Serca2a的sumo化和心血管疾病的制作方法
【专利摘要】提供了治疗心血管疾病、并特别是心衰的方法，包括给予治疗有效量的SERCA2a翻译后修饰(例如SUMO化或乙酰化)的调节剂。还提供了通过抑制SERCA2a降解治疗心血管疾病的方法。还提供了诊断发展为心衰的倾向性的方法，包括确定是否存在SERCA2a突变体或测定心肌细胞中SUMO1的表达水平。本公开还提供了筛选调节SERCA2a的翻译后修饰(例如通过调节翻译后SUMO化和/或乙酰化)的治疗剂的方法。
【专利说明】SERCA2A的SUMO化和心血管疾病
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求2011年7月13日提交的美国临时专利申请61/507，526的优先权，通过引用的方式将该申请整体并入本申请。
【技术领域】
[0003]本公开大体上涉及心脏病的预防和治疗，更具体而言，涉及调节SERCA2a来预防和/或治疗心脏病或改善其症状。
[0004]发明背景
[0005]SERCA2a是负责心肌细胞在兴奋收缩偶联过程中Ca2+再摄取的关键ATP酶。SERCA2a的下调是心衰中发现的主要异常现象之一。与该现象一致，通过转基因恢复SERCA2a已被证实能有效地使人以及模型动物的心脏功能正常化。
[0006]心衰(HF)代表复杂的病理生理学状态，其常常是包括动脉粥样硬化、心肌病以及高血压在内的各种心血管病症的最终结果。HF的发病率在世界范围内持续升高。HF的特征为收缩功能不良，其很大程度上是由于肌质网(SR)Ca2+循环的异常(Gwathmey etal., 1987;Gwathmey and Haj jar, 1990) ?在正常人心肌细胞中，SERCA2a的活性有助于在舒张期将大于70%的胞质Ca2+移入SR。因此，SERCA2a通过决定后续搏动中SR的Ca2+含量而影响肌肉收缩动力学(MacLennan and Kranias, 2003)。由于SERCA2a的表达水平下降和活性降低而使SR的Ca2+摄取受损已报道于人类心衰中(Meyer et al., 1995 ;Minamisawaet al., 1999; Zarain -Herzberg et al.，1996)。已知的是，通过转基因恢复 SERCA2a 水平能改善 HF 的卩齿齿动物(del Monte et al., 2001)和猪模型(Byrne et al., 2008; Kawaseet al., 2008)的收缩和舒张功能不良。
[0007]翻译后修饰(PTM)是通过影响各种细胞蛋白的酶学活性、定位、稳定性或响应于环境刺激的更新速率而调节各种细胞蛋白的功能的重要方式。之前已证实的是，可以通过PTM调节SERCA2a活性，所述PTM例如谷胱甘肽化(glutathiolation) (Adachi etal., 2004; Dremina et al., 2007; Lance 1 et al., 2009)和硝化(Knyushko et al., 2005)。还已知的是，与正常心脏相比，在衰竭心脏中SERCA2a的等电点同时变得酸性和碱性更强。此外，通过转基因恢复SERCA2a水平还部分地恢复衰竭心脏中SERCA2a的等电点的这种改变(图S1)。这些资料表明，已经存在与HF发展有关的SERCA2a的多种PTM。
[0008]小泛素相关修饰蛋白(SUM0)与泛素享有18%的序列同源性，其可以与靶蛋白的赖氨酸残基缀合。这种PTM被称为SUM0化。在人中，三种SUM0同种型(SUM01-3)能修饰共同的和不同的底物(Welchman et al.，2005)。具体而言，SUM01被证实在调节不同的细胞进程中发挥重要作用，包括正常和病理状态中的转录调节、核转运、DNA修复、细胞周期、质膜去极化以及信号转导(Sarge and Park-Sarge, 2009)。SUM0介导的诸如GATA4 (Wanget al., 2004)和Nkx2.5 (Wang et al., 2008)的心脏转录因子的调节与心肌细胞的分化和心脏结构的发育有关。SUM0介导的修饰还调节心脏离子通道活性，包括电压门控钾通道(Benson et al.，2007)。此外，ERK5的SUM0化最近被证实与糖尿病相关心脏疾病状态有关(Shishido et al., 2008)。
[0009]在过去的几年中，大量研究证实，SUM0化能调节正常和人病理状态中多种蛋白的活性，包括神经退行性疾病、癌症以及家族性扩张型心肌病(Kim and Baek, 2006; Stef fanet al., 2004; Zhang and Sarge, 2008) ?最近，ERK5的SUMO化在糖尿病心脏中的关键作用已被报道(Woo and Abe, 2010)。
[0010]SUMO化能影响靶蛋白的生物化学性质，诸如酶学活性和稳定性。深层的分子学机制很大程度还是未知的，但是已提出了三种可能性。SUM0连接通过屏蔽已存在的结合位点或增加SUM0中存在的界面而可能改变靶标与其结合伴侣(DNA或蛋白)之间的相互作用。或者，SUM0化可能诱导靶蛋白的构象改变，这能增加或降低酶学活性。最后，SUM0化能阻断赖氨酸残基上的其他PTM(例如泛素化和乙酰化)，这导致靶蛋白的功能性质的改变。
[0011]已被证实，SERCA2a是氧化型PTM的靶标。在经历电刺激的骨骼肌中、在高血胆固醇的动脉中以及在缺血的人心脏中已观察到了 SERCA2a的累积硝化作用。酪氨酸294和295位置的硝化与SERCA2a的Ca2+_ATP酶活性降低相关。位于SERCA2a的功能关键膜区内并邻近带负电的侧链的这些酪氨酸的位置似乎能保证高效的硝化作用和钙转运的速率降低的机制。此外，在糖尿病猪中检测到了 SERCA2a的氧化还原敏感型半胱氨酸残基(半胱氨酸674)的氧化(Ying et al., 2008)。这样的氧化修饰可能与缺血心脏(French et al., 2006)和暴露于过氧化氢的H9c2细胞(Ihara et al.，2005)中SERCA降解加速有关。
