改善心脏功能的基于细胞和基因的方法
【专利摘要】本发明提供了用于改善哺乳动物的心脏功能、心肌收缩力和舒张的组合物和方法。将用一个或多个表达载体转染的心肌细胞移植至哺乳动物心肌，所述表达载体包含有效地连接于启动子的核糖核苷酸还原酶亚基R1编码核酸序列和核糖核苷酸还原酶亚基R2编码核酸序列。还提供了用于通过移植过表达R1和R2的供体细胞而向心肌递送dATP的组合物和方法。由此原位产生dATP并通过在供体细胞和宿主心肌细胞之间形成的缝隙连接而递送。或者，将具有R1和R2编码构建体的病毒载体直接给哺乳动物施用。心脏功能的改善还可通过施用包含编码L48Q-Q、61Q或L57Q?cTnC变体的核酸序列的载体来实现。
【专利说明】改善心脏功能的基于细胞和基因的方法
关于在联邦政府所资助的研究或开发下获得的发明的权利的声明
本发明是在由国立卫生研院授予的基金号N0.HL61683、R21HL091368、HL07828、HL65497、R01HL64387、R01HL084642和P01HL004374下通过政府资助进行的。政府在本发明中具有某些权利。
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§ 119(e)规定要求2011年5月26日提交的美国临时申请N0.61/490, 450 (通过引用整体并入本文)的利益。
发明背景 心脏病在美国是死亡率和发病率的首要病因，并且在世界范围内已急剧上升S。肌节的心脏病例如HCM和DCM牵涉通常导致心力衰竭以及在一些情况下突发心脏死亡的几个肌丝蛋白之一的氨基酸突变kM。随着已鉴定并且进行了功能表征的突变体的数目增加，出现了一些在改变的收缩性质方面显示潜在相似性的模式。例如，大多数HCM突变导致去膜化心肌的收缩力的Ca2+敏感性增强IdMZ，而大多数DCM变体导致力的Ca2+敏感性降低kltil。然而，肌丝Ca2+敏感性的这些改变牵涉疾病进展的程度还不清楚。未曾对改变的肌丝Ca2+结合与SR功能之间的潜在和重要的相互作用进行过系统性研究，也未曾对与其它细胞内Ca2+缓冲剂(例如，线粒体)或基因调控的相互作用进行过系统性研究。
许多心脏病理学以及缺血-再灌注损伤和心肌梗塞因一部分心肌的损伤和/或死亡而导致减弱的收缩功能，这大大地削弱了心脏功能。梗塞的心脏通常不满足身体的心血管需要，并且试图通过增强β_肾上腺素能活化来补偿。然而，长期β_肾上腺素能刺激耗尽了收缩功能储备，会升高舒张Ca2+水平，并且最终导致肾上腺素能反应的下调，从而导致末期心脏衰竭重要地，动物模型和患者二者中的许多研究已注意到梗塞后肌丝η_16*和肌浆网(SR)以及肌浆17，18*蛋白含量和磷酸化的改变，这将改变力的肌丝Ca2+灵敏性和Ca2+瞬时释放/重吸收。已在表达与DCM和HCMil.相关的突变的心脏中观察到类似的变化。虽然这些适应中通常牵涉激素水平(例如β-肾上腺素能激动剂)的总体改变，但其机制可归因(至少部分地)于SR与肌丝蛋白之间的细胞内相互作用。
心脏功能在许多心血管疾病包括心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、糖尿病、高血压以及肥厚性和舒张型心肌病中受损。这些病理生理学状况通常改变心肌细胞的Ca2+周期\ β -肾上腺能反应性2和/或收缩器2迄今为止，治疗努力主要集中在增加[Ca2Ii，其倾向于发挥致心律失常作用，通过减缓舒张性松弛来减少心室充盈￡，以及引起SR Ca2+过载，从而起始触发的活性19*。其它牵涉肾上腺素能药的方法可具有不期望的长期副作用，例如非靶区域内的显著的药物作用、致心律失常的触发的活性和快速发展成心脏衰竭的可能性2。因此期望有抵御心脏功能障碍的新的方法。
备用的方法包括使用增强Ca2+对心肌肌钙蛋白C (cTnC)的结合和增强收缩力的Ca2+敏化剂4。已进行了相当大的努力来开发增强Ca2+对cTnC的N末端(位点II，‘触发位点’)的结合并且增强收缩活化的药物例如卡米达佐、节普地尔和levosimenden。一些与这样的化合物相关的缺点包括它们对cTnC的非特异性和对Ca2+处理中涉及的蛋白质21’22以及兴奋收缩偶联途径的其它方面5的有害作用。
鉴于与通常目标在于减缓心力衰竭的进展(与恢复功能相反)的各种常规药理学和手术方法相关的缺点，需要有改善心脏功能的新型方法。本发明提供了更多的靶向方法，用于增强心脏收缩而不影响EC偶联6，即产生具有改变的Ca2+结合性质的重组新型cTnC变体或通过核糖核苷酸还原酶原位产生或施用dATP (以用作心脏收缩的替代底物)。
发明概述
本发明的一个方面基于以下令人惊讶的发现:dATP总体细胞水平的甚至轻微升高(低至腺嘌呤核苷酸总库的1.0%-2%)就可对心肌收缩力产生实质性改善。dATP水平的升高通过本发明的方法，使用表达启动子驱动的Rrml (核糖核苷酸还原酶亚基I)或Rrm2 (核糖核苷酸还原酶亚基2)的载体给个体施用或通过将利用所述载体转导的供体细胞移植至宿主心肌来实现。预料之外的还有本发明公开的方法改善收缩力以及似乎增强钙敏感性而无相应的对心脏舒张或Ca2+瞬变的不利作用的能力。相反地，心脏舒张因dATP水平升高而明显更快。心脏功能的改善表现在左室部分缩短以及分离的心肌细胞的收缩和舒张的程度和速率增加，如通过超声心动描记术和1nOptix系统电视显微镜检查观察到的。在具有正常或梗塞的心脏的小鼠和大鼠研究中确认了本发明的益处。升高的dATP水平具有在朗根多夫-工作心脏研究中增强前负荷反应性和挽救心力衰竭的作用。核糖核苷酸还原酶的自调控机制，即通过ATP的变构活化和通过dATP的抑制还通过阻止(通过RR的过表达)dATP水平达到毒性水平来提供另一个显著的有利方面。这样，本发明提供了无各种与控制Ca2+水平或肾上腺素能信号转导的常规治疗法相关的缺点(例如心律失常发生、减缓的舒张松弛对心室充盈的损害、非靶区域的副作用以及潜在地加速进展成心力衰竭)的新型治疗法。
本发明的另一个方面是基于改变的肌丝Ca2+结合(和收缩性质的相关变化)对正常和患病心肌的I)心脏肌浆网(SR)功能和2)心脏性能的作用的发现。对于这些研究，我们已产生了几种具有增强的或减小的Ca2+结合亲和力的cTnC变体。当交换到化学去膜化心肌或心脏肌原纤维中时，这些cTnC变体相应地增加或减小力的Ca2+敏感性I。产生包含编码这些cTnC变体(具有C末端His-标签)+GFP的cDNA的腺病毒载体和转染的培养成年大鼠心肌细胞以用于受刺激收缩的研究，其中L48Q cTnC变体显示增强的Ca2+结合亲和力(相对于WT cTnC)，其极大地增强收缩的幅度和速率i，并且对Ca2+瞬变几乎没有影响或根本没有影响(通过参比fura-2荧光测量的)。显著地，L48Q cTnC表达拯救了来自梗塞心脏的细胞的收缩性和Ca2+瞬变幅度特征的损失。在另一方面，I61Q cTnC变体显示了减小的Ca2+结合亲和力，减小的收缩幅度(>60%)和速率，以及令人惊讶地，减小的Ca2+瞬变幅度(>20%)和上升速率。这些数据表明肌丝Ca2+结合与SR Ca2+释放之间的相互作用。令人惊讶地，在本文中显示AAV6-L48Q cTnC的全身性注射在第2周使正常小鼠的心脏射血分数增加20%，在第3周增加30-40% (图12)。
在本发明的一个方面，提供了用于改善哺乳动物(例如人)的心脏功能、心肌收缩力和心肌舒张的方法和组合物。将包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一表达载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二表达载体的心肌细胞移植至需要治疗的哺乳动物(例如具有梗塞心肌的哺乳动物)的心肌中。所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接了诱导Rl和R2过表达的启动子。在一些实施方案中，所述编码Rl和R2的构建体是同一表达载体上的部分，或位于不同的表达载体上。启动子在一些情况下可选自用于在心脏中进行选择性表达的心脏特异性启动子，例如cTnT455。本领域技术人员可理解，可使用适用于诱导真核细胞例如哺乳动物细胞的表达的其它启动子。在一些具体的实施方案中，过表达由CK7启动子或CMV启动子驱动。
dATP的细胞产生通常通过核糖核苷酸还原酶(R1R2)的作用在哺乳动物细胞中进行，所述核糖核苷酸还原酶从ADP的核糖环上的2-位除去羟基部分而产生dADP。随后dADP被快速地转化成dATP。本发明的有利方面可通过Rl和R2的过表达来实现，所述Rl和R2形成核糖核苷酸还原酶复合物，最终导致dATP的原位产生。
在一些实施方案中，表达载体是病毒载体，例如腺伴随病毒载体，例如AAV6，AAV2, rAAV2/1，rAAV2/2, rAAV2/3, rAAV2/4, rAAV2/5, rAAV2/6, rAAV2/7, rAAV2/8, rAAV2/9, rAAV2/10,rAAVM41，dsAAV等。在不同的实施方案中，表达载体还包含转导报道物。心肌细胞可来源于哺乳动物来源的胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞。在一些实施方案中，所述方法使用来源于人干细胞的心肌细胞。iPSC可来源于从待治疗的哺乳动物收获的细胞，例如成纤维细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括在移植心肌细胞之前用编码Rl和R2的第一和第二表达载体离体转导所述心肌细胞。心肌细胞的移植可通过经由导管的递送来实现。在涉及治疗梗塞心肌的实施方案中，可将心肌细胞递送至包含活细胞的心肌的区域，例如心肌的非梗塞区域。
或者，哺乳动物 例如人的心脏功能以及心肌收缩力和舒张的改善可通过施用包含编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一病毒载体和包含编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二病毒载体来实现，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子例如cTnT455。所述Rl和R2编码构建体可以是同一病毒载体的部分或位于不同的病毒载体上。在一些实施方案中，病毒载体是腺伴随病毒载体。病毒载体可以全身性(例如通过静脉内注射)或局部(例如通过心肌内注射)施用。病毒载体还可编码特异性地结合心脏特异性标志物的靶向试剂。在一些实施方案中，病毒载体还包含转导报道物。在其它实施方案中，所述方法还包括施用包含编码L48Q cTnC变体的核酸序列的病毒载体，其中cTnC变体显示对Ca2+的结合亲和力增强，并且所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
在本发明的另一个方面，提供了将dATP递送至哺乳动物宿主例如人宿主的心肌的方法。将过表达核糖核苷酸还原酶亚基Rl和核糖核苷酸还原酶亚基R2的供体细胞移植至心肌。在某些实施方案中，供体细胞包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一表达载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二表达载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于诱导Rl和R2过表达的启动子。本领域技术人员将能够理解编码Rl和R2的构建体可以是同一表达载体的部分。
