙门氏菌(salmonellaspp)，并且在实施例中包括大肠杆菌(E.coli?spp)。在实施例中所述培养基和成分包含烷醇胺和复合钴胺素。
【专利说明】沙门氏菌和大肠杆菌的培养基和培养方法以及用于检测沙门氏菌和大肠杆菌的方法
【背景技术】
[0001]1.【技术领域】
[0002]本发明公开的主题涉及用来培养微生物和检测微生物的培养基和方法。
[0003]2.相关文献
[0004]1.Roof, D.M., and J.R.Roth.1988.Ethanolamine utilization in Salmonellatyphimurium.J.Bacteriol.170:3855-3863.[0005]2.Roof，D.M.，and J.R.Roth.1989.Functions required for vitaminB12_dependent ethanolamine utilization in Salmonella typhimurium.J.Bacteriol.171:3316-3323.[0006]3.Chang, G.W., and J.T.Chang.1975.Evidence for the B12_dependent enzymeethanolamine deaminase in Salmonella.Nature254:150-151.[0007]4.Garsinj D.A.2010.Ethanolamine utilization in bacterial pathogens:roleand regulation.Nat.Rev.Microbiol.8 (4): 290-295.[0008]5.Kofoidj E.，C.Rappleyej 1.Stojiljkovicj and J.Roth.1999.Thel7_geneethanolamine(eut)operon of Salmonella typhimurium encodes five homologues ofcarboxysome shell proteins.J.Bacteriol.181:5317-5329.[0009]6.Brinsmade S.R.，Pal don T.，Escal ante-Semerena J.C.2005.Minimal functions and physiological conditions required for growth ofsalmonella enterica on ethanolamine in the absence of the metabolosome.J.Bacteriol.187(23):8039-46.[0010]7.Chapter4entitled Isolation and identification of Salmonellafrom, meat, poultry and eggs products in USDA/FSIS Microbiology Laboratoryguidebook, 3rd Edition, Rev.#4，http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG 4 05.pdf [0011]8.Chapter5B entitled Detection and Isolation of non-0157Shiga_toxinProducing Escherichia coli(STEC) from Meat Products in USDA/FSIS MicrobiologyLaboratory guidebook，3rd Edition, Rev.#1，http://www.fsis.usda.rov/PDF/Mlg 5B 01.pdf
[0012]9.Chapter5entitled Salmonella in FDA Bacterial Analytical Manual, 8thEdition, November201IVersionj
[0013]http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm
【发明内容】
[0014]在第一个实施例中公开了包含具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺的培养基。[0015]在实施例中，所述复合钴胺素选择由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。
[0016]在实施例中，所述烷醇胺是乙醇胺。
[0017]在实施例中，公开了细菌培养基。
[0018]在实施例中所述细菌为沙门氏菌(salmonella spp)或大肠杆菌(E.coli spp)。
[0019]在实施例中，所述细菌为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌157(E.colil57)、志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin E.coli)或肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli)。
[0020]在实施例中复合钴胺素大于0.002M浓度存在且所述烷醇胺以大于0.001mg/l的
浓度存在。
[0021]在进一步的一系列实施例中公开了用于培养生物样品的方法，所述方法包括在具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺存在的情况下孵育样品的步骤。
[0022]在实施例中，所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。
[0023]在实施例中，所述烷醇胺为乙醇胺。