[0012]因此，本领域中仍然需要以对人类和其他动物安全和有效的方式治疗诸如心衰的心血管疾病的治疗剂和方法。
[0013]发明概述
[0014]本申请公开的主题满足了本领域中对于治疗心血管疾病的治疗剂和方法的至少一个上述需求。具体而言，本申请公开的实验确定了，SERCA2a是被SUM0化的。衰竭心脏中的SUM01水平和SERCA2a的SUM0化显著降低。SUM01超表达恢复衰竭心脏中受损的心脏功能，在一定程度上是通过增强SERCA2a的酶学活性和稳定性，而SUM01下调导致心脏功能不良。这些资料提供了通过PTM调节SERCA2a功能的新的见解，并且还提供了设计新的HF治疗策略的基础。
[0015]在以下示例性段落中描述了所公开的主题的不同方面。
[0016]1.治疗个体心脏功能不良的方法，包括给予所述个体治疗有效量的SERCA2a翻译后修饰的调节剂。
[0017]2.如段落1所述的方法，其中所述心脏功能不良选自心衰、压力超负荷诱导的心脏功能不良、以及受抑制的钙衰变诱导的心脏功能不良。
[0018]3.如段落2所述的方法，其中所述心衰包括收缩功能不良。
[0019]4.如段落2所述的方法，其中所述心衰是TAC诱导的心衰。
[0020]5.如段落1所述的方法，其中所述个体是人。
[0021]6.如段落1所述的方法，其中所述调节剂调节SERCA2a翻译后SUM0化。
[0022]7.如段落6所述的方法，其中所述调节剂是包含编码选自SERCA2a和SUM01的蛋白的可表达编码区的载体，并且其中所述编码区可操作地连接于至少一个表达控制元件。
[0023]8.如段落7所述的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒。
[0024]9. 如段落8所述的方法，其中所述重组腺相关病毒是rAAVl。[0025]10.如段落1所述的方法，其中所述调节剂调节SERCA2a翻译后乙酰化。
[0026]11.如段落10所述的方法，其中所述调节剂是Sirtl脱乙酰酶。
[0027]12.通过抑制SERCA2a降解来治疗个体的心血管病症的方法，包括给予治疗有效量的SUM01剂。
[0028]13.如段落12所述的方法，其中所述SUM01剂是包含编码选自SERCA2a和SUM01的蛋白的可表达编码区的载体，并且其中所述编码区可操作地连接于至少一个表达控制元件。
[0029]14.如段落13所述的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒。
[0030]15.如段落14所述的方法，其中所述重组腺相关病毒是rAAVl。
[0031]16.诊断发展为心衰的倾向性的方法，包括确定对应于选自人SERCA2a(SEQ IDNO:2)的第479-482位和/或第584-587位中任何一个的位置的氨基酸。
[0032]17.诊断发展为心衰的倾向性的方法，包括确定编码对应于人SERCA2a(SEQ IDNO: 1)的氨基酸479-482或584-587中任何一个的氨基酸的多核苷酸序列。
[0033]18.诊断发展为心衰的倾向性的方法，包括测定个体的心肌细胞中SUM01的表达水平，并将该水平与健康对照的心肌细胞中SUM01的表达水平比较，其中SUM01表达相对于对照降低指示发展为心衰的倾向性。
[0034]19.筛选治疗心衰的治疗剂的方法，包括在存在和不存在候选治疗剂的情况下使SUM01与SERCA2a接触，以及如果在存在候选治疗剂时SERCA2a的SUM0化水平高于不存在候选治疗剂时SERCA2a的SUM0化水平，则将所述候选治疗剂鉴定为治疗剂。
[0035]通过下文的详细描述，本申请的其他特征和优势会更加清楚。但是，应当理解，尽管详细描述和具体实施例表示优选的实施方案，但是提供这些详细描述和具体实施例仅是为了说明性目的，因为本领域技术人员根据这些详细描述能够容易地获知本发明的实质和范围内的各种变化和改动。
[0036]附图简要描述
[0037]图1.SERCA2a复合物。(A) SERCA2a复合物的双向SDS-PAGE凝胶图。银染的SDS-PAGE凝胶显示了与SERCA2a —起免疫沉淀的12kDa的点(箭头)。利用兔抗SERCA2a抗体(抗S2a)从免疫沉淀的SERCA2a复合物获得的免疫印迹证实了 SERCA2a的富集。兔IgG(抗IgG)复合物用作阴性对照。(B)通过串联质谱分析鉴定出的SUM01的代表性肽指纹。SUM01的蛋白序列，匹配的肽用粗体显示。(C)表达flag标记的SUM01的HEK293细胞中SERCA2a的体内SUM0化。通过抗SERCA2a分析沉淀的flag标记的SUM01缀合物。(D)SERCA2a与Ubc9之间的相互作用。用myc标记的Ubc9和SERCA2a的表达载体或pcDNA载体(阴性对照)转染HEK293细胞。用抗myc对细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)，并利用抗SERCA2a对得到的沉淀物进行免疫印迹。
[0038]图2.在实验模型和人类心衰中内源SUM01蛋白水平均降低。㈧人心脏组织中SERCA2a的SUM0化。显示蛋白表达的代表性的印迹以及后续定量(每组n=5)。S-SERCA2a: SUMO化的SERCA2a。(B) TAC诱导的心衰小鼠模型中SUM01和SERCA2a的代表性的免疫印迹以及后续定量。TAC诱导的衰竭心脏(TAC，n=5);假操作对照心脏(假操作，n=8)。(C) 一个代表性的实验的免疫印迹以及后续定量。分析了 8只猪的心脏中SUM01和SERCA2a的蛋白量。MR诱导的衰竭猪心脏(MR，n=3);假操作对照心脏(假操作，n=5)。利用Image J系统通过光密度分析法评估蛋白条带强度。内参GAPDH用于标准化，以实现相同的蛋白上样量。所有数据表示为平均值土标准差。*P〈0.05表示利用Student t检验，与各自的对照相比。TAC:主动脉缩窄(trans-aortic constriction),MR:二尖瓣回流,NF:非衰竭或正常心脏。