核糖核苷酸还原酶复合物原位产生dATP并且通过供体细胞与宿主心肌细胞之间建立的缝隙连接被转移至哺乳动物宿主的心肌细胞。在一些实施方案中，dATP被递送至梗塞的心肌。在一些优选实施方案中，dATP被递送至含有活细胞的心肌的区域，例如非梗塞区。供体细胞例如心肌细胞、成纤维细胞的移植可通过利用导管的递送来实现。如本领域技术人员所理解的，心肌细胞可来源于干细胞，例如多能ESC，iPSC、间充质干细胞，选自与宿主生物相容的来源。例如，iPSC来源于从哺乳动物宿主收获的细胞，例如成纤维细胞在 本发明的另一个方面，提供了通过施用编码L48Q cTnC变体的病毒载体来改善个体的心脏功能的方法，其中编码cTnC变体的核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。L48QcTnC变体显示增加的位点II Ca2+结合亲和力。在一些实施方案中，个体患有导致收缩减少的心脏病况。这些方法可用于经诊断患有心肌病例如缺血性心脏病、心肌病、心肌梗塞或特征在于减弱的收缩功能的个体。示例性的心肌病理学包括但不限于原发性心肌病、遗传性心肌病和扩张型心肌病。在一些实施方案中，需要治疗的个体具有一个或多个与肌纤维收缩和/或扩张型心肌病表型的Ca2+敏感性降低相关的基因突变。这样的基因突变的实例包括但不限于错义突变Ser532Pro和Phe764Leu、cTnT的缺失(δ Lys210)，或基因MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3, TPM1、ACTC、MYL2、MYL3的突变，或其组合，如文献中记录的。
或者，可改善在选自心肌肌球蛋白重链、心脏肌动蛋白、心肌肌钙蛋白Τ、α-原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白1、心脏肌球蛋白结合蛋白C和肌球蛋白轻链的肌节蛋白中具有一个或多个基因突变的个体的心脏功能，所述突变与肌纤维收缩和/或肥厚性心肌病表型的Ca2+敏感性增强相关。这样的基因突变的实例包括但不限于cTnT的残基92上的突变，例如 R92W、R92Q 和 R92L cTnT，或 MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1、ACTC、MYL2、MYL3 上的突变及其组合，如文献中记录的。改善心脏功能的方法包括给所述具有Ca2+致敏的基因突变的个体施用包含编码L57Q或I61Q cTnC变体的核酸序列的病毒载体，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。L57Q和I61Q cTnC变体显示减小的位点II Ca2+结合亲和力，能够用于治疗经诊断患有肥厚性心肌病的个体。在一些实施方案中，通过例如脂转染、在支架上涂覆或直接注射(例如通过导管)施用编码L48Q、L57Q或I61Q cTnC变体的病毒载体。病毒载体可选自腺伴随病毒载体。
在本发明的另一个方面，提供了用于改善心脏功能和/或心肌收缩力和/或心肌舒张的药物组合物。所述药物组合物可包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一病毒载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二病毒载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。在一些实施方案中，所述编码Rl和R2的构建体位于同一病毒载体上或位于不同的病毒载体上。或者，所述药物组合物包含已用编码Rl和R2的病毒载体转导的心肌细胞。本文中描述的其它药物组合物包含具有编码L48Q cTnC变体的核酸序列和/或编码I61Q cTnC变体的核酸序列和/或编码L57Q cTnC变体的核酸序列的病毒载体。所述病毒载体可选自腺伴随病毒载体，例如 AAV6、MV2、rAAV2/1、rAAV2/2、rAAV2/3、rAAV2/4、rAAV2/5、rAAV2/6、rAAV2/7、rAAV2/8、rAAV2/9、rAAV2/10、rAAVM4UdsAAV等。在一些实施方案中，病毒载体还包含有效地连接于编码cTnC变体的核酸序列的CMV启动子。预期载体还可包含编码本领域技术人员认为合适的靶向剂的核酸序列。
附图概述
图1.未处理的心肌细胞(黑色)、经WT cTnC+GFP (蓝色)和L48Q cTnC+GFP (红色)转导的心肌细胞的代表性细胞长度追踪(A)和Ca2+瞬变(B，Fura-2荧光)。在0.5Hz受刺激的WT cTnC+GFP和L48Q cTnC+GFP转导的肌细胞相较于未处理的肌细胞的收缩(C)和Ca2+瞬变⑶性质的百分比变化。Vais=缩短的速率；FS=缩短分数；VMl=最大舒张速率；RT50j90=分别达到50%和90%舒张的时间；FL=荧光；DT5(I，9(I=分别达到50%和90%Ca2+衰减的时间，*相较于无处理而言P〈0.05，相较于WT cTnC而言t =p〈0.05。图2.刺激频率对收缩性质的作用。L48Q cTnC转导的肌细胞(实心三角形)与WTcTnC转导的细胞(空心圆)和未处理的肌细胞(实心圆)类似地响应于刺激频率，但在所有频率上显示升高的缩短分数(A)和缩短速率(B)。舒张速率(C)和达到90%舒张的时间(D)在各组间也是相似的，随着刺激频率增加而舒张的时间缩短。*=p〈0.05，相较于无处理而言；t =p<0.05，相较于WT cTnC而言；$ =p<0.05，对于所有组，相较于0.5Hz而言。
图3.刺激频率对Ca2+操纵性质的作用。L48Q cTnC转导的肌细胞(实心三角形)与以最弱(A)和最强(B)荧光显示的WT cTnC转导的(空心圆)和未处理的肌细胞(实心圆)类似地响应于刺激频率。关于心肌细胞舒张，达到50%(C)和90%(D)的Ca2+瞬变衰减时间随刺激频率增加而缩短。*=P〈0.05，相较于未处理而言；t =p<0.05，相较于WT cTnC而言；
? =Ρ〈0.05，对于所有组，相较于0.5Hz而言。
图4.评估为缩短分数除以最大fura荧光(Ca2+峰值)的收缩效率表明L48Q cTnC转导的心肌细胞(闭合三角形)在所有刺激频率上对Ca2+显著更敏感，而WT cTnC转导的心肌细胞(开圆)相较于无处理的心肌细胞(闭圆)对Ca2+的反应更小。*=ρ〈0.05，相较于无处理；t =ρ〈0.05，相较于WT cTnC。
图5.利用抗cTnC(A)探测的WT和L48Q cTnC-His转导的新生儿心肌细胞的Western印迹显示总的cTnC肌丝含量,而利用抗His (B)探测的Western印迹显示L48Q cTnC掺入至细肌丝中。光密度测定法显示L48Q cTnC置换58±7%的天然cTnC。
图6.未处理的心肌细胞(黑色)、仅GFP (绿色)和Rrml+Rrm2+GFP (红色)转导的心肌细胞的代表性细胞长度示踪(a)和Ca2+瞬变(b，Fura-2荧光)。在0.5Hz受刺激的仅GFP和Rrml+Rrm2+GFP转导的肌细胞相较于未处理肌细胞的收缩(c)和Ca2+瞬变(d)性质的百分比改变。V_=缩短的速率；FS=缩短分数;Vrel=最大舒张速率；RT5(l9(l=分别达到50%和90%舒张的时间；FL=荧光；DT5(i，9(i=分别达到50%和90%Ca2+衰减的时间，*p〈0.05，相较于无处理而言。
图7.刺激频率对收缩性质的作用。Rrml+Rrm2转导的肌细胞(空心三角形)与仅GFP转导的肌细胞(空心圆)和未处理的肌细胞(闭圆)类似地响应于刺激频率，但在所有频率上显示升高的缩短分数(A)和缩短速率(B)。舒张速率(C)和达到90%舒张的时间(D)在组间也是相似的，随着刺激频率增加而达到舒张的时间缩短。*=P〈0.05，相较于无处理而
言；t =p〈0.05，相较于GFP而言；} =ρ〈0.05，对于所有组，相较于0.5Hz而言。
图8.刺激频率对Ca2+操纵性质的作用。Rrml+Rrm2转导的肌细胞(空心三角形)在最弱(A)和最强(B)荧光方面与未处理的肌细胞(闭圆)类似地响应于刺激频率，而仅GFP转导的肌细胞(闭圆)显示两种情形均随频率增加而有更大增加。关于心肌细胞舒张，达到50%(C)和90%(D)的Ca2+瞬变衰减时间随刺激频率增加而缩短，但两者在R1R2转导
的心肌细胞中均急剧缩短。*=p〈0.05，相较于无处理而言；t =P〈0.05，相较于GFP而言；$=p〈0.05，对于所有组，相较于0.5Hz而言。 图9.评估为缩短分数除以最大fura荧光(Ca2+峰值)的收缩效率表明Rrml+Rrm2转导的心肌细胞(开三角形)在所有刺激频率上对Ca2+的反应显著更大，而仅GFP转导的心肌细胞(开圆)相较于未处理的心肌细胞(闭圆)在2Hz刺激频率上对Ca2+的反应更低。*=p〈0.05，相较于无处理而言；t =p〈0.05，相较于GFP而言。
图10.(A)利用抗Rrml抗体探测的Rrml转染的新生大鼠心肌细胞的Western印迹显示Rrml有大于24倍的增加。(B)利用抗Rrm2抗体探测的Rrm2转染的新生大鼠心肌细胞的Western印迹显示Rrm2有大于46倍的增加。Rrml+Rrm2过表达使新生大鼠心肌细胞的细胞内[dATP]显著增加超过10倍，如通过HPLC分析所评估的。*=p〈0.05，相较于GFP转导的心肌细胞而言。
图11.来自AV-cTnC转染的肌细胞的缩短(A)和Ca2+⑶追踪:非梗塞的(WT cTnC,黑色)、梗塞的对照(WT cTnC,红色)和梗塞的(L48Q cTnC,绿色)。
图12.未处理的(UN ；n=5)相对于低(L ；n=3)或高(H ；n=3)剂量的AAV6-L48Q的第2周(左)和3周(右)的左心室射血分数。
图13.AAV6L48Q cTnC注射的小鼠心脏组织(左)和未注射的对照(右)的抗cTnCwestern 印迹。
图14.AV转染细胞的亮视野(左)和荧光(右)图像。
图15.来自转基因动物的心肌组织的Western印迹分析(如所标记的)。Flag标记的cTnC显示为更高的分子量,并且flag-标记的相对于未标记的cTnC的密度计分析显示Tg动物中天然cTnC有40-50%置换。 图16.是LV功能的超声心动描记术(A-C)和工作心脏(D)测量，显示梗塞后功能损失。
图17.利用IHz (30hrs.)刺激的细胞相对于静态细胞而言收缩和Ca2+瞬变性质的百分比增加。
图18.Ca2+瞬变(rhod-2)显示L48Q (蓝色)相对于WT (黑色)cTnC有更快速衰减。
图19.⑷在WT、I61Q (蓝色)或L48Q (红色)cTnC交换后从pCa8至3.5至8的快速溶液转换下心脏肌原纤维活化和舒张动力学。(B)L48Q相对于WT cTnC而言有更高分辨率的舒张追踪。
图20.(A)未处理的和L48Q cTnC-His转导的心肌细胞肌丝的银染，显示细肌丝蛋白化学计量学的维持。(B)利用抗cTnC的Western印迹(左图框)显示cTnC肌丝的总含量，利用抗His的Western印迹(右图框)显示通过光密度测定法测量的细肌丝内58±7%的L48Q cTnC 掺入。
图21.胃1'相对于1610 cTnC转染的心肌细胞的肌原纤维磷酸化特征谱。(A)抗磷酸丝氨酸western印迹。(B)显示总蛋白质的SDS考马斯蓝染色。(C)显示磷酸化的Pro-Qdiamond。未观察到差异。
图22.使用斑点追踪回声心动描记术(speckle tracking echo-cardiography)的径向应变和应变率。(a)中心室短轴视图，颜色编码的区域代表用于径向应变分析(左上，箭头指示心脏收缩峰(S);每一条线对应于颜色编码区段)的前面、侧面、后面、下方和中隔心脏区段。(b)心缩期和两个舒张期-早期(E)和晚期(A)心舒期的径向应变率。
图23.以GAPDH作为上样对照的Rl (A)和R2⑶的Western印迹。转染的心肌细胞[dATP]的 HPLC(C)。