[0024]在实施例中，所述方 法用于培养细菌。
[0025]在实施例中，所述细菌为沙门氏菌(salmonella spp)或大肠杆菌(E.coli spp)。
[0026]在实施例中，所述细菌为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌157(E.colil57)、志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin E.coli)或肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli)。
[0027]志贺毒素大肠杆菌在实施例中，所述烷醇胺以大于0.002M的浓度存在且所述复合钴胺素-以大于0.001mg/l的浓度存在。
[0028]所述方法用于检测样品中的沙门氏菌或大肠杆菌。
[0029]在实施例中，所述方法用于检测样品中的沙门氏菌或大肠杆菌且所述烷醇胺为乙醇胺。
[0030]在实施例中，所述方法进一步包含PCR、凝集素结合、样品扩散、侧向扩散、抗体结合、侧向层析或分步层析。
[0031]在进一步一系列的实施例中，公开了用于在培养基中优先培养沙门氏菌和大肠杆菌的方法，所述方法包括向培养基补充具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺。
[0032]在进一步一系列的实施例中，公开了用于补充培养基的配方，所述配方包含复合钴胺素和烷醇胺。
[0033]在实施例中，所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。
[0034]在实施例中所述烷醇胺为乙醇胺。
[0035]在实施例中所述配方的用途是用于细菌的生长。
[0036]在实施例中，细菌为沙门氏菌(salmonella spp)或大肠杆菌(E.coli spp)。
[0037]在进一步一系列的实施例中公开了用于检测生物样品中志贺毒素大肠杆菌鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌157 (E.colil57)、志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin E.coli)或肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli)的方法，所述方法包含在具有生物有效浓度的乙醇胺和复合钴胺素存在的情况下培养样品，所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。
[0038]此处所述主题的特征和优势将通过下述优选的实施例的详细描述而变得更加明显，如附图所示。将认识到，公开和请求保护的主题可在各方面进行修改，只要不脱离权利要求的范围。因此，附图和说明书被认为是说明性的，而不是限制性的且所述主题的完整范围记录在权利要求书中。
[0039]优选实施例的详细说明
[0040]术语
[0041]在本公开中，“包含”一词被用在非限制性句子中表示紧接着该词的内容被包括进来，但是没有特别提及的内容不代表被排除了。能被理解的是当实施例表示包含或可能包含特征或特点时，它也可以设想成在实施例替代变体中，所述实施例可以包括或基本包括符合所讨论的特征。提到某种元素不排除其他元素存在的可能，除非文章明确要求一种和只有一种元素。
[0042]本公开中,通过端点叙述的数值范围包括此范围内所有的数字,包括所有的整数，所有的小数(例如，I到5包括1、1.5、2、2.75,3,3.80,4和5等)。
[0043]本公开中，单数形式包括复数的指示对象除非内容另有明确规定。因此，例如，提及包含“化合物”的配方，包括两种或更多化合物的混合物。
[0044]本公开中，“或者” 一词在句中包括了 “和/或”的含义，除非内容另有明确规定。
[0045]本公开中，除非另有指明，所有说明书和权利要求书中列出的用于表示数量或成分，性质测定等的数字可在所有例证中通过“约”一词进行修改。因此，除非有根据上下文相反的或必要的指示，本公开中·列出的数值参数为可以基于所需性质进行改变的近似值，本领域技术人员利用现有公开的内容并根据测量和定量的不准确性可试图获得所述性质。在不限制等同原则适用于权利要求的范围的情况下，至少应该根据已报道的显著位数的数量以及利用普通的四舍五入方法对每一个数值参数进行分析。尽管本公开宽范围中列出的数值范围和参数为近似值，列于具体实施例中所列的数值被广义地理解到一个程度，该程度兼顾本公开的有效性以及本公开和请求保护的主题与现有技术的区别并存。
[0046]本公开中，“培养基”、“肉汤”、“培养液”等均涉及适于培养所需微生物(可以是细菌或微生物菌株或品种)的营养混合物。在实施例中可以是或者可以包含如本文所定义的任何核心培养基并且可以用粉末或浓缩形式来制备。
[0047]在实施例中，培养基含有pH缓冲液。在一系列的实施例中，所述pH缓冲液是磷酸二氢钠和磷酸氢二钾的混合物,但是也可以是替代的生物相容的缓冲液,例如MOPS (也叫3- (N-吗啉)丙磺酸、3-吗啉代丙烷-1-磺酸、3-N-吗啉丙磺酸、4-吗啉丙磺酸)、和适当的碳酸钙缓冲液，并且能被本领域技术人员熟练选择和操作以获得所需的培养基PH值。
[0048]在实施例中，培养基可以以粉末或浓缩的形式被提供，通常也被称为“粉末”、“浓缩物”、“粉末培养基”、“培养基粉末”、“培养基浓缩物”、“浓缩培养基”等，它包含多种成分并适于与定量的水结合以制成特定成分具有所需浓度的液体培养基。这样的粉末培养基或浓缩培养基可能是完整的，这意味着只需在使用前将它溶于适量的水(一般是无菌水)。在实施例中另一种情况是，粉末或浓缩培养基可能是不完整的，这意味着需要添加额外的成分来获得适于使用的完整的培养基。在实施例中，粉末或浓缩的培养基也包括浓缩的至少部分水合的培养基，它在溶解后形成用于培养细菌的培养基。可以理解的是，除非文章另有要求，本文所用的“培养基”不仅包括成分浓度适合培养细菌和微生物的最终培养基，还包括适于稀释的粉末或浓缩培养基。“ActeiO沙门氏菌/STEC”扩繁培养基或“AEM”培养基及其近似词语通常指基于实施例的培养基。