[0039]图3.SUM01与SERCA2a的赖氨酸480和585缀合，并且是SERCA2a功能所需的。(A)SERCA2a的N结构域。分别来自SEQ ID N0:2、4、6和8的第360-603位的人、猪、大鼠和小鼠SERCA2a的蛋白序列比对。推定的SUM0共有基序(ΨΚΧΕ，其中Ψ是疏水氨基酸)含有SERCA2a的赖氨酸480和赖氨酸585。SERCA2a的SUM0修饰位点用黑色轮廓标出。水解酶结构域用虚线括出。⑶SERCA2a的体内SUM0化。用表达flag标记的SUM01和myc标记的Ubc9以及WT或突变体SERCA2a的质粒共转染HEK293细胞。通过免疫印迹利用抗SERCA2a抗体检测SERCA2a的SUM0化形式。(C) SERCA2a的SUM0化中SUM01表达的剂量反应。用myc标记的Ubc9和WT或K480R/K585R SERCA2a突变体共转染HEK293细胞。添加指定量的flag标记的SUM01或等量的对应空载体。免疫印迹显示出SUM01对SERCA2a的SUM0化的剂量反应。(D)在存在和不存在额外的SUM01的情况下，WT和K480R/K585R SERCA2a突变体的Ca2+依赖性ATP酶活性。从三次独立的实验获得所显示的数据，每次实验以一式两份进行。(E) WT和K480R/K585R SERCA2a的ATP结合能力。用ATP琼脂糖对具有指定质粒的转染的HEK293细胞的裂解物进行亲和沉淀，并随后用抗SERCA2a抗体进行免疫印迹。(F)还用指定的抗体在不同时间点进行免疫印迹，即，用ATP琼脂糖对一时间系列的HEK293细胞裂解物进行亲和力纯化，并用抗SERCA2a抗体进行免疫印迹分析。(G)SUMOl超表达对HEK293细胞中WT和K480R/K585R SERCA2a突变体的蛋白稳定性的效应。定量数据显示为第0天的相对比例(n=3)。所有数据表示为平均值土标准差。*p〈0.05 ;**p〈0.001表示利用Student t检验,与各自的对照相比。 [0040]图4.SUM01超表达增强正常和衰竭心肌细胞中的心肌细胞收缩性和钙瞬变。测定心肌细胞收缩的平均参数(假操作收缩性，n=6小鼠/143细胞；HF收缩性，n=8小鼠/181细胞)。测定Ca2+瞬变性质的平均参数(假操作钙瞬变，n=4小鼠/65细胞；HF钙瞬变，n=6小鼠/131细胞)。所有数据表示为平均值土标准差。*p〈0.05 ;**p〈0.001表示利用Studentt检验，与各自的对照相比。
[0041]图5.SUM01超表达恢复TAC诱导的心脏功能不良。(A)条件性SUM01转基因小鼠的产生。心脏SUM01表达处于α-MHC启动子的控制下。(B)免疫印迹表示转基因小鼠中的心脏SUM01超表达。WT:野生型同窝出生仔，TG:SUM01转基因小鼠。(C)代表性的整体心脏(上方左图)，苏木精和伊红染色(下方左图)和Μ型成像(右图)显示在TAC操作后3个月的时间点WT和SUM01转基因小鼠的心脏形态学、左心室功能和维度。(D)舒张末期内径(LVIDd)、收缩末期内径(LVIDs)、缩短分数(FS)和射血分数(EF)的超声心动图测量。假操作:WT,n=12 ;TG，n=10 ；TAC:WT,n=14 ;TG，n=12。(E)响应于 TAC 操作的 Kaplan-Meier存活曲线。WT表示为虚线(n=15)，SUM01转基因小鼠表示为闭合线(n=14)。(F)代表性的免疫印迹显示了 SUM01转基因小鼠(左图)中心脏蛋白表达的改变。通过光密度分析测量法定量条带强度，并用GAPDH对照标准化。数据显示为相对比(每组n=4，右图)。(G)来自假操作WT(〇)、假操作SUM01转基因小鼠(籲)的制备物、来自TAC操作的WT (▽) U及TAC操作的SUM01转基因小鼠(▲)心脏的制备物的SERCA2a的Ca2+依赖性ATP酶活性(每组n=3)。所有数据表示为平均值土标准差。*p〈0.05 ;**p〈0.001表示利用Student t检验，与各自的对照相比。NS:无显著差异。
[0042]图6.SUM01水平的降低加速了心脏功能不良。(A) SUM01 shRNA构建体设计。rAAV在U6启动子控制下表达SUMOlshRNA序列。将杂乱表达盒克隆入相同的病毒载体。(B)递送了表达杂乱对照 shRNA (rAAV9/SC)或针对 SUM01 的 shRNA (rAAV9/shSUM01)的 rAAV9 的小鼠在注射后3周的心脏组织提取物的代表性的免疫印迹(左图)。用指定的抗体探测总提取物。测定心脏SUM01表达的抑制(每组n=5，右图)。(C)代表性的整体心脏(上方左图)，心脏切片(上方右图)和Μ型成像(下图)显示了注射rAAV的小鼠在注射后6周的心脏形态学、心脏功能和维度。(D)rAAV9/shSC和rAAV9/shSUM01的舒张末期内径(LVIDd)、收缩末期内径(LVIDs)、缩短分数(FS)以及射血分数(EF)的评价。测定了超声心动图参数(每组n=14)。(E)rAAV9介导的SUM01心脏敲低的动物的存活。Kaplan-Meier方法用于分析通过不同剂量的rAAV9/shSUM01 (每组n=14)或rAAV9/shSC注射(n=24)获得的动物的寿命。(F)代表性的免疫印迹显示了心脏蛋白的表达水平(左图)。rAAV9/shSC(n=4)或rAAV9/shSUM01 (n=7)尾静脉注射后6周，通过免疫印迹利用指定抗体进行分析。数据显示为相对比。(G)在来自注射杂乱shRNA(.)和注射针对SUM01的shRNA(.)心脏的制备物中证实了 SERCA2a的ATP酶活性的Ca2+依赖性(每组n=3)。对于每个浓度，上方的数据点为rAAV9/SC ;下方的数据点为rAAV9/shSUM01。所有数据表示为平均值土标准差。*p〈0.05 ；**p〈0.001表不利用Student t检验,与各自的对照相比。NS:无显著差异。