图24.长度(A)和Ca2+(B)瞬变显示R1R2转染的细胞相对于GFP和未处理的对照而言增加的缩短而无Ca2+的变化。
图25.缩短的程度㈧和速率(B)，达到50%舒张的时间(C)和最大Ca2+释放⑶在来自梗塞心脏的心肌细胞中全被降低，但相对于对照而言通过AV-R1R2转导被拯救或获得改善。
图26.(A)显示注射后第4天，相较于对照而言，AV-R1R2尾静脉和直接心脏注射的小鼠的左心室缩短分数的增加；(B)注射的LV，显示局部感染区域，由亮绿色荧光(来自GFP)显示的。
图27.R1R2过表达小鼠相对于对照同胞仔而言缩短分数增加百分比(A)和左心室内径的变化(B)。d-心舒期，S-心缩期。
图28.LV压力-容积关系㈧和对高[Ca2+]攻击的LV压力反应⑶。
图29.基线上和高[Ca2+]攻击后WT心脏(A)和TG-R1R2心脏(B)的NMR谱以及PCr/ATP比率(C)。基线上的ATP/HW(插图)。
图30.示踪小鼠主动脉平滑肌收缩。示踪，显示ATP和dATP(A)以及概述的数据(B)图31.AAV6L48Q cTnC注射的小鼠心脏组织(左)和未注射的对照(右)的抗cTnCwestern 印迹。
图32.(A)Rl和R2以及(B) α -微管蛋白(作为上样对照)的Western印迹。
图33.样品心脏肌原纤维活化和舒张示踪(右)。舒张的放大的慢相(右)。张力增加速率(kACT)。舒张的慢 相(kKEu?)。舒张的快相慢相持续时间(tKEu?)。
图34.LV功能的超声心动描记术(A-C)和工作心脏(D)测量，显示梗塞后功能的丧失。图35.第10秒(A)和4分钟(B)时将标记的dATP进行细胞注射至培养的心肌细胞内。与过表达R1R2的心肌细胞的共培养增强了野生型(受者)肌细胞的收缩性质(C)。利用AV-R1R2或AV-GFP转导hESC-CM，将这些转导的肌细胞与野生型(WT)未转导的Hesc_cmS共培养。AV-R1R2+GFP-转导的肌细胞(“dATP供体细胞”，蓝色迹线)与未转导的肌细胞(WTdATP受者，红色)的共培养物中两个伙伴都显示比它们的对应对照即AV-GFP转导的(“对照供体”细胞，绿色)或后者的WT受者(黑色)更大的收缩力。*p〈0.05，相对于对照而言。
图36.图36A显示AAV6-RlR2eTnT455注射的(4.5e13)小鼠和对照小鼠的骨骼肌、肺和心脏的Rl和R2亚基表达水平的初步western印迹证据。图36还提供了 20个月后来自非注射的(B)相对于AAV6-碱性磷酸酶(紫色；C)注射的小鼠36的心脏组织的数据，表明AAV6-RlR2cTnT455应当提供稳定的长期R1R2过表达。
图37显示1.5e13、4.5e13、1.35e14AAV6-RlR2cTnT455载体基因组或盐水(对照)在约10倍范围内经全身性注射到3月龄小鼠(n=6/组)内对LV功能的作用。
图38显示相较于未处理的梗塞大鼠和未处理的假手术大鼠，在梗塞后第5天给予AAV6-R1R2直接心脏注射的大鼠的缩短分数变化，如通过超声心动描记术测量的。
图39显示图38中评估的大鼠心脏的体外Neely工作心脏测量。Y轴上的能力(power)以g *cm/min的单位提供。观察到已梗塞的心脏(无处理)的前负荷反应性的丧失(心力衰竭)，和接受载体的梗塞心脏的前负荷反应性恢复至对照、未梗塞心脏的水平，从而证明心脏功能的恢复。
图40提供了本发明的示例性实施方案中使用的cTnT455心脏特异性启动子的核酸序列。
发明详述 I.引目针对心力衰竭的许多目前的药物疗法靶向细胞内[CalaCaU代谢，其可具有明显的副作用，例如心律失常发生或对舒张功能的有害作用。在一个方面，本发明提供了用于直接靶向心脏细肌丝以增强不依赖于[Ca2+] 完整心肌细胞收缩的方法。具体地，本文中显示了心脏细肌丝活化通过被设计成Ca2+结合亲和力增加(通过单个氨基酸置换(L48Q)赋予的)的心肌肌钙蛋白C(cTnC)变体的腺病毒介导过表达增强。在剥皮的心脏小梁和肌原纤维中，我们和其他人已显示L48Q cTnC对天然cTnC的置换增加了力的Ca2+敏感性和力发展最大速率。因此，在一个实施方案中，通过直接靶向心脏细肌丝提供了用于增强完整心肌细胞收缩的方法。
在一个方面，本发明提供了组合了细胞和基因疗法并且意欲改善例如心力衰竭患者的心脏性能的新型治疗法。除完整器官移植以外，心力衰竭的现有疗法目标在于通常通过细胞内钙信号转导的药理操纵减弱不利的心室复建或增强保留心肌细胞的力产生。前一种方法通常仅对于疾病进展早期的患者是有帮助的，而后一种方法受脱靶作用(例如，增加的心率失常)影响。近年来，作为实现心脏修复的替代方法的细胞移植具有相当多的兴趣，但这样的努力迄今为止受到使用的细胞的低心脏潜能和/或形成的移植心肌的相对少量限制。来自多能人胚胎干细胞(ESC)或相关的诱导多能干细胞(iPSC)的心肌细胞已在临床前研究中显示相当的前景，它们形成至少部分地与宿主肌肉整合的人心肌植入物。然而，同样地，所形成的移植物通常是相当小的，不太可能提供足够的力产生单位来显著改善心输出量。
在一个实施方案中，本发明提供了可克服许多这类缺点的心力衰竭治疗新型方法。如本文中所示，升高的2脱氧-ATP(dATP)的胞质水平增加了横桥(crossbridge)结合和循环动力学，从而导致收缩性质极大增加而无细胞内钙的扰动。可使用基因疗法通过强迫过表达核糖核苷酸还原酶(RR)(在其产生中的限速酶)来在衰竭的心肌细胞中增加dATP浓度。如本文中所显示的，局限于小面积的左心室(LV)壁的转染(通过直接病毒载体注射)导致LV功能的显著增强。
在另一个实施方案中，因为dATP容易通过缝隙连接并且仅需低浓度就可获得增强的力1%的细胞腺嘌呤苷酸库)，所以本发明提供了用于通过移植第二细胞类型而将dATP递送至衰竭的心肌的方法，所述第二细胞类型已进行了遗传修饰来过表达RR并且能够与靶宿主心肌形成缝隙连接联接。由于它们对这样的遗传修饰的顺从性，扩增的巨大容量以及形成稳定的心脏内植入物(所述植入物表达适当的连接蛋白同种型)的能力，因此来源于人ESC或iPSC的心肌细胞代表理想的dATP供体。例如，在一个实施方案中，皮肤成纤维细胞获自心力衰竭患者，被再编程为iPSC，随后通过插入其中心脏特异性启动子驱动RR表达的构建体来进行修饰。在一个实施方案中，该方法使用锌指核酸酶介导的转基因法(其允许靶向基因组中明确的“安全-港(safe-harbor)”基因座)来插入构建体。在筛选和扩增被适当靶向的iPSC克隆后，将这些细胞分化成心肌细胞，随后植入(例如，通过使用导管)衰竭的心脏。有利地，该策略不需要形成大的心脏移植物，也不需要将移植物植入梗塞疤痕的有害环境内。相反地，因为移植物的目的是递送dATP而不是产生力，因此植入良好血管化的远距离心肌中的适度移植物可能就足够了。这仅是许多潜在方法之一，并且绝不限定本发明的范围。例如，在某些实施方案中，其它供体细胞类型(例如，间充质干细胞)可用于本文中提供的方法中。类似地，在某些实施方案中，可使用其它基因转移的方法(例如，转座子、质粒或病毒递送)。
在另一个方面，本发明提供了表达巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的Rrml或Rrm2的腺病毒载体。在一个实施方案中，载体还编码作为转导报道物的绿色荧光蛋白(GFP)。利用这些载体转导培养的成年大鼠心肌细胞，在48小时的病毒温育期后，通过电视显微镜检查监控肌细胞收缩和舒张的速率和程度以及Ca2+瞬变升高和衰减(Fura2荧光)。本文中显示在
0.5Hz、IHz和2Hz刺激上，这些处理显著增加细胞[dATP]、缩短的速率和程度以及舒张的速率，对Ca2+瞬变具有最小的影响。因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过改变心脏细胞内RR和/或dATP库(这可显著改变肌动蛋白-肌球蛋白横桥循环)来增强心肌收缩力而不削弱舒张功能的方法。
在另一个方面，本发明提供了首次应用核苷酸操来改善体内收缩力。由Dr.Regnier在15年前首次研究了将dATP用作收缩底物用于研究肌丝化学-机械转导的方法。然而，将dATP用于改善心肌细胞功能能够打开许多研究新途径，包括但不限于对Ca2+操纵、代谢途径和心脏病改善的作用。还提供了具有最小侵入性并且可扩展至更大的动物模型和人的靶向递送。 对去膜骨骼肌进行关于dATP的作用的初步研究，这导致Ca2+敏感性的显著增强，但在最大Ca2+激活力上无变化。心肌的随后研究更加引人注目，其中dATP不仅增强力的Ca2+敏感性，而且还使最大Ca2+激活力的大小增加~40%。这些结果表明心脏肌肉收缩的调节对肌动球蛋白活性的改变更加易感，从而为肌丝靶向法提供了心脏特异性差异益处。这样，我们寻求上调心肌细胞的dATP产生。完整细胞的攻击和原位研究是使细胞内[dATP]增加至足以产生增加的收缩。该攻击通过过表达天然存在的酶(核糖核苷酸还原酶；R1R2)来克服，所述酶将ADP转化成dADP，所述dADP随后被磷酸肌酸激酶快速磷酸化成dATP。Schoffstall等人(2006)报导低至10%[dATP] (90%[ATP])即增加去膜心脏组织的收缩和分离的收缩蛋白23*，表明适度水平的dATP可增强完整心肌细胞的收缩。预料之外地，本文中显示心肌细胞和心脏的功能增强作用需要显著更少的dATP。
I1.实验发现
A.L48Q cTnC的表达增强心肌收缩力
通过使用电视显微镜检查监测细胞长度(CL)和Ca2+(Fura2瞬变)，L48Q cTnC的表达(通过与GFP的共表达鉴定的)相较于未转导的成年大鼠心肌细胞而言显著增加缩短的速率和程度(分别为33%和48%)而不改变Ca2+瞬变。当与WT cTnC转导的心肌细胞相比较时，这些差异甚至更明显。重要地，相较于所有其它组，舒张速率未受到L48Q cTnC的存在所影响。对来自转导心肌细胞的肌原纤维的western印迹分析确认了 L48Q cTnC的表达和在细肌丝中的掺入，所述western印迹分析显示化学计量~58%的天然cTnC被L48Q cTnC置换。
这些实验显示直接靶向心脏细肌丝蛋白以增强心肌收缩力而不改变减弱的舒张的可行性。
本研究的一个目的是确定L48Q cTnC是否可在完整心肌细胞中表达和掺入肌丝以增加收缩力而不会有害地影响心肌细胞舒张或Ca2+瞬变性质。如实施例1至6中所示，过表达L48Q cTnC导致58 土 7%的天然cTnC被L48Q cTnC置换，并且这急剧地增加了肌细胞缩短的程度和速率以及肌细胞松弛的速率，而对Ca2+瞬变性质无明显作用。我们观察到低至42%和高至70%的置换，但在这些掺入水平之间未观察到功能的显著差异。
使用剥皮的心脏小梁进行的先前实验显示，L48Q cTnC对天然cTnC的被动交换在所有Ca2+激活水平(不包括饱和[Ca2+] (pCa4.0))上增加了力发展和缩短的量级和速率，但这些研究是通过100%置换肌肉标本中的天然cTnC进行的。在使用完整心肌细胞的本研究中，我们未预计L48Q cTnC的表达会导致100%的天然cTnC的置换。然而，我们确实预计需要升高L48Q cTnC水平来实现置换~15-25%的天然cTnC以看到功能的获得，因为这是我们先前测定到在兔腰肌纤维中看到力的Ca2+敏感性显著增强所必需的TnC(M80Q sTnCF27ff)比例16O我们极大地超越该最小值的事实是预料之外的，并且是吸引人的，因为其表明获得显著增强的功能所需的病毒量可能比本研究中所应用的还少。使用不同的病毒构建体例如慢病毒或AAV6的不太强劲的基因转移或更低的感染复数似乎仍然可获得显著的功能改善。避免不利负作用例如组织炎症的可能性将是很有利的。将来的研究应当集中在产生显著的功能改善所需的L48Q cTnC的最小量，以及满足该最小量所需的病毒颗粒载量是多少。此外，已显示其它cTnC突变体改变Ca2+结合亲和力和增强力的Ca2+敏感性以及在次最大[Ca2+]下的力发展速率17，从而对于多种病理状况可能也具有治疗潜能。