[0049]本公开中，“维生素B12”和“钴胺素”具有它们正常的含义且二者都是指拥有图1A中所示结构式的维生素。其中R代表任何与基本正常维生素B12活性或与用于此处请求保护的主题的实施例中的活性相兼容的组。在特定的实施例中但不限于的情况下，以上配位到中央Co2+离子的配体R可以是Me、0H、CN和5’-脱氧腺苷基。为进一步确定且不限制的情况下，维生素B12的其它名称和具有生物活性的相关衍生物包括:B-12、B12、B群维生素、Bedumil、钴胺素、氰钴胺素、维生素B12、维他命B12、B群维他命、氰钴维生素、氰钴胺、维生素B12氰钴胺、复合钴胺素、轻钴胺素、轻钴胺、Hydroxocobalaminum、轻钴胺维生素B12、Hydroxocobemine>Idrossocobalamina> 甲基钻胺素、甲钻胺、维生素 B12 a、Vitadurine、维生素B12、维他命B12、核黄素、维他命B2、啶黄素、黄素、印黄素、乳黄素、维生素B-2和维生素G。
[0050]相似地，“钴胺化合物”应被理解为包括所有与维生素B12或钴胺素的生物性质基本相当的化合物。例如但不限于，本领域技术人员熟知，在实施例中，关于维生素B12或复合钴胺素应被理解为包括氰钴维生素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和其他功能相当的化学物质，本领域技术人员能熟练地鉴别这些物质。
[0051]可进一步理解的是，在实施例中，各种钴胺素的修饰或共轭形式可能具有生物有效性并且为本领域技术人员所熟知，并且可以理解地被包括在“复合钴胺素”中。广义上，复合钴胺素可以包括任何具有图1B中所示的一般结构的化合物，其中Rl，R2, R3, R4, R5, R6，R7, R9, RIO, Rll, R12, R13, R14, R15可以是相同的或各异的，并且可以独立地是H或可以是直链或支链的烷基、 环基、环烷基并且可以是本领域技术人员所熟知的各种方式的支链的或替代的，并且可以独立包含或者包含至少0，I, 2，3，4，5，6，7，8或更多碳原子。在特定的实施例中且不限于的情况下，以上配位到中央Co2+离子的配体R15可以是Me、OH、CN和5’ -脱氧腺苷基。
[0052]本公开中，“烷醇胺”也被称为“氨基醇”指在烷烃主干上包含醇基和氨基的有机化合物。非限制性实施例中，烷醇胺包括甲基乙醇胺、乙醇胺、二甲乙醇胺、N-甲基乙醇胺、氨甲庚醇、乙基异丙肾上腺素、正肾上腺素、丙醇胺、戊胺、鞘氨醇、具有结构式N(H)R1，R2的二烷醇胺和具有结构式NR1，R2, R3的三烷醇胺。在特定的实施例中，烷醇胺可以是乙醇胺或者可以包含具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多的碳原子的主干并且可以包含一种以上的氨基或一种以上的羟基或一种以上的氨基和一种以上的羟基。在实施例中，烷醇胺可以是替代的烷醇胺。在特定的实施例中，烷醇胺可以是乙醇胺。为进一步明确，乙醇胺的其他名字包括单乙醇胺、2-氨基乙醇、胆胺、氨基乙醇、2-羟基乙胺、环氧丙醇、乙醇胺、氨基乙醇、2-氨基-1-乙醇。在特定的实施例中，链烷醇胺选自由丙二醇、单异丙醇、乙二醇、2-1氨基乙醛、氨基丙腈、乙二胺、2-氨基丙醇、1，2-二氨基丙烷、N-甲氨基乙醇、2-羟乙基肼、3-氨基-1-丙醇、2-氟乙醇、2-羟乙酰胺、2-氨基乙醇、(R) -(_) I, 2-丙二醇组成的组。
[0053]本公开中应被理解的是，除文义另有所指外，提及的培养基或溶液包含烷醇胺或复合钴胺素或烷醇胺或复合钴胺素等可以包括两份、三份或多分烷醇胺或复合钴胺素或烷醇胺和复合钴胺素。因此根据实施例和非限制性的说明书，培养基包含每升I克的烷醇胺说明I克可以包含不同烷醇胺的混合物，它们加起来总的重量为I克。同样地，再次根据实施例和非限制性的说明书，包含I克复合钴胺素的混合物应当被理解为:所述I克包含一种或多种复合钴胺素成分，例如甲基钴胺素、氰钴维生素和/或其它复合钴胺素，它们加起来的总量为I克。
[0054]本公开中，动词“缓冲”表示在预定范围内，以对本领域技术人员来说显而易见的方式稳定溶液的PH，所述溶液可以是培养基。名词“缓冲液”指适于稳定溶液pH的化学制
品O
[0055]本公开中，“基础”或“核心”培养基或肉汤指包含某些为本领域技术人员所熟知的基本需要的成分的部分培养液，并且它的具体配方组成是可以变动的只要仍然适合于所培养的微生物生长。因此在实施例中但无限制性的情况下，核心培养基可以包含盐、缓冲液和蛋白提取物，并且在实施例中可以包含氯化钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钙。在实施例中一升核心培养基可以具有表1所示的通用配方但是在替代实施例中，核心培养基将或可以包含水、琼脂、蛋白、氨基酸、酪蛋白水解物、盐类、脂类、碳水化合物、盐类、矿物质、和PH缓冲液中的一种或多种，并且可以包括提取物例如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、蛋白胨、麦芽提取物，并且在实施例中，培养基可以是或者可以包含LB培养基；低盐LB培养基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%NaCl)，SOB培养基(2%蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmM NaCl,2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgSO4), SOC 培养基(2% 蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmM NaCl,2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgS04、20mM葡萄糖)，超级肉汤(3.2%蛋白胨、2%酵母提取物和0.5%NaCl), 2xTY培养基(1.6%蛋白胨、1%酵母提取物和