[0043]图7.通过SUM0化调节SERCA2a功能的工作模型。在基础条件下，SUM0化增强SERCA2a蛋白稳定性和Ca2+泵功能从而调节心脏收缩性，但是，在病理条件下，增加未SUM0化的SERCA2a形式以及随后的低SUM01蛋白库触发受损的SERCA2a和心脏功能不良。
[0044]图8.比对的氨基酸序列。展示了来自人(智人(Homo sapiens), SEQ ID N0:2)、猪(野猪(Sus scrofa), SEQ ID N0:4)、大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus), SEQ ID NO:6)和小鼠(小家鼠(Mus musculus), SEQ ID NO:8)的野生型SERCA2a的比对的氨基酸序列。本文提到的参与SERCA2a修饰的残基是保守的，正如第480和585位的保守赖氨酸残基以及第674位保守半胱氨酸所证实的。
[0045]图9.比对的多核苷酸序列。编码人、猪、大鼠和小鼠的野生型SERCA2a的编码区序列的比对的多核苷酸。这些多核苷酸编码区序列在序列表中的位置如下:对于人SERCA2a为 SEQ ID NO: 1 的第 564-3557 位，对于猪 SERCA2a 为 SEQ ID NO:3 的第 14-3007 位，对于大鼠SERCA2a为第507-3500位，以及对于小鼠SERCA2a为第541-3537位。
[0046]发明详细描述
[0047]本文公开的资料证实了，SERCA2a在赖氨酸残基480和585发生SUM0化，并且该SUM0化保护SERCA2a的ATP酶活性和稳定性。还观察到缺少SUM0化残基的SERCA2a变体(K480R/K585R)具有显著降低的ATP酶活性和稳定性，这进一步证实了 SUM0化的重要性。在分离的心肌细胞中，腺病毒介导的SUM01超表达增强收缩性和具有加速钙衰变的钙瞬变。转基因介导的SUM01超表达补救了压力超负荷诱导的心脏功能不良，并伴随增强的SERCA2a功能。相比之下，利用shRNA下调SUM01水平加速了压力超负荷诱导的心脏功能恶化，并伴随降低的SERCA2a功能。总而言之，本文公开的研究证实，SUM0化是调节SERCA2a功能的关键的翻译后修饰，并且提供了通过修饰心脏的细胞内的钙来治疗心脏功能不良或病症(例如，心衰)的方法。利用编码SERCA2a的重组腺相关病毒(rAAVl/SERCA2a)的人临床试验已经开始，结果表明靶向于SERCA2a是治疗人HF的安全且有效的方式。
[0048]本文首次公开了，SERCA2a在两个赖氨酸残基的SUM0化。令人感兴趣的是，SERCA2a水平和SERCA2a的SUM0化在衰竭心脏都显著降低。下文的详细描述公开的有力证据证实，SERCA2a的SUM0化的降低是衰竭心脏中SUM01水平降低的直接结果。这种降低的SUM0化与SERCA2a的ATP酶活性降低和SERCA2a稳定性降低密切相关。此外，恢复SUM01能逆转衰竭心脏的收缩功能不良。这些结果总结在图7中。
[0049]SERCA2a的氨基酸序列的保守性质如图8所示，图8提供了人(SEQ ID N0:2)、猪(SEQ ID N0:4)、大鼠(SEQ ID NO:6)和小鼠(SEQ ID NO:8)的SERCA2a的比对的氨基酸序列。在图9中，提供了编码这些SERCA2a氨基酸序列的比对的多核苷酸序列，其中提供了人(SEQ ID N0:1)、猪(SEQ ID NO:3)、大鼠(SEQ ID NO:5)和小鼠(SEQ ID NO:7)多核苷酸序列。图3简要描述中提及的SUMO化基序位于第479-482位(MKKE，对于人、猪、大鼠和小鼠分别为 SEQ ID NO: 10、12、14 以及 16)和第 584-587 位(IKYE，SEQ ID NO: 10、12、14 以及 16)。预期的是，这些四氨基酸基序中的一个或两个中的单个氨基酸改变会以调节SERCA2a对心脏功能效应的方式改变SERCA2a。还预期的是，这些变异中的大部分会干扰或抑制SERCA2a的SUM0化，从而导致诸如HF的心血管疾病的可能性增加。因此，诊断对心血管疾病的倾向性的一个方法包括从患者获得生物样品，确定SERCA2a的第479-482位和/或第584-587位的氨基酸序列，以及如果该氨基酸序列与本文公开的野生型序列不同，则诊断出对心血管疾病的倾向性。考虑到了对于编码多核苷酸序列的类似的诊断方法。
[0050]还提供了介导影响心脏功能的SERCA2a的PTM的SUM0-1蛋白的氨基酸序列:人(SEQ ID NO: 10)、猪(SEQ ID NO: 12)、大鼠(SEQ ID NO: 14)和小鼠(SEQ ID NO: 16)。编码这些氨基酸序列的多核苷酸序列如下:对人、猪、大鼠以及小鼠分别为SEQ ID N0:9、ll、13以及15。
[0051 ] 不希望被理论所束缚，可能的情况是，SUM0化对SERCA2a的ATP酶活性的影响来自于SERCA2a的诱导的构象改变；或者，SUM0化可能导致ATP结合的其他界面，从而导致ATP酶活性增加。还可能的情况是，SUM0化可以影响SERCA2a的其他翻译后修饰(PTM)，例如某些残基的乙酰化。之前的研究表明，多种调节蛋白被SUM0化和乙酰化相对地和竞争性地调节。例如，肿瘤抑制基因HIC1的转录活性被SUM0化提高，并被乙酰化抑制(Van Rechem etal.，2010)。令人感兴趣的是，最近在癌细胞系中人乙酰化组(acetylome)的大规模分析中鉴定出了 SERCA2a的乙酰化(Choudhary et al.，2009)。此外还发现，SERCA2a是乙酰化的并且该乙酰化在衰竭心脏中更为明显，并且可以被Sirtl脱乙酰酶逆转。