L48Q cTnC作为治疗工具的潜能令人鼓舞，因为对Ca2+瞬变行为(或自动节律性)没有显著影响，考虑到其它研究已显示通过蛋白质18或药理学19’2°方法产生的肌丝Ca2+敏化作用已导致改变的动作电位行为和增加的心律失常发生风险则更是如此。鉴于WT cTnC+GFP转导的心肌细胞的最小与最大Ca2+的小差异(在IHz时明显)，这是预料之外的。该作用是归因于WT cTnC还是归因于GFP在本研究中未进行明确测试，但来自单独的研究的结果已显示成年大鼠心肌细胞的仅GFP转染显著增加了最小和最大Ca2+，特别是在更高的刺激频率下21。因此，该作用可主要归因于GFP，其部分地被cTnC的过表达所消除。在任一情况下，L48Q cTnC的表达导致与非转导的心肌细胞无差异的最小和最大[Ca2+]。因此，L48Q cTnC表达的作用可能被低估了。如果确实如此的话，那些在GFP不存在的情况下L48Q cTnC的表达将倾向于I)降低最小 [Ca2+]，从而导致增加的舒张，和2)降低最大[Ca2+]。这将通过对于给定量的Ca2+释放缩短更多来增加收缩效率的量度。有趣地，Lim等人显示过表达与特发性扩张型心肌病相关的突变体TnC(E59D，D75Y)的成年大鼠心肌细胞显著地减小收缩力，同时对细胞内Ca2+动态平衡没有影响22，表明可能操纵细肌丝Ca2+结合亲和力而不影响Ca2+瞬变行为。
使用L48Q cTnC变体的明显有利方面是，当收缩得到改善时，肌细胞舒张不受影响并且在更高的刺激频率下甚至得到增强。已显示增加的Ca2+结合亲和力可导致延长的细肌丝激活、因此延长的横桥附着，这阻碍了舒张23。延长心缩期和减缓舒张性松弛可具有严重的体内功能后果，减少舒张期充盈和随后减少心输出量。例如，我们报导了心脏肌原纤维舒张速率在L48Q cTnC的~100%交换后略微增加(相较于WT cTnC交换而言)。这归因于被认为依赖于横桥分离9的慢相的略微延长的持续时间。然而，这些研究在等同条件下进行，在本研究中完整肌细胞被允许随意缩短。在这些条件下，舒张速率也受由肌联蛋白提供的恢复力的影响，其随肌节缩短24以线性方式增加。本研究中观察到的舒张速率确实大致与细胞缩短分数相关。这也似乎表明L48Q cTnC不延长横桥附着，因为对于L48Q cTnC，舒张速率更快，如对于增加的缩短所预期的。还有可能L48Q cTnC对内源cTnC的42-70%置换对于改善的缩短(而不影响舒张)是足够的，而更大的置换可开始不利地影响舒张。此外，L48QcTnC对舒张的任何作用在完整心肌中发生的次最高[Ca2+]水平上可被减小或消除，并且在负载条件(应变)例如体内遇到的那些条件下效果也可以是不同的。
总之，这些实验显示了直接靶向心脏细肌丝蛋白增强心肌收缩力而不改变舒张功能或Ca2+瞬变行为的潜能。在一个方面，上述策略可用于治疗来自具有功能缺陷或患病心肌的心肌细胞。
B.外源RR复合物的表达增强心肌收缩力
在本文 中已显示过表达Rl和R2的腺病毒载体(AV-R1R2)的小鼠尾静脉或直接心脏注射增加[dATP]，在3-4天内显著增加(40-50%)左心室(LV)缩短分数和射血分数(图27)。有趣地，过表达R1R2的8月龄转基因小鼠的超声心动描记术显示相较于WT同胞仔而言有相似的LV功能增强作用(图27)，而无明显的心脏病状，这表明该方法的耐受性。该增强作用进一步得到初步血液动力学(Millar)和Langendorff心脏灌流实验的支持。重要地,初步NMR测量表明增强的性能不以牺牲能源储备为代价，即使对于高[Ca2+]或多巴酚丁胺攻击亦如此。最后，dATP不改变小鼠主动脉平滑肌的收缩(相较于ATP;(图30)，表明血管紧张度的改变不可能是血流动力学参数的任何潜在变化的原因。
通过电视显微镜检查监测细胞长度和参比(fura2)Ca2+荧光。在0.5Hz刺激时，缩短的程度增加~40%，并且最大缩短速率在过表达Rrml+Rrm2的心肌细胞中相较于未处理的心肌细胞增加~80%。对于Rrml+Rrm2 (+GFP)过表达，最大舒张速率也增加了~150%，从而导致达到50%舒张的时间相较于未处理的心肌细胞有减少。当与仅GFP转导的心肌细胞相比较时，这些差异甚至更显著。有趣地，Rrml+Rrm2过表达对最小或最大细胞内[Ca2+] (Fura2荧光)无影响，表明增加的收缩力主要归因于增加的肌丝活性而不改变Ca2+从肌浆网的释放。此外，当增加刺激频率(IHz和2Hz)时，Rrml+Rrm2过表达维持了功能增强作用。HPLC分析表明细胞[dATP]在转染后增加约10倍，略微大于腺嘌呤核苷酸库的1%。
这些实验证明了直接靶向肌动蛋白-肌球蛋白横桥来增强心肌收缩力和舒张而不影响最小或最大Ca2+的可行性。
本研究的一个目的是确定核糖核苷酸还原酶(Rrml+Rrm2)的过表达是否增加细胞[dATP]、继而增加完整心肌细胞的收缩力，而不会不利地影响心肌细胞舒张。Rrml+Rrm2的过表达导致细胞[dATP]增加到腺嘌呤核苷酸总库的~1.0-1.5%，这显著地增加了肌细胞缩短的程度和速率以及肌细胞舒张的速率，同时对Ca2+瞬变性质无显著影响。
使用剥皮的心脏小梁的先前实验显示dATP在所有Ca2+激活水平(包括饱和[Ca2+](pCa4.0))上增加等长收缩力以及力发展和缩短的速率，但这些研究通过在水浴溶液中利用5mM dATP对5mM ATP进行100%置换来进行对于在完整心肌细胞中进行的本研究，预期Rrml+Rrm2的过表达不导致高(mM)水平的dATP。然而，我们确实预期需要使dATP水平升高至接近~10%的[ATP]以看到功能的获得，因为这是在去膜心肌中看到功能差异所需的dATP对ATP的比例 ' 事实上，先前对鸡胚胎心肌细胞的实验表明用dATP置换~1/3的ATP可以是获得显著的收缩力增强所需的气令人惊讶地，以相对少的心肌细胞[dATP]的增加实现了观察到的收缩力的大的增加。这表明获得显著增强的功能所需的病毒的量可能少于本研究中所用的量。本研究的有利方面是过表达更少的Rrml+Rrm2可减少不利副作用的可能性可能存在一小群污染细胞(例如，成纤维细胞)，所述细胞不容易被转染或过表达更少的Rrml+Rrm2，根据HPLC其可导致心肌细胞[dATP]的低估。然而，鉴于培养物中非心肌细胞的相对罕见，该混杂影响可能极小。
不受理论束缚，有趣地推测相对少量的总dATP是如何对心肌细胞功能具有这样的显著作用。收缩效率估量(图9)表明Rrml+Rrm2转导的肌细胞的增加的收缩力主要是基于肌丝的，从而dATP可能主要通过改善横桥循环而发挥其作用。这与其中在通常表达更慢的(β)肌球蛋白的心肌细胞表达更快的(α)肌球蛋白的实验相似，导致功能增强作用而对Ca2+瞬变幅度无影响。本研究中发生的肌丝活性随[dATP]的增加而增加的背后机制是令人费解的，因为相较于ATP，浓度仍然仅为~1%。
在利用骨骼肌球蛋白的研究中，我们已显示通过肌球蛋白产生的Y -磷酸裂解平衡对于ATP和dATP是类似的，但水解后横桥结合和横桥分离的速率随dATP而增加 ' 这可解释剥皮的骨骼肌中张力发展的Ca2+敏感性的增强以及更快的张力发展速率和缩短速率虽然我们未对心肌中的dATP进行详细的化学-机械分析，但我们已显示，除了增加和去负载的缩短速率⑩外，这使最大横桥结合(如从刚度测量显示的)和等长力增加>40%。我们还显示dATP在所有Ca2+水平上显著增加心肌的等长力和kt,，无论去膜心肌主要表达α_肌球蛋白重链还是表达β_肌球蛋白重链s。这是非常重要的，因为，与骨骼肌不同，在心肌颤搐过程中细胞内[Ca2+]仅达到在大致半最大激活范围内的水平。对于利用培养的心肌细胞的本实验，有可能包含dADP.Pi的肌球蛋白SI头的少量结合增加足以协同地增加细肌丝激活，从而导致缩短的幅度和速率增加。
Rrml+Rrm2的过表达(和[dATP]的随后增加)对舒张不存在不利的作用，事实上肌细胞舒张得到增强。这可能至少部分地因Ca2+瞬变的更快速衰减而引起。dATP还可由其它ATP酶(除了肌球蛋白以外)例如肌浆Ca2+ATP酶(SERCA)、质膜Ca2+ATP酶(PMCA)和钠/钙交换剂(NCX)使用。 SERCA活性的增加可解释Ca2+瞬变衰减速率的增加(特别地在0.5和
1.0Hz刺激下)。然而，已知增加的SERCA活性增加SR Ca2+储存 ' 使更多的Ca2+在激活过程中可用于释放，这在Rrml+Rrm2转导的心肌细胞未被观察到(图6d)。此外，增加的PMCA和NCX活性应当通过将Ca2+排除出细胞而导致随时间的Ca2+瞬变衰减。因为~95%的激活Ca2+在大鼠心肌细胞中从SR释放―，所以Ca2+从细胞的排出可导致逐渐减小的Ca2+瞬变幅度和收缩，这在这些实验的过程中未被观察到。然而，对增加的Ca2+瞬变衰减背后的特定机制有必要进行将来的研究。
由于dATP增加横桥解离的速率_，这也可解释利用培养的心肌细胞的本实验中更快的舒张速率。虽然控制完整心肌的舒张的具体机制还不清楚，但已显示心脏和骨骼肌原纤维的早期舒张受横桥解离的速率控制懸。这也与心肌细胞收缩力随Rrml+Rrm2而增加的本发现一致，因为去负载细胞(如在培养物中)的缩短速率主要由横桥解离速率决定―。还有可能因dATP而引起的增加的横桥解离速率通过更快速地减少结合的横桥群体来加速协同细肌丝失活，因为细肌丝Ca2+结合在舒张过程中减少。
因此，在一个方面，本发明提供了其中dATP可提供正性收缩力和变松效应的双重益处，而Ca2+瞬变性质几乎无改变的方法，从而提供了作为当前药物疗法的替代法的可能性。
在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于下文中描述的本发明的特定实施方案，因为可对特定实施方案进行变型，并且仍然落在所附权利要求的范围内。还应理解，使用的术语是为了描述特定的实施方案，而非意在限定。相反，本发明的范围由所附权利要求确定。在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文明确地另有所指，否则单数形式"一个/ 一种(a) 〃、〃一个/ 一种(an) 〃和〃所指物(the) 〃包括复数所指物。
当提供一系列值时，应理解，除非上下文明确地另有所指，否则该范围的上限与下限之间的每一个间插值(达到下限的单位的十分位)和在所述范围内的任何其它所述值或间插值均包括在本发明中。这些更小范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也包括在本发明中，还可以作为所述范围中任何明确地排除的极限。当所述范围包括这些极限的一个或两个时，不包括这些涵盖的极限之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文中所描述的相似或等同的任何方法、装置和材料可用于本发明的实施或测试，但现在描述优选方法、装置和材料。
II1.缩写 cTnC心肌肌钙蛋白C
cTnT心肌肌钙蛋白T
koff钙解离速率
NRC新生大鼠心肌细胞
ARC成年大鼠心肌细胞
GFP绿色荧光蛋白
RT50, RT90达到50%和90%舒张的时间
DT50, DT90达到50%和90%Ca2+衰减的时间
WT 野生型
Rrml或Rl肌肉核糖核苷酸还原酶I Rrm2或Rl肌肉核糖核苷酸还原酶2
IV.定义
在本发明的说明书中，“心脏功能”是指由一个或多个可测量的参数反映的心脏的功能，例如心肌收缩力、缩短分数的变化、最大缩短速率、心肌舒张、最大心肌舒张速率、舒张时间、对Ca2+瞬变的作用、心率、收缩末期压、舒张末期压、收缩末期容积、舒张末期容积、心输出量、搏出功(stroke work)、每搏输出量、心排指数(cardiac index)等。所述参数可通过血液动力学和/或超声心动图测量和/或本领域技术人员已知的任何其它方法来测定。基于个体基础确定心脏功能的改善是否已发生。例如，对于需要正性收缩力作用的个体，心肌收缩力的改善意味着心肌收缩力的增加。或者，对于需要正性变松效应的个体，心肌舒张的改善意味着心肌舒张的增加，例如，如由舒张速率提高所反映的。