0.5%NaCl), Terrific 肉汤(TB)(1.2% 蛋白胨、2.4% 酵母提取物、72mM K2HP04、17mM KH2P04和0.4%甘油)，LB或LB Lennox肉汤(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和l%NaCl)。应被理解的是，在特定实施例中，一种或多种成分可以从所述核心培养基中省去。在实施例中，培养基可以是简单的、复杂的或指定的培养基并且可以是扩繁培养基并且可以是以各种本领域技术人员所熟知的不同方式进行补 充的。广义地，本领域技术人员了解所述培养基包含基本适于支持一种或多种微生物生长的任何成分。
[0056]表1:基于实施例的核心培养基的基本配方
[0057]
【权利要求】
1.培养基，包含具有生物有效浓度的: 复合钴胺素，和 烷醇胺。
2.根据权利要求1所述的所述培养基，其中所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。
3.根据权利要求1所述的所述培养基，其中所述烷醇胺为乙醇胺。
4.根据权利要求1所述的细菌培养基。
5.根据权利要求4所述的培养基,其中所述细菌是沙门氏菌(salmonellaspp)或大肠杆菌(E.coli spp.)。
6.根据权利要求5所述的培养基，其中所述细菌是鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、大肠杆菌 157 (E.colil57)、志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin E.coli)或肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.col1.)。
7.根据权利要求2中的所述培养基，其中所述烷醇胺以大于约0.002M的浓度存在并且所述复合钴胺素以大于约0.001mg/l的浓度存在。
8.用于培养生物样品的方法，所述方法包括在存在以下生物有效浓度的成分的情况下孵育生物样品的步骤: 复合钴胺素，和 烷醇胺。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述烷醇胺是乙醇胺。
11.根据权利要求8中的所述方法用于培养细菌。
12.权利要求12中的所述方法，其中所述细菌是沙门氏菌或大肠杆菌其中所述细菌是沙门氏菌(salmonella spp)或大肠杆菌(Ε.coli spp.)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细菌是鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、大肠杆菌 157 (E.colil57)、志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin Ε.coli)或肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.col1.)。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述烷醇胺以大于约0.002M的浓度存在并且所述复合钴胺素以大于约0.001mg/l的浓度存在。
15.权利要求8所述的方法用于在样品中检测沙门氏菌或大肠杆菌。
16.权利要求8所述的方法用于在样品中检测沙门氏菌或大肠杆菌并且其中所述烷醇胺为乙醇胺。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包含PCR、凝集素结合、简单扩散、侧向扩散、抗体结合、侧向层析或分步层析。
18.用于在培养基中优先培养沙门氏菌和大肠杆菌的方法，所述方法包含利用具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺补充所述培养基。
19.用于补充培养 基的成分，包含: 复合钴胺素，和 烷醇胺。
20.根据权利要求19中所述的成分，其中所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。
21.根据权利要求19所述的成分，其中所述烷醇胺是乙醇胺。
22.权利要求18所述的成分用于细菌生长。
23.权利要求22所述的成分，其中所述细菌是沙门氏菌或大肠杆菌。
24.用于在样品中检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌157、志贺毒素大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌的方法，所述方法包含在具有生物有效浓度的乙醇胺；和选自由甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成`的组的复合钴胺素存在的情况下培养所述样品。
【文档编号】C12Q1/10GK103797110SQ201280034793
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年7月10日 优先权日:2011年7月12日
【发明者】马汀内兹·加布里耶拉, 特朗布莱·雷诺, 拉罗谢尔·贾尼金 申请人:食品安全测试系统公司