[0052]SUM0化和泛素化的相对调节与稳定SERCA2a的SUM0化是一致的。这种SUM0化介导的蛋白降解抑制已在其他蛋白中证实。例如，轴蛋白(Wnt信号的负调节蛋白)的SUM0化防止泛素化，并因此为轴蛋白提供更长的半寿期(Kim et al., 2008) 0相似地，ρ68和P72RNA解旋酶的SUM0化通过降低泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解而增加这些蛋白的稳定性(Mooney et al.,2010)。 [0053]本文公开的资料证实了，SUM01水平在衰竭心脏中显著降低，这为下述观点提供了实验基础:为了心肌细胞的正确的功能，应当精确地保持和控制细胞SUM01水平。本文发现补充SUM01能逆转TAC诱导的衰竭表型，这表明SUM01水平降低是收缩功能不良的直接致因。SUM01转基因的治疗效果是有意义的。相比于SUM01水平的降低，SUM0化和脱SUM0化酶(Ubc9和SENP1)的蛋白水平在衰竭心脏中以及当给予shSUMOl时没有改变。当SUM01水平恢复时，Ubc9和SENP1的水平也没有改变。因此，SUM0化的特异性和能力在衰竭心脏中不太可能改变。最重要的问题似乎是SUM01的供应降低。据此，感兴趣地注意到，细胞泛素水平的耗竭足以造成神经功能不良和死亡(Ryu et al., 2008) 0
[0054]在下文公开的实验中，公开了新的调节机制，其中SUM0化影响或调节SERCA2a活性和心肌细胞的总体收缩性质。此外，SUM01对心脏收缩性和存活的显著有益效果表明，靶向于SUM01会在心衰治疗中具有治疗价值。 [0055]以下实施例展示了本申请的实施方案。实施例1公开了本文所述的实验中使用的材料和方法。实施例2公开的数据证实了 SUM01与SERCA2a相互作用。实施例3证实了 SERCA2a的SUM0化在衰竭心脏中降低。实施例4证实了 SERCA2a在赖氨酸残基K480和K585发生SUM0化。实施例5证实了 SERCA2a的SUM0化增强SERCA2a的ATP酶活性。实施例6证实了 SUM0化增强SERCA2a稳定性。实施例7证实了 SUM01超表达增强心肌细胞收缩性并增强分离的心肌细胞的Ca2+瞬变。实施例8进一步证实了 SUM01超表达改善TAC诱导的心衰的心脏功能。实施例9证实了小发夹RNA介导SUM01下调，这加速了心脏功能不良。
[0056]实施例1
[0057]该实施例提供了本文所述的实验中使用的材料和方法的描述。
[0058]体内SUM0化测定
[0059]为了分析细胞中的SUM0化，Lipofectamine 2000被用于转染HEK293细胞，使用了编码SERCA2a野生型(WT)或SERCA2a SUMO化位点突变体，以及flag标记的SUM01和myc标记的Ubc9的质粒。通过在含有20mM N-乙基马来酰亚胺的冰冷裂解缓冲液(50mMTris-Cl,pH8.0,150mM NaCl，0.l%Triton X-100, lOmM EDTA，完全蛋白酶抑制剂[每 10ml —片；Roche],以及蛋白磷酸酶抑制剂混合物(Sigma))中超声处理来裂解细胞。30，000g下离心20分钟，使裂解物澄清。然后，通过使细胞裂解物与flag特异性亲和基质凝胶(Sigma)在4°C下过夜孵育，对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后将免疫沉淀物在冷裂解缓冲液中洗涤。通过SDS-PAGE解析免疫复合物，并利用SERCA2a特异性抗体(即，抗SERCA2a抗体)对其进行免疫印迹。
[0060]在裂解缓冲液中制备新鲜的组织提取物用于体内SUM0化测定。将来自每个实验和对照组的心脏在液氮中冷冻。将冷冻组织在裂解缓冲液中磨碎并匀浆，如上文所述，利用MP匀浆系统(FastPr印匀浆仪)。通过30，000g下离心20分钟去除不溶部分。将提取物与抗SUM01琼脂糖树脂在搅拌下过夜孵育。通过免疫印迹利用特异性一抗检测SUM0的缀合形式。
[0061]SERCA2a 活性测定
[0062]按照以前的描述(Clarke et al.，1989)制备粗的微粒体。按照以前的描述(Ha j jar et al.，1997)，利用丙酮酸盐/NADH偶联反应进行SERCA2a活性测定。按照下述计算Ca2+-ATP酶的活性:Λ吸光度/6.22Χ蛋白X时间(单位为nmol ATP/mg蛋白Xmin)。所有测定一式三份进行。
[0063]条件化SUM01转基因小鼠的产生[0064]将a MHC-flox-小鼠SUM01转基因亚克隆入pML2G载体，该载体在两个ΙοχΡ位点之间具有EGFP cDNA。将DNA构建体微注射入B6C3小鼠的受精卵，并通过PCR确认转基因整合。
[0065]统计学分析
[0066]利用Student’s t检验进行分析，显著的差异表示为单个星号(*),表明p〈0.05，或两个星号(**)，表明p〈0.001。图中的数据显示为平均值土标准差。
[0067]实施例2
[0068]SUM01 与 SERCA2a 相互作用
[0069]作为鉴定SERCA2a的新的调节物的方法，利用抗SERCA2a抗体、通过免疫沉淀从猪心脏裂解物分离SERCA2a相关蛋白复合物，然后通过双向电泳进行分析(图1A)。染色的蛋白点的MS/MS分析表明，SUM01与SERCA2a共沉淀。SUM01的代表性的MS/MS肽指纹显示于图1B。用编码SERCA2a和flag标记的SUM01的质粒共转染HEK293细胞。用抗flag抗体进行免疫沉淀，随后用抗SERCA2a抗体进行免疫印迹，结果表明，SERCA2a的确与SUM01结`合(图1C)。在用编码SERCA2a和MYC标记的Ubc9 (SUMO缀合酶)的质粒共转染的HEK293细胞上进行了相似的实验，也证实了 SERCA2a结合Ubc9(图1D)。这些数据证实SERCA2a是SUM0化的靶标。
[0070]实施例3
[0071 ] SERCA2a的SUM0化在衰竭心脏中降低