“心肌收缩力”，在本文中可与术语“收缩力”(inotropy)互换使用，意指血液从心脏射出期间心室收缩的强度。使用一个或多个可测量的收缩力参数基于个体测定心肌收缩力的改善。对于需要正性收缩力作用的个体或患者，心肌收缩力的改善需要心肌收缩力的增加，如使用超声心动描记术测量的。对于需要负性收缩力作用的个体或患者，心肌收缩力的改善需要心肌收缩力的减小。可测量的收缩力参数的实例包括0P/0t、百分比增厚、百分比缩短、缩短分数和射血分数。
“心肌舒张”，在本文中可与术语“变松效应”(lusitropy)互换使用，意指心脏在兴奋收缩偶联后舒张的能力。使用一个或多个可测量的变松效应参数基于个体测定心肌舒张的改善。由于个体或患者需要正变松效应，因此心肌舒张的改善需要舒张速率的增加。由于个体或患者需要负性变构效应，因此心肌收缩力的改善需要舒张速率的减小。可测量的变松效应参数的实例包括在心舒期期间压力下降的速率(-dP/dtmin)(如根据压力传感器测量测定的)、力/变应下降的速率(-dF/dt)(如根据力传感器测量测定的)和等容舒张时间(IVRT)(如根据心阻抗测量或根据检测的心音测量的)。例如，可对测量装置编程以将变松效应参数与指定的阈值相比较来确定舒张性松弛是否受损以及操作神经刺激回路来将交感神经刺激递送至响应其的心脏。
如本文中所用，"移植"是指将细胞置于受试者中。细胞可以是自体的(即，来自待处理的受试者)、同基因的(即，遗传上相同但不同的受试者，例如来自同卵双胞胎)、同种异体的(即，来自相同物种的非遗传上相同的成员)和/或异种的(即，来自不同种的成员)。细胞可获自供体(活的或尸体的)或来源于建立的细胞系。为了从供体(例如，生物支架移植物的潜在接受者)获得细胞，可使用本领域已知的标准生物活检技术。代表性技术描述于例如美国专利N0.6，536，567中。
术语“疗法”、“治疗”和“改善”是指症状严重度或淀粉样蛋白聚集量的任何降低或者认知功能的改善。如本文中所用，术语“治疗”和“预防”无意是绝对术语。治疗可指发作的任何延迟、症状的改善、患者存活的改善、存活时间或存活率的增加等。可将治疗的作用与未接受治疗的个体或个体集合相比较。
"心肌细胞"意指心脏收缩细胞，其是心脏肌细胞。心肌细胞可以是分离的和体外培养的或为宿主的心肌的部分。
术语"胚胎干细胞"(ES细胞)是指来源于胚泡或桑椹胚的内细胞团的细胞，其已作为细胞系进行了连续传代。ES细胞可来源于精子或DNA对卵细胞的受精、核转移、单性生殖或通过产生在MHC区域具有纯合性的hES细胞来产生。术语〃人胚胎干细胞〃 (hES细胞)是指来源于人胚泡或桑椹胚的内细胞团并已作为细胞系连续传代的细胞。hES细胞可来源于精子或DNA对卵细胞的受精、核转移、单性生殖或或通过产生在HLA区域具有纯合性的hES细胞来产生。
如本文中所用，术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”是指通过单独的或与一种或多种重编程试剂组合的重编程因子强迫表达的任意组合从出生后体细胞衍生的多能干细胞。 如本文中所用，术语“间充质干细胞”是指能够在多个间质谱系中产生分化细胞的细胞，特别地指成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和成软骨细胞。一般而言，间充质干细胞还具有下列性质的一个或多个:经历非同步性或对称复制的能力，即其中在分裂后两个子细胞可具有不同的表型；广泛的自我更新能力；和它们存在于其中的组织的克隆性再生，例如骨髓的非造血细胞。
术语〃患者〃、〃宿主〃和〃个体〃在本文中可互换使用，是指期望针对其进行诊断或治疗的任何哺乳动物受试者，例如灵长类动物物种，例如人和黑猩猩；牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。在一个优选实施方案中，所述物种是人。特别感兴趣的是具有心肌相关障碍的受试者，所述受试者适于通过将表达核糖核苷酸还原酶的两个亚基(即，R1，R2)的细胞(例如心肌细胞，成纤维细胞等)移植进入受试者的治疗(例如，以缓解与障碍相关的症状)。在许多实施方案中，宿主是人。
“供体细胞”在本发明的说明书中是指来源于哺乳动物来源(例如灵长类动物物种，例如人和黑猩猩)；牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等的细胞，所述细胞当被移植至宿主心肌时具有与宿主的心肌细胞形成或建立缝隙连接的能力。供体细胞的实例包括但不限于成纤维细胞和心肌细胞。供体细胞可以是自体的(即，来自待处理的受试者)、同基因的(即，遗传上相同但不同的受试者，例如来自同卵双胞胎)、同种异体的(即，来自相同物种的非遗传上相同的成员)和/或异种的(即，来自不同种的成员)。细胞可获自供体(活的或尸体的)或来源于建立的细胞系。为了从供体获得细胞，可使用本领域已知的标准生物活检技术。
术语〃表达载体〃或〃载体〃是指转导、转化或感染宿主生物，从而引起细胞表达并非所述细胞天然性的核酸和/或蛋白质，或以对于所述细胞不是天然的方式表达核酸和/或蛋白质。〃表达载体〃包含待由宿主生物表达的核酸(一般为RNA或DNA)的序列。任选地,表达载体还包含帮助实现核酸进入宿主生物的材料,例如病毒、脂质体、蛋白质包衣等。预期用于本发明的表达载体包括其中已插入了核酸序列连同任何优选的或需要的操纵元件的那些表达载体。此外，表达载体必须是可被转移进入宿主生物并且在其中复制的载体。优选表达载体是质粒，特别地具有已被良好地记录的限制位点和包含对于核酸序列的转录是优选或必需的操作元件的那些质粒。此类质粒以及其它表达载体对于本领域技术人员来说公知的。在一些实施方案中，表达载体是病毒载体，例如腺伴随病毒载体。
如本文中所用，术语“腺伴随病毒”包括野生型和重组腺伴随病毒，所述病毒载体是非致病性的、无包膜的DNA病毒，其包含约4.6-4.Skb的线性单链基因组，需要与辅助病毒共转染来进行病毒复制。可用于本发明的腺伴随病毒的实例包括但不限于AAV6、AAV2、rAAV2/U rAAV2/2、rAAV2/3、rAAV2/4、rAAV2/5、rAAV2/6、rAAV2/7rAAV2/8,rAAV2/9、rAAV2/10、rAAVM4U dsAAV等。腺伴随病毒及其在基因转移应用中的用途综述于:Pacak 等人(2011)Molecular Therapyl9 (9): 1582-1590 ；Hansruedi Biieler, Biol.Chem.(Junel999)380:612622 ；Robbins 等人，TIBTECH(January1998)16:3540 ;和Patjin&Kay, Semin.Liver.Dis.(1999) 19:6169 中。其它有关的参考资料包括:Burton,等人，Proc Natl Acad Sci USA (1999) 96:1272512730 ；Fan,等人，Hum.Gene Ther.(1998)9:25272535 ；Miao 等人，Nat.Genet.(Mayl998) 19:1315 ；Nakai 等人,J.Virol.(Julyl999)73:54385447 ；和 Rendahl,等人，Nat Biotechnol (1998) 16,757761 ；Gregorevic 等人(2004)Systemic delivery of genes to striated musclesusing adeno-associated viral vectors.Nature MedlO:828-834 ;Blankinship 等人(2004)Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based onadeno-associated virus serotype6.Mol TherlO:671-678 ;Blankinship 等人(2006)Gene therapy strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing recombinantadeno-associated virus vectors.Mol Therl3:241-249.和 Salva 等人(2007) Design oftissue-specific regulatory cassettes for high-level rMV—mediated expression inskeletal and cardiac muscle.Mol Therl5:320-329。
作为例证，基于AAV6的基因治疗载体可通过在两个拷贝的腺病毒相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)之间克隆DNA表达盒(例如，连接于编码治疗性蛋白质或RNA的互补DNA(cDNA)序列的调控基因表达的启动子/增强子，随后是转录终止信号例如多腺苷酸化序列；在一些情况下，cDNA和启动子通过内含子分隔)来产生。该ITR-表达盒-1TR基因组称为重组AAV(rAAV)基因组。AAV ITR序列提供了用于包裹入重组AAV颗粒内的包装信号。ITR还提供了用于产生多个拷贝的重组AAV基因组的复制起点。随后可将包含该重组基因组的DNA与包含来自野生型AAV基因组的Rep/Cap基因以及另外的腺病毒辅助功能的质粒一起共转染进入表达各种腺病毒辅助蛋白的包装细胞系(通常地HEK293细胞)。AAV不能自主复制，相反地需要第二病毒例如腺病毒的共转染来反式提供至关重要的辅助功能。AAV ITR可来源于许多不同血清型的野生型AAV。例如，通常使用的ITR来自AAV亚型2。当产生重组AAV6载体(rAAV6)时，来自AAV血清型6的Cap基因用于共转染步骤。因此，“AAV6”是具有侧翼连接表达盒的AAV2ITR并且被AAV6衣壳蛋白衣壳化的重组腺伴随病毒。
"启动子"意指足以在重组细胞中指导转录的最小序列。"启动子"也意指包括这样的元件，其足以控制细胞类型特异性、组织特异性或可通过外部信号或试剂诱导的启动子依赖性基因表达；此类元件可位于天然基因的5’或3’区域内(例如，增强子元件)。启动子的实例包括但不限于CK7启动子和CMV启动子。
在本发明的说明书中，“心脏特异性启动子”是指在心脏细胞中选择性驱动在其控制下的基因表达的野生型或重组启动子。心脏特异性启动子的实例包括本文中描述的a -MHC,5启动子、a -MHC86启动子、人心脏肌动蛋白启动子和cTnT455启动子。
〃有效连接的〃或〃可操作连接的〃意指以这样的方式连接DNA序列与调控序列，使得当适当的分子(例如，转录激活因子蛋白质)结合于调控序列时允许表达。 关于两个氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(适当时)的“百分比序列同一性〃、"百分比氨基酸序列同一性〃、〃百分比基因序列同一性〃和/或〃百分比核酸/多核苷酸序列同一性〃是指当将两个序列最佳地对齐时两个序列中相同的残基的百分比。因此，80%氨基酸序列同一性意指两个最佳对齐的多肽序列中80%的氨基酸是相同的。
〃转化"、〃转导〃或〃转染〃意指在整合新核酸(例如，对于细胞是外源的DNA或RNA)后在细胞中诱导的持久或瞬时遗传改变，优选持久的遗传改变。遗传改变可通过将新核酸整合进入宿主细胞的基因组，或通过将新DNA作为附加体元件瞬时或稳定地维持来实现。
〃转化的细胞〃、〃转染的细胞〃或〃转导的细胞〃意指已通过重组DNA技术向其中(或向其祖先中)引入编码目标蛋白质的DNA分子的细胞。
基因产物(例如Rl或R2)的"过表达"意指比处于例如特定发育期或分化期的特定细胞或细胞类型的蛋白质表达正常水平更高的蛋白质表达水平。在某些情况下，过表达可以是从内源和重组基因进行的蛋白质表达的累积效应，或基本上是从重组基因进行的蛋白质表达。Rl或R2的过表达意指特定细胞内各自核糖核苷酸还原酶蛋白质亚基的表达高于通常与特定分化期的正常或野生型细胞相关的表达水平。在某些实施方案中，基因产物的过表达意指表达增加至少约2倍，在其它实施方案中增加至少约5倍，在其它实施方案中增加至少约10倍。
〃构建体〃意指为了表达特定核苷酸序列而产生的，或将用于构建其它重组核苷酸序列的重组核酸,通常是重组DNA。
如本文中所用，〃多肽〃是指重组或非重组多肽的氨基酸序列，所述多肽具有i)天然多肽，ii)多肽的生物活性片段，iii)多肽的生物活性多肽类似物或iv)多肽的生物活性变体的氨基酸序列。可用于本发明的多肽可获自任何物种，例如哺乳动物或非哺乳动物(例如，爬行动物、两栖动物、禽类(例如，鸡))，特别地哺乳动物，包括人、啮齿类动物(例如，鼠类或大鼠)、牛、绵羊、猪、鼠或马，优选大鼠或人，来自任何来源，无论是天然的、合成的、半合成的还是重组的。例如，一种"Rl多肽〃指获自人的分离的人Rl多肽的氨基酸序列，并且意指包括所有天然存在的等位基因变体，无意将氨基酸序列限定于与引述的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。
多肽的"变体"被定义为被一个或多个氨基酸改变(例如，通过缺失、添加、插入和/或置换)的氨基酸序列。一般而言，"添加"是指添加至分子的末端的核苷酸或氨基酸残基，而"插入"是指位于天然存在的分子的残基之间的核苷酸或氨基酸残基。变体可具有“保守”变化，其中置换的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如，异亮氨酸对亮氨酸的置换。更罕见地，变体可具有〃非保守〃变化，例如，色氨酸对甘氨酸的置换。类似的小变异也可包括氨基酸缺失或插入或两者。可使用本领域公知的计算机程序，例如DNAStar软件获得确定哪些和多少氨基酸残基可被置换、添加、插入或缺失而不消除生物学或免疫学活性的指导方针。
术语"靶向试剂"是指对于特定靶器官、组织或细胞类型显示选择性的化合物。靶向试剂能够将与其有效连接的组合物导向特定靶器官或组织。靶向试剂可与至少一种阳离子性聚合载体和/或其它试剂有效结合。
如本文中所用，术语〃心肌梗塞〃意指缺血性疾病导致心肌区域被瘢痕组织替代的过程。
如本文中所用，术语"缺血性心脏病"意指因对氧的心肌需要与氧供应的充足性之间的不平衡引起的任何障碍。大多数缺血性心脏病病例由冠状动脉的狭窄引起，如在动脉粥样硬化或其它血管障碍中发生的。
如本文中所用，术语"心力衰竭"意指使得心脏在休息时或锻炼时不能维持正常血输出量，或在正常心脏充盈压力环境中不能维持正常心输出量的受损的心脏功能。左心室射血分数约40%或更少指示心力衰竭(比较来说，约55%至60%的射血分数是正常的)。具有心力衰竭的患者显示公知的临床症状和体征，例如呼吸急促、胸腔积液、在休息或锻炼时疲劳、收缩功能障碍和水肿。使用公知的方法例如体格检查、超声心动描记术、放射性核素显像、侵袭性血液动力学监控、磁共振血管造影术和与氧摄取研究偶联的运动踏板测试评估相对严重度和疾病进展。
如本文中所用，术语“心肌病”是指心血管障碍。在一些实施方案中，心肌病选自原发性心脏病状或继发性心脏病状。心肌病可选自遗传性心脏病理学、肥厚性心肌病、缺血性心肌病、限制性心肌病和扩张型心肌病。在牵涉肥厚性心肌病患者的心脏功能改善的实施方案中，心肌病可由:(a)心肌梗塞后重塑、(b)心瓣膜疾病、(C)持续心脏后负荷；(d)心肌炎；或(e)家族性肥厚性心肌病所引起。
如本文中所用，术语“心肌肌钙蛋白C”或“cTnC”是指具有多个钙结合位点的肌钙蛋白复合物的多肽。在一个优选实施方案中，cTnC是指人cTnC(Entrez Ref:NP_003271)，由TNNCl基因(Entrez Ref:NM_003280.2)或其保守变体、剪接变体或标记变体编码。
如本文中所用，术语“核糖核苷酸还原酶复合物”、“RR”或“RNR”是指包含RNRl (或“R1”)和RNR2(或“R2”)亚基的异二聚四聚化多肽复合物。在一个优选实施方案中，Rl亚基是指人核糖核苷酸还原酶Ml亚基(Entrez Ref: AAD37491.1)，由RRMl基因(Entrez Ref:AF107045.1)或其保守变 体、剪接变体或标记变体编码。R2亚基可以是指核糖核苷酸还原酶M2亚基或核糖核苷酸还原酶M2B亚基。在一个优选实施方案中，R2是指人核糖核苷酸还原酶M2亚基(Entrez Ref:AAK51163)，由RRM2基因(EntrezRef:AY032750.1)编码。在其它优选实施方案中，R2是指人核糖核苷酸还原酶M2B亚基同种型 I (Entrez Ref:NP_056528.2)，由 RRM2B 基因(Entrez Ref:NM_015713.4)编码；人核糖核苷酸还原酶M2B亚基同种型2(Entrez Ref:ΝΡ_001165948.1)，由RRM2B基因(Entrez Ref:NM_001172477)编码；或人核糖核苷酸还原酶M2B亚基同种型3 (EntrezRef:NPOO1165949)，由 RRM2B 基因(Entrez Ref:ΝΜ_001172478.1)编码；或其保守变体、剪接变体或标记变体。
V.实施方案
在一个方面，本发明提供了用于治疗心脏功能的方法，包括施用工程化cTnC变体，所述变体在临床上未被鉴定为HCM/DCM突变，但引起收缩Ca2+敏感性的类似增强或减小。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括给个体的心脏组织施用编码具有增加的位点II Ca2+结合亲和力的cTnC变体的载体。在一个具体实施方案中，cTnC变体包含L48Q氨基酸置换。
在某个实施方案中，个体具有导致收缩减少的心脏病况。在一个具体的实施方案中，个体具有梗塞的心脏。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括给个体的心脏组织施用编码具有减小的位点II Ca2+结合亲和力的CTnC变体的载体。在一个实施方案中，所述cTn C变体包含L57Q氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述cTnC变体包含I61Q氨基酸置换。
在某些实施方案中，提供了改善具有心脏病遗传素质的个体的心脏功能的方法。更具体地，该遗传素质是因肌节蛋白的一个或多个基因突变而产生，所述肌节蛋白选自β_心肌肌球蛋白重链、心脏肌动蛋白、心肌肌钙蛋白Τ、α -原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白1、心脏肌球蛋白结合蛋白C和肌球蛋白轻链。在一些实施方案中，基因突变与增强的肌纤维收缩Ca2+敏感性和/或肥厚性心肌病表型相关。这样的基因突变的实例包括但不限于cTnT的残基92 上的突变，例如 R92W、R92Q 和 R92L cTnT，或 ΜΥΗ7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3, TPMl、ACTC,MYL2、MYL3上的突变，或其组合。改善这些个体的心脏功能的方法包括给这样的个体施用包含编码L57Q或I61Q cTnC变体的核酸序列的病毒载体，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。在其它实施方案中，基因突变与减小的肌纤维收缩Ca2+敏感性和/或扩张型心肌病表型相关。这样的基因突变的实例包括但不限于错义突变Ser532Pro和Phe764Leu、cTnT 的缺失(δ Lys210)或基因 MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3, TPMl、ACTC、MYL2、MYL3 中的突变，或其组合。改善这样的个体的心脏功能的方法包括给所述具有Ca2+脱敏化基因突变的个体施用包含编码L48Q cTnC变体的核酸序列的病毒载体，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
在本文中提供的某些方法中，通过脂转染、支架上的涂覆或直接注射(即，通过导管)来施用载体。在一个实施方案中，载体包括转座子、质粒或病毒载体。在一个实施方案中，载体包括具有编码cTnC变体的核酸的腺病毒载体。在一个具体的实施方案中，编码cTnC变体的核酸还包含有效地连接于编码cTnC变体的核苷酸序列的CMV启动子。
在一个具体实施方案中，本发明的方法使用非病毒载体用以进行cTnC基因向细胞的转移，例如通过脂质体融合、磷酸钙、显微注射、电穿孔、聚阳离子、微粒轰击和受体介导的方法。在某个实施方案中，载体包含与编码cTnC变体的核酸结合的纳米颗粒。在一个具体的实施方案中，纳米颗粒包含封装编码cTnC变体的核酸的脂质体。在一些实施方案中，载体还编码对于心脏组织特异性标志物具有亲和力的靶向试剂。在一个实施方案中，靶向试剂选自抗体、抗体片段和适体(aptamer)。
在另一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括给个体的心脏组织施用编码核糖核苷酸还原酶(RR)复合物的载体。在一个实施方案中，个体具有导致收缩减小的心脏病况。在一个具体的实施方案中，个体具有梗塞的心脏。
在本文中提供的某些方法中，通过脂转染、支架上的涂覆或直接注射(即，通过导管)来施用载体。在一个实施方案中，载体包括转座子、质粒或病毒载体。
在一个具体的实施方案中，载体包括具有编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸的细胞。在一个实施方案中，细胞是心肌细胞。在一个具体的实施方案中，心肌细胞来源于多能胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞。在一个实施方案中，(iPSC)来源于从个体收获的细胞。在一个具体的实施方案中，从个体收获的细胞是皮肤成纤维细胞 。在本文中提供的方法的某些实施方案中，编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸还包含有效地连接于编码Rl和/或R2亚基的核苷酸序列的心脏特异性启动子。
在一个具体实施方案中，载体包括与编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸结合的纳米颗粒。在一个实施方案中，载体还包含编码对于心脏组织特异性标志物具有亲和力的靶向试剂的序列。在一个具体的实施方案中，靶向试剂选自抗体、抗体片段和适体。在一个更具体的实施方案中，纳米颗粒包含封装编码cTnC变体的核酸的脂质体。
在另一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括给个体的心脏组织施用:(i)编码具有增加的位点IICa2+结合亲和力的cTnC变体的载体；和(?)编码核糖核苷酸还原酶(RR)复合物的载体。
在另一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的药物组合物，其包含编码具有增加的位点II Ca2+结合亲和力的cTnC变体的载体。在一个实施方案中，cTnC变体包含L48Q氨基酸置换。