[0072]随后，我们检测了 SERCA2a是否在心脏中确实SUM0化。用抗SUM01抗体对人心脏裂解物进行免疫沉淀，并用抗SERCA2a抗体探测。除了正常SERCA2a条带(~llOkDa)之外，检测到了缓慢迁移的SERCA2a条带(150~250kDa)(图2A，上图)，其代表SUM0化的SERCA2a。与正常心脏(NF)相比，衰竭心脏(HF)中SUM0化的SERCA2a的水平显著降低。此外，SERCA2a水平在衰竭心脏中显著降低，这与之前的报道一致，并且支持心脏样品制备物的正确性。与SERCA2a水平降低一起观察到的是，SUM01水平在衰竭心脏中也显著降低。相比之下，Ubc9和SENP1 (分别为关键的SUM0化酶和脱SUM0化酶)的水平在衰竭心脏中没有改变(图2A，下图)。这些数据表明，SERCA2a的SUM0化降低可能主要是由于SUM01水平降低，而不是SUM0化活性降低或脱SUM0化活性升高。
[0073]我们还观察到，SUM01水平以及SERCA2a水平在压力超负荷诱导的HF鼠模型(图2B)和容量超负荷诱导的HF猪模型(图2C)中显著降低。这些结果表明，由SUM01水平降低导致的SERCA2a的SUM0化降低是与不同哺乳动物种类中HF的发展相关的主要特征。
[0074]实施例4
[0075]SERCA2a 在赖氨酸 480 和 585 处 SUM0 化
[0076]靶蛋白的SUM0化已知发生在高度保守的识别基序的背景下的赖氨酸残基上，高度保守的识别基序为ΨΚχΕ/D(其中Ψ代表大的疏水氨基酸，X代表任何氨基酸)(Sampson et al., 2001)。三个独立的 SUM0 化预测程序(http: //bioinformatics,lcd-ustc.0rg, http://www.abgent.com.cn/doc/sumoplot, http://sumosp.biocuckoo,org/prediction.php)鉴定了 SERCA2a中两个推定的SUMO缀合位点，赖氨酸480 (K480)和585(K585)。这些赖氨酸残基位于ATP结合的胞质核苷酸结合结构域中，并在小鼠、大鼠、猪以及人SERCA2a中完全保守(图3A)。[0077]为了研究SERCA2a K480和K585在SUM0化中的作用，我们制造了 3个SERCA2a变体，其中K480或K585被精氨酸替换(分别为K480R和K585R)或K480和K585都被精氨酸替换(K480R/K585R)。用编码野生型(WT)和这些SERCA2a变体的质粒转染HEK293细胞，随后，用抗SUM01抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用抗SERCA2a抗体探测。尽管K480R和K585R的SUM0化情况与WT SERCA2a无差异，但K480R/K585R完全未SUM0化(图3B)。当以剂量依赖的方式将更大量的SUM01质粒共转染时，WT SERCA2a的SUM0化得到增强，而K480R/K585R的SUM0化则完全去除(图4C)。综上，这些结果表明，SERCA2a在K480和K585残基发生SUM0化。
[0078]实施例5
[0079]SUM0化增加SERCA2a的ATP酶活性
[0080]由于SUM0化的赖氨酸残基K480和K585位于SERCA2a的核苷酸结合结构域中，因此SUM0化可能影响SERCA2a的ATP酶活性。将WT和SUM0化缺陷型K480R/K585RSERCA2a从用相应质粒以及空质粒或SUM01表达质粒转染的HEK293细胞的裂解物进行免疫沉淀，并测定ATP酶活性。与WT SERCA2a相比，K480R/K585R具有显著降低的Vmax (WT ；94.60±1.63，K480R/K585R ;37.95±5.40nmol/min/mg)，并且与 WT SERCA2a 相比，K480R/K585R 具有显著增加的 EC50 值(WT ;0.24±0.09，K480R/K585R ;0.76±0.17 μ mo 1 Ca2+/L)。在 WT SERCA2a 中，SUM01 的共表达显著增加 Vmax (98.58±1.83nmol/min/mg)并降低EC50 (0.11±0.09ymol Ca2+/L)，然而 SUM01 的共表达不影响 K480R/K585R 的 ATP 酶活性(图 3D)。
[0081]进一步的实验解决了 SUM0化是否影响SERCA2a的ATP结合亲和力。用WT或K480R/K585R SERCA2a表达质粒、以及空质粒或SUM01表达质粒转染HEK293细胞。将细胞裂解物与ATP琼脂糖孵育，并用抗SERCA2a抗体探测得到的沉淀物。结果表明，SUM0的共表达显著增加SERCA2a的ATP结合亲和力。相比之下，K480R/K585R具有显著降低的ATP结合亲和力，并且不受SUM01共表达的影响(图3E)。这些数据表明，SUM0化增加SERCA2a的ATP酶活性，至少在一定程度上是通过增强ATP结合亲和力。
[0082]实施例6
[0083]SUM01增强SERCA2a蛋白的稳定性
[0084]本文公开的资料证实，衰竭心脏中SERCA2a水平降低，并伴随SUM01水平降低(图2)。随后，研究了 SUM0化影响SERCA2a的稳定性的可能性。用WT或K480R/K585R SERCA2a表达质粒、以及空质粒或SUM01表达质粒转染HEK293细胞。转染后48小时，用环己酰亚胺(蛋白合成抑制剂)处理细胞以阻断SERCA2a的进一步从头合成。再孵育3和5天后，通过免疫印迹测定SERCA2a水平。WT SERCA2a的估计的半寿期为4.90±0.70天，但是当共表达SUM01时，其增加到5.90±0.2天。与WT SERCA2a相比，K480R/K585R的估计的半寿期显著降低(共表达和不共表达SUM01时分别为2.42 ±0.50和2.35±0.80天)(图3F)。这些数据表明，SUM0化增加SERCA2a的稳定性。
[0085]实施例7
[0086]SUM01超表达增强心肌细胞收缩性和分离的心肌细胞中Ca2+瞬变