在另一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的药物组合物，其包含编码位点II Ca2+结合亲和力减小的cTnC变体的载体。在一个实施方案中，cTnC变体包含L57Q和/或I61Q氨基酸置换。
在本文中提供的药物组合物的某些实施方案中，载体包括具有编码cTnC变体的核酸的腺病毒载体。在一个具体的实施方案中，编码cTnC变体的核酸还包含有效地连接于编码cTnC变体的核苷酸序列的CMV启动子。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的药物组合物，其包含编码核糖核苷酸还原酶(RR)复合物的载体。在一个实施方案中，载体包括具有编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸的细胞。
在本文中提供的药物组合物的某些实施方案中，细胞是心肌细胞。在一个具体的实施方案中，心肌细胞来源于多能胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞。在一个更具体的实施方案中，(iPSC)来源于从个体收获的细胞，例如皮肤成纤维细胞。
在本文中提供的药物组合物的某些实施方案中，编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸还包含有效地连接于编码Rl和/或R2亚基的核苷酸序列的心脏特异性启动子。在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括给个体的心脏组织施用编码具有增加的位点II Ca2+结合亲和力的CTnC变体的载体。在一个具体实施方案中，cTnC变体包含L48Q氨基酸置换。
在 上文中提供的方法的某些实施方案中，个体具有导致收缩减小的心脏病况。在一个实施方案中，个体已被诊断为患有缺血性心脏病、心肌病或心肌梗塞。在一个实施方案中，心肌病是原发性心肌病、遗传性心肌病、扩张型心肌病或肥厚性心肌病。在一个实施方案中，个体被诊断具有减小的收缩功能。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法。更具体地，个体具有因肌节蛋白的一个或多个基因突变而导致的Ca2+敏感性或肥厚性心肌病表型，所述肌节蛋白选自心肌肌球蛋白重链、心脏肌动蛋白、心肌肌钙蛋白Τ、α-原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白1、心脏肌球蛋白结合蛋白C和肌球蛋白轻链。此类基因突变的实例包括但不限于 cTnT 的残基 92 上的突变，例如 R92W、R92Q 和 R92L cTnT,或 MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPMl、ACTC、MYL2、MYL3上的突变，或其组合。改善这样的个体的心脏功能的方法包括给所述具有Ca2+敏感性基因突变的个体施用包含编码L57Q或I61Q cTnC变体的核酸序列的病毒载体，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
在另一个方面，本发明提供改善个体的心脏功能的方法，所述个体具有与肌节蛋白的一个或多个突变相关的Ca2+脱敏性或扩张型心肌病表型，所述肌节蛋白选自β -心肌肌球蛋白重链、心脏肌动蛋白、心肌肌钙蛋白Τ、α-原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白1、心脏肌球蛋白结合蛋白C和肌球蛋白轻链。此类基因突变的实例包括但不限于错义突变Ser532Pix)和Phe764Leu、cTnT 中的缺失(δ Lys210)，或基因 MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPMl, ACTC, MYL2，MYL3的突变，或其组合。改善心脏功能的方法包括给所述具有Ca2+脱敏性基因突变的个体施用包含编码L48Q cTnC变体的核酸序列的病毒载体，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
在上文中提供的方法的某些实施方案中，通过脂转染、支架上的涂覆或直接注射(即，通过导管)来施用载体。在一个实施方案中，载体包括转座子、质粒或病毒载体。在一个具体的实施方案中，载体包括具有编码cTnC变体的核酸的腺病毒载体。在一个实施方案中，编码cTnC变体的核酸还包含有效地连接于编码cTnC变体的核苷酸序列的CMV启动子、CK7启动子、a _MHC5.5启动子、a -MHC86启动子、心脏肌动蛋白启动子、cTnT455启动子或其它心脏特异性启动子。在一个实施方案中，载体包含与编码cTnC变体的核酸结合的纳米颗粒。在一个实施方案中，载体还编码对于心脏组织特异性标志物具有亲和力的靶向试剂。在一个实施方案中，祀向试剂选自抗体、抗体片段和适体。在一个实施方案中，纳米颗粒包括封装编码所述cTnC变体的核酸的脂质体。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括给个体的心脏组织施用编码核糖核苷酸还原酶(RR)复合物的载体。
在上文中提供的方法的某些实施方案中，个体具有导致收缩减小的心脏病况。在一个实施方案中，个体具有梗塞的心脏。
在上文中提供的方法的某些实施方案中，通过脂转染、支架上的涂覆或直接注射(即，通过导管)来施用载体。在一个实施方案中，载体包括转座子、质粒或病毒载体。在一个实施方案中，载体包括具有编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸的细胞。在一个实施方案中，细胞是心肌细胞。在一个实施方案中，心肌细胞来源于多能胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能胚胎干细胞(iPSC)或间充质干细胞。在一个实施方案中，(iPSC)来源于从个体收获的细胞。在一个实施方案中，从个体收获的细胞是皮肤成纤维细胞。
在上文中提供的方法的某些实施方案中，编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸还包括有效地连接于编码Rl和/或R2亚基的核苷酸序列的心脏特异性启动子。
在上文中提供的方法的某些实施方案中，载体包括与编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸结合的纳米颗粒。在一个实施方案中，载体还编码对于心脏组织特异性标志物具有亲和力的祀向试剂。在一个实施方案中，祀向试剂选自抗体、抗体片段和适体。在一个实施方案中，纳米颗粒包括封装编码cTnC变体的核酸的脂质体。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括给个体的心脏组织施用:(i)编码具有增加的位点II Ca2+结合亲和力的cTnC变体的载体；和(ii)编码核糖核苷酸还原酶(RR)复合物的载体。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的药物组合物，其包含编码具有增加的位点II Ca2+结合亲和力的cTnC变体的载体。在一个实施方案中，所述cTnC变体包含L48Q氨基酸置换。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的药物组合物，其包含编码具有降低的位点II Ca2+结合亲和力的cTnC变体的载体。在一个实施方案中，所述cTnC变体包含L57Q和/或16IQ氨基酸置换。
在上文中提供的组合物的某些实施方案中，载体包含具有编码所述cTnC变体的核酸的腺病毒载体。在一个实 施方案中，所述编码cTnC变体的核酸还包含有效地连接于编码cTnC变体的核苷酸序列的CMV启动子。
在一个方面，本发明提供了用于改善有此需要的个体的心脏功能的药物组合物，其包含编码核糖核苷酸还原酶(RR)复合物的载体。在一个实施方案中，载体包括具有编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸的细胞。在一个实施方案中，细胞是心肌细胞。在一个实施方案中，心肌细胞来源于多能胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞。在一个实施方案中，(iPSC)来源于从个体收获的细胞。在一个实施方案中，从个体收获的细胞是皮肤成纤维细胞。在一个实施方案中，编码RR复合物的Rl和R2亚基的核酸还包含有效地连接于编码Rl和/或R2亚基的核苷酸序列的心脏特异性启动子。
V1.实施例
实施例1
成体和新生儿细胞的分离和培养。这些研究获得University of Washington(UW)动物保护委员会的批准并且按照联邦指导方针进行。在UW的比较医学系按照关于人道使用和饲养管理实验动物的美国国立卫生研究院法规照护动物。通过对细胞的酶促(胶原酶/蛋白酶)分散使用主动脉逆行灌注来从心脏分离成年大鼠(Fischer344)心肌细胞(ARC)'如先前所述n，通过酶促分散从1-3日龄新生Fischer344大鼠分离新生大鼠心肌细胞(NRC)。
实施例2
质粒设计和病毒产生。我们产生从CMV启动子表达组氨酸标记的(N末端6-His)L48QcTnC或WT cTnC的HEK293产生的腺病毒载体。两种载体都包含绿色荧光蛋白(GFP)(作为转导报告蛋白)的第二表达盒，我们还表达仅GFP的载体。将病毒以每细胞~250个颗粒引入心肌细胞。
将包含由CMV启动子驱动的适当cDNA构建体的重组腺病毒用于诱导转染的培养成体和新生大鼠心肌细胞中L48Q和WT cTnC的过表达。将绿色荧光蛋白(GFP)的第二表达盒包含在每一个腺病毒中作为成功转导的报告蛋白。用包含[L48Q cTnC+GFP]或[WT cTnC+GFP]的基因的腺病毒感染心肌细胞，进行2天。我们获得几乎100%的转染效率和基因转移，如利用显微镜检查通过绿色荧光大致显示的。这与先前使用心肌细胞的研究一致13。在该时期的细胞存活对于所有组(包括非转导的对照细胞)都是相似的，表明这些病毒载体不减弱心肌细胞活力。心肌细胞数目和肌节长度概述于表1中。在组间静息肌节长度没有差异，这表明L48Q或WT cTnC表达(+GFP)的过表达不增加钙非依赖性活化。
表1:细胞特征
【权利要求】
1.一种改善哺乳动物的心脏功能的方法，包括: 将心肌细胞移植至所述哺乳动物的心肌，其中所述心肌细胞包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一表达载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二表达载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于启动子，所述启动子诱导Rl和R2的过表达，从而产生dATP以改善哺乳动物的心脏功能。
2.权利要求1的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
3.权利要求2的方法，其中所述表达载体是腺伴随病毒载体。
4.权利要求1的方法，其中所述表达载体还包含转导报道物。
5.权利要求1的方法，其中所述心肌细胞来源于人胚胎干细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述心肌细胞来源于胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述iPSC来源于从哺乳动物收获的细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述从哺乳动物收获的细胞是成纤维细胞。