[0087]为了检测SUM01的生理学功能，从正常(假操作)或TAC诱导的衰竭心脏(HF)分离小鼠成体心肌细胞，然后用表达β-gal (Ad-β-gal)或SUM01 (Ad_SUM01)的腺病毒感染。利用配备有可视化边缘检测系统的双重激发分光荧光计测定收缩性质。与Ad-β -gal感染的心肌细胞相比，当用Ad-SUMOl感染时，正常心肌细胞表现出增强的收缩性，其中细胞缩短增加11%，最大收缩率增加17%，最大松弛增加9%。当用Ad-SUMOl感染衰竭心肌细胞时，观察到更明显的收缩性增强，其中细胞缩短增加27%，最大收缩率增加30%，最大松弛增加27%。与Ad-β -gal感染的心肌细胞相比，Ad-SUMOl感染的心肌细胞表现出增加的钙幅度和Ca2+衰变。SUM01超表达的总体的影响肌肉收缩的效果与SERCA2a被超表达时的效果相当(图4)。预期的是，SUM01超表达增强心肌细胞收缩性，至少在一定程度上是通过增加SERCA2a的酶学活性和稳定性。
[0088]实施例8
[0089]SUM01超表达改善TAC诱导的心衰的心脏功能。
[0090]我们继续研究了 SUM01超表达的体内生理学结果。为此，我们利用了 Cre/loxP条件性表达体系，其中给予三苯氧胺诱导心脏特异性SUM01超表达，替换EGFP表达(图5A)。在该转基因小鼠中未观察到明显的心脏功能不良(表S1)。免疫印迹表明，转基因小鼠(TG)中三苯氧胺诱导的SUM01表达水平高于野生型同窝出生仔(WT)约5倍(图5B)。
[0091 ] 对WT和TG小鼠进行TAC操作。两个月发展为HF，缩短分数(FS)降低约40_50%。然后，给予三苯氧胺4天来诱导SUM01超表达。伴随SUM01水平增加，SERCA2a的SUM0化和蛋白水平被三苯氧胺给药显著诱导(图S2)。一个月后(TAC后共3个月)，通过组织学和超声心动图检查心脏功能。代表性的心脏切片和Μ型超声心动图数据如图5C所示。WT和TG小鼠在基线时没有区别。TAC后3个月，WT小鼠表现出严重的衰竭表型，其中左心室(LV)显著扩张并且FS和射血分数(EF)降低。然而，三苯氧胺诱导的SUM01超表达明显地逆转了这些衰竭表型，其中LV扩张减小(LV舒张内径(LVIDd)在TG中为3.24±0.33mm,相比于 WT 中的 4.40±0.57mm，ρ〈0.001 ；LV 收缩内径(LVIDs)在 TG 中为 1.44±0.30mm，相比于WT中的2.93±0.54mm,ρ<0.001)和提高的FS (TG中为55.91±6.70%，相比于WT中的 34.30 ±5.56%, ρ〈0.001)和 EF (TG 中为 90.26 ±4.27%,相比于 WT 中的 69.57 ±7.28%,ρ〈0.001)(图 。
[0092]血液动力学分析也证实TG中改善的LV功能。TG动物的LV的收缩末期压力-容量关系(ESPVR)稍陡于WT，这提示心脏收缩性增加(图S3)。相比之下，TG小鼠中LV的舒张末期压力-容量关系(EDPVR)的斜率降低，这指示舒张末期LV室硬度降低。包括每搏输出量、舒张末期容量以及收缩末期容量在内的LV扩张的参数在TG中同样恢复。此外，心脏重量与体重的比值的增加在TG也被显著抑制(表S2)。
[0093]SUM01导致的心脏功能不良的恢复还表现为在长期压力超负荷下的TG的存活增加(图5E)。在给予三苯氧胺后100天，在TG中，存活的小鼠为14/14 (100%)，而在WT中仅为 7/15(47%)。
[0094]我们进行了免疫印迹来监测参与Ca2+稳态的关键调节蛋白的表达水平。TAC下的主要改变为SERCA2a水平降低(与假操作相比降低65%)，这与多个之前的报道一致，以及NCX1水平升高(与假操作相比升高56%)。NCX1负责舒张期胞质Ca2+清除。之前已经证实，SERCA 功能的下降与衰竭心脏(Schillinger et al., 2003; Studer et al.，1994)和递送针对SERCA2a的siRNA后的分离的心肌细胞(Seth et al., 2004)中NCX功能的升高有关。这些TAC诱导的SERCA2a和NCX1水平的改变在TG中被正常化(图5F)。[0095]TAC导致WT中SERCA2a的ATP酶活性显著降低，其中Vmax降低50%(TAC ；40.39±5.08，假操作；81.03±7.llnmol/min/mg)，EC50 增加 120%(TAC ;0.31 ±0.021，假操作；0.14±0.08μηπιο1 Ca2+/L)。然而，这种TAC诱导的ATP酶活性的降低在TG中显著改善，其中 Vmax 降低 15%(TAC ；70.32 ±5.54，假操作；82.29 ±5.39nmol/min/mg)，EC50 增加59%(TAC ；0.27±0.12，假操作；0.166±0.09 μ nmol Ca2+/L)。
[0096]综上，这些数据表明，SUM01超表达能恢复压力超负荷诱导的心脏功能不良。
[0097]实施例9
[0098]shRNA介导的SUM01下调加速了心脏功能不良
[0099]为了评价下调心脏中SUM01的效应，我们制备了重组腺相关病毒血清型9 (rAAV9)，其在U6启动子的控制下表达针对SUM01的短发夹RNA (或称为shRNA)，(rAAV9/shSUMOl)或杂乱序列(rAAV9/SC)(图6A)。将这些rAAV构建体通过尾静脉、以5X 101°病毒基因组(vg)/小鼠的剂量注射入B6C3/F1雄性小鼠。注射后3周，对心脏提取物的免疫印迹表明，注射rAAV9/shSUM01的心脏中SUM01水平降低约70%，但是在注射rAAV9/SC的心脏中没有下降。SUM02、SUM03、Ubc9以及SENP1的表达水平没有被rAAV9/shSUM01影响(图 6B)。
[0100]注射后6周，评价心脏功能。心脏的整体形态学和代表性的Μ型超声心动图图像分析如图6C所示。与来自注射rAAV9/SC的小鼠的心脏相比，来自注射rAAV9/shSUM01的小鼠的心脏表现出明显的左心 室(LV)扩张和功能衰减，其中左心室舒张期内径LVIDd增加(shSUMOl ；3.85±0.17mm, SC ；3.42±0.19mm, p〈0.001)，左心室收缩期内径 LVIDs 增加(shSUMOl ；2.02±0.17mm，SC ；1.30±0.12mm，p〈0.001)，FS 降低(shSUMOl ；47.63±3.07%,SC ;61.77±4.77%，p〈0.001)，EF 降低(shSUMOl ;84.51 ±2.63%，SC ;93.85± 1.23%，p〈0.001)(图 6D)。
[0101]血液动力学分析表明，注射rAAV9/shSUM01导致LV压力-容量环右移，并且收缩末期压力-容量关系ESPVR降低，这指示SUM01下调的负肌肉收缩效应。注射更大剂量的rAAV9/shSUM01导致心脏功能不良更加严重(图S4A和S4B)。在注射rAAV9/shSUM01的心脏中还观察到增大的心脏重量/体重比值(表S3)。
[0102]rAAV9/shSUM01诱导的心脏功能不良表现在注射rAAV9/shSUM01的小鼠的突然死亡。所有接受1 X 10nvg的rAAV9/shSUM01的小鼠在3周内死亡。接受3 X 1010vg和5 X 1010vg的rAAV9/shSUM01的小鼠的死亡率稍高于接受rAAV9/SC的对照小鼠，但统计学上不具显著性。在实验期间，对照小鼠未发生死亡(图6E)。
[0103]免疫印迹表明，在注射rAAV9/shSUM01的心脏中，SERCA2a蛋白水平降低约40%。与此相关的是，钠/钙交换蛋白NCX1蛋白水平稍微升高，但是该升高在统计学上不具显著性。但是，PLN(受磷蛋白)和RyR2(兰尼定受体2)蛋白水平没有改变。正如所预期的，SERCA2a的SUM0化也显著减弱(图6F)。PLN和RyR2的SUM0化没有改变(图S4C)。这些结果证明，SUM01增加SERCA2a的SUM0化和SERCA2a的稳定性。
[0104]通过注射rAAV9/shSUM01使SUM01下调抑制了 SERCA2a的ATP酶活性，其中Vmax 降低(shSUMOl ；48.11 ±6.34，SC ；61.12±6.49nmol/min/mg)，EC50 增加 (shSUMOl ；
5.69±0.23，SC ；0.10±0.07ymol/L)(图 6G)。当注射更高剂量的 rAAV9/shSUM01 时，SERCA2a的ATP酶活性受损更严重(图S4D)。[0105]综上，本文公开的资料证实，SUM01是心脏中SERCA2a功能的重要调节者。
[0106]通过引用的方式将本文引用的每篇文献整体并入本文。
[0107]参考文献
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【权利要求】
1.治疗个体心脏功能不良的方法，包括给予所述个体治疗有效量的SERCA2a翻译后修饰的调节剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述心脏功能不良选自心衰、压力超负荷诱导的心脏功能不良、以及受抑制的钙衰变诱导的心脏功能不良。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述心衰包括收缩功能不良。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述心衰是TAC诱导的心衰。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述个体是人。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述调节剂调节SERCA2a翻译后SUMO化。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述调节剂是包含编码选自SERCA2a和SUM01的蛋白的可表达编码区的载体，并且其中所述编码区可操作地连接于至少一个表达控制元件。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述重组腺相关病毒是rAAVl。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述调节剂调节SERCA2a翻译后乙酰化。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述调节剂是Sirtl脱乙酰酶。
12.通过抑制SERCA2a降解来治疗个体的心血管病症的方法，包括给予治疗有效量的SUM01 剂。
13.如权利要求12所述的方 法，其中所述SUM01剂是包含编码选自SERCA2a和SUM01的蛋白的可表达编码区的载体，并且其中所述编码区可操作地连接于至少一个表达控制元件。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述重组腺相关病毒是rAAVl。
16.诊断发展为心衰的倾向性的方法，包括确定对应于选自人SERCA2a(SEQID NO:2)的第479-482位和/或第584-587位中任何一个的位置的氨基酸。
17.诊断发展为心衰的倾向性的方法，包括确定编码对应于人SERCA2a(SEQID N0:1)的氨基酸479-482或584-587中任何一个的氨基酸的多核苷酸序列。
18.诊断发展为心衰的倾向性的方法，包括测定个体的心肌细胞中SUM01的表达水平，并将所述水平与健康对照的心肌细胞中SUM01的表达水平比较，其中SUM01表达相对于对照降低指示发展为心衰的倾向性。
19.筛选治疗心衰的治疗剂的方法，包括在存在和不存在候选治疗剂的情况下使SUM01与SERCA2a接触，以及如果在存在候选治疗剂时SERCA2a的SUM0化水平高于不存在候选治疗剂时SERCA2a的SUM0化水平，则将所述候选治疗剂鉴定为治疗剂。
【文档编号】C12N15/11GK103648506SQ201280034681
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2011年7月13日
【发明者】罗杰·约瑟夫·哈加尔, 高昌源, 李亚英 申请人:西奈山伊坎医学院