9.权利要求1的方法，其还在所述移植步骤之前包括: 提供所述第一表达载体和第二表达载体；和 用所述第一和第二表达载体离体转导所述心肌细胞。
10.权利要求1的方法，其中所述心肌是梗塞的心肌。
11.权利要求1的方法，其中所述移植包括通过导管递送心肌细胞。
12.权利要求11的方法，其中所述移植包括将心肌细胞递送至梗塞心肌的非梗塞区域。
13.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
14.权利要求1的方法，其中所述启动子是心脏特异性启动子。
15.权利要求1的方法，其中所述启动子选自CK7启动子和CMV启动子。
16.权利要求1的方法，其中所述第一和第二表达载体是相同的。
17.一种将dATP递送至哺乳动物宿主的心肌的方法，包括将供体细胞移植至心肌，其中所述供体细胞过表达核糖核苷酸还原酶亚基Rl和核糖核苷酸还原酶亚基R2，并且原位产生dATP，所述供体细胞与哺乳动物宿主的心肌细胞形成缝隙连接，从而将dATP递送至哺乳动物宿主的心肌。
18.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物宿主是人。
19.权利要求17的方法，其中所述心肌是梗塞的心肌。
20.权利要求17的方法，其中所述移植包括通过导管递送供体细胞。
21.权利要求19的方法，其中所述移植包括将心肌细胞递送至梗塞心肌的非梗塞区域。
22.权利要求17的方法，其中所述供体细胞选自心肌细胞和成纤维细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述心肌细胞来源于人胚胎干细胞。
24.权利要求22的方法，其中所述心肌细胞来源于胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述iPSC来源于从所述哺乳动物宿主收获的细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述从哺乳动物宿主收获的细胞是成纤维细胞。
27.权利要求22的方法，其中所述供体细胞包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一表达载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二表达载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于诱导Rl和R2的过表达的启动子。
28.权利要求27的方法,其中所述第一和第二表达载体是同一的载体。
29.一种改善哺乳动物的心脏功能的方法，包括施用含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一病毒载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二病毒载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
30.权利要求29的方法,其中所述第一和第二病毒载体是腺伴随病毒载体。
31.权利要求29的方法，其中所述哺乳动物是人。
32.权利要求29的方法,其中全身性施用所述第一和第二病毒载体。
33.权利要求29的方法，其中静脉内施用所述第一和第二病毒载体。
34.权利要求29的方法，其中通过心肌内注射施用所述第一和第二病毒载体。
35.权利要求29的方法,其中所述第一和第二病毒载体中至少一种还包含转导报道物。
36.权利要求29的方法,其中第一和第二病毒载体是同一载体。
37.一种改善哺乳动物的心肌收缩力和心肌舒张的方法，其包括: 将心肌细胞移植至所述哺乳动物的心肌，其中所述心肌细胞包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一表达载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二表达载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于启动子，所述启动子诱导Rl和R2的过表达，从而产生dATP以改善哺乳动物的心肌收缩力和心肌舒张。
38.权利要求37的方法,其中所述第一和第二表达载体是病毒载体。
39.权利要求38的方法,其中所述第一和第二表达载体是腺病毒载体。
40.权利要求37的方法，其中所述第一和第二表达载体中至少一个还包含转导报道物。
41.权利要求37的方法,其中所述第一和第二表达载体是同一载体。
42.权利要求37的方法，其中所述心肌细胞来源于人胚胎干细胞。
43.权利要求37的方法，其中所述心肌细胞来源于胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞。
44.权利要求43的方法，其中所述iPSC来源于从哺乳动物收获的细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述从哺乳动物收获的细胞是成纤维细胞。
46.权利要求37的方法，其还包括，在所述移植步骤之前: 提供所述第一表达载体和第二表达载体；和 用所述第一和第二表达载体离体转导所述心肌细胞。
47.权利要求37的方法，其中所述心肌是梗塞的心肌。
48.权利要求37的方法，其中所述移植包括通过导管递送心肌细胞。
49.权利要求48 的方法，其中所述移植包括将心肌细胞递送至梗塞心肌的非梗塞区域。
50.权利要求37的方法，其中所述哺乳动物是人。
51.权利要求37的方法，其中所述启动子是心脏特异性启动子。
52.权利要求37的方法，其中所述启动子选自CK7启动子和CMV启动子。
53.一种改善哺乳动物的心肌收缩力和心肌舒张的方法，包括施用含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一病毒载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二病毒载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
54.权利要求53的方法,其中所述第一和第二病毒载体是腺病毒载体。
55.权利要求53的方法，其中所述哺乳动物是人。
56.权利要求53的方法，其中全身性施用所述第一和第二病毒载体。
57.权利要求53的方法,其中静脉内施用所述第一和第二病毒载体。
58.权利要求53的方法，其中通过心肌内注射施用所述第一和第二病毒载体。
59.权利要求53的方法,其中所述第一与第二病毒载体是相同的。
60.权利要求53的方法,其中所述第一和第二病毒载体中至少一种还包含转导报道物。
61.权利要求53的方法，其中所述第一和第二病毒载体还包含编码特异性结合心脏特异性标志物的靶向试剂的序列。
62.权利要求53的方法，还包括施用包含编码具有L48Q氨基酸置换的cTnC变体的核酸序列的病毒表达载体，其中所述cTnC变体对于Ca2+具有增加的结合亲和力，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
63.一种药物组合物，其包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一病毒载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二病毒载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
64.权利要求63的药物组合物，其中所述第一和第二病毒载体是相同的。
65.一种药物组合物，其包含含有编码具有L48Q氨基酸置换的cTnC变体的核酸序列的病毒载体，其中所述cTnC变体对于Ca2+具有增加的结合亲和力。
66.一种药物组合物，其包含含有编码具有选自16IQ和L57Q的氨基酸置换的cTnC变体的核酸序列的病毒载体，其中所述cTnC变体对于Ca2+具有降低的结合亲和力。
67.权利要求65或66的药物组合物,其中所述病毒载体是腺伴随病毒载体。
68.权利要求67的药物组合物，其中所述载体还包含有效地连接于编码cTnC变体的核酸序列的CMV启动子。
69.一种包含心肌细胞的药物组合物，所述心肌细胞包含含有编码核糖核苷酸还原酶亚基Rl的第一核酸序列的第一表达载体和含有编码核糖核苷酸还原酶亚基R2的第二核酸序列的第二表达载体，所述第一核酸序列和第二核酸序列有效地连接于诱导Rl和R2过表达的启动子。
70.权利要求69的药物组合物，其中所述第一和第二表达载体是相同的。
71.一种改善有此需要的个体的心脏功能的方法，包括: 施用包含编码具有L48Q氨基酸置换的cTnC变体的核酸序列的病毒载体，其中所述cTnC变体对于Ca2+具有增加的结合亲和力，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
72.权利要求71的方法，其中所述个体具有导致收缩减小的心脏病况。
73.权利要求71的方法，其中所述个体已被诊断为患有缺血性心脏病、心肌病或心肌梗塞。
74.权利要求73的方法，其中所述心肌病选自原发性心肌病、遗传性心肌病和扩张型心肌病。
75.权利要求71的方法，其中所述个体已被诊断为收缩功能降低。
76.权利要求71的方法，其中所述个体具有过多的基因突变。
77.一种改善个体的心脏功能的方法，所述个体在选自心肌肌球蛋白重链、心脏肌动蛋白、心肌肌钙蛋白Τ、α-原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白1、心脏肌球蛋白结合蛋白C和肌球蛋白轻链的肌节蛋白中具有基因突变，所述方法包括: 施用包含编码具有氨基酸置换L57Q或I61Q的cTnC变体的核酸序列的病毒载体，其中所述cTnC变体对于Ca2+具有降低的的结合亲和力，所述核酸序列有效地连接于心脏特异性启动子。
78.权 利要求71或77的方法，其中通过脂转染、支架上的涂覆或直接注射而施用所述载体。
79.权利要求71或77的方法，其中通过导管施用所述载体。
80.权利要求71或77的方法，其中所述载体是腺伴随病毒载体。
81.权利要求77的方法，其中所述个体已被诊断为患有心肌病。
82.权利要求81的方法，其中所述心肌病是肥厚性心肌病。
83.—种表达盒，其包含与图40的核酸序列具有至少90%序列同一性的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸有效地连接于编码治疗性蛋白质的基因。
84.权利要求83的表达盒，其中所述治疗性蛋白质选自核糖核苷酸还原酶亚基和cTnC变体。
85.权利要求83的表达盒，其中所述多核苷酸具有图40的核酸序列。
86.—种包含权利要求83的表达盒的腺伴随病毒载体,其中所述病毒载体是AAV6腺伴随病毒载体。
87.一种增强治疗性蛋白质在哺乳动物中的心脏特异性表达的方法，所述方法包括施用包含权利要求83-85中任一项的表达盒的病毒载体。
88.权利要求87的方法，其中所述病毒载体是AAV6腺伴随病毒载体。
【文档编号】C12P21/04GK103946230SQ201280034527
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年5月29日 优先权日:2011年5月26日
【发明者】M·雷尼尔, M·拉弗拉梅, C·默里, F·S·科尔特, S·伦迪, S·D·豪施卡, J·S·张伯伦 申请人:华盛顿大学