用于李斯特菌的培养基和培养方法以及检测李斯特菌的方法

用于李斯特菌的培养基和培养方法以及检测李斯特菌的方法
【专利摘要】本发明公开了用于培养包括李斯特菌（Listeria?spp.）的微生物的方法的，包含非螯合镁离子和除氧剂的培养基。所述培养基可以用于培养样品以检测样品中细菌的存在。本发明还公开了包含用于补充培养基的无镁螯合缓冲液和除氧剂的配方。
【专利说明】用于李斯特菌的培养基和培养方法以及检测李斯特菌的方

法【背景技术】
[0001]1.【技术领域】
[0002]本发明公开的主题涉及用于培养微生物和检测微生物的培养基和方法。
[0003]2.相关文献
[0004]美国专利申请N0.10\597909，用于李斯特菌(LISTERIA spp.)的选择性生长培养基，申请日2005年2月12，，公开了包括氯化锂和选择试剂的成分。
[0005]Mendonca，A.，F.和 Knabel，S.，J.1994.A novel strictly anaerobic recoveryand enrichment system incorporating lithium for detection of heat-1njuredListeria monocytogenes in pasteurized milk containing background microflora.App1.Environ.Microbiol.60:4001-4008.
[0006]Beumer R.R.，te Giffel M.C.，Anthonie S.V.R.，Cox L J.1996.The effect ofacriflavine and nalidixic acid on the growth of Listeria spp.1n enrichmentmedia.F.Microbiol.13 (2): 137-148.
[0007]Teoj A., Y-L., Knabel, S., J.2000.Development of a SimpleRecovery-Enrichment System for Enhanced Detection of Heat-1njured Listeriamonocytogenes in Pasteurized Milk.J.Food Prot.63 (4):462-472.
[0008]Busch SVj DonnelIy CW.Development of a repair-enrichment brothfor resuscitation of heat-1njured Listeria monocytogenes and Listeriainnocua.1992.App1.Environ.Microbiol.58 (I): 14-20.
[0009]Buchrieser C，Rocourt J.2007.The genus Listeria and Listeriamonocytogenes:phy1genetic position,taxonomy,and identification.1mListeriaj listeriosis, and food safety, 3rd edition./Ed.by Ryser ET，MarthEH.CRC Press.896p.
[0010]Lang Halter E，Neuhaus K，Scherer S.2012.Listeria weihenstephanensissp.nov., isolated from the water plant Lemna trisulca of a German fresh waterpond.1nt J Syst Evol Microbiol.Apr27.[Epub ahead of print].
[0011]Bertsch D，Rau Jj Eugter MR, Haug MCj Lawson PA, Lacroix C，Mei Ie L 2012.Listeria fleischmannii sp.nov., isolated from cheese.1nt J Syst Evol Microbiol.Apr20.[Epub ahead of print].
[0012]Painter J，Slutsker L.Listeriosis in humans.2007.The genus Listeriaand Listeria monocytogenes:phylogenetic position,taxonomy, and identification.1mListeriaj listeriosis, and food safety, 3rd edition./Ed.by Ryser ET，MarthEH.CRC Press.896p.
[0013]Wesley IV.Listeriosis in animals.2007.The genus Listeria andListeria monocytogenes:phylogenetic position,taxonomy,and identification.ImListeriaj listeriosis, and food safety, 3rd edition./Ed.by Ryser ET，MarthEH.CRC Press.896p.[0014]Ramaswamy V，Cresence VMj Rejitha JSj Lekshmi MUj Dharsana KSj PrasadSPj Vijila HM.2007.Listeria - review of epidemiology and pathogenesis.JMicrobiol Immunol Infect.40(I):4-13.】[0015]Koch J，Stark K.Significant increase of listeriosis inGermany—epidemiological patterns2001-2005.(2006).Euro Surveill.11(6):85-8.[0016]Anonymous.1ncidence of Foodborne Illness, 2010.(http: //www.cdc.gov/Features/dsFoodbornelllness/).2009欧盟关于人畜共患疾病和人畜共患疾病药剂和食物4专染疫f青白勺趋势和来源白勺摘要?艮告(http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/2090, pdf).[0017]Scallan Ej Hoekstra RMj Angulo FJj Tauxe RVj Widdowson M-Aj Roy SLj JonesJL，Griffin PM.Foodborne illness acquired in the United States - majorpathogens.2011.Emerg Infect Dis.17 (I): 126 - 8.[0018]Gandhi M，Chikindas ML 2007.Listeria:A foodborne pathogen that knows howto survive.1nt J Food Microbiol.113(1): 1-15.[0019]USDA-FSIS.2011.1solation and Identification of Listeria monocytogenesfrom red meat, poultry, egg, and environmental samples.1n:Microbiology LaboratoryGuidebook, Chapter8.07.(http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG 8 07.pdf).
【发明内容】

[0020]在一个实施例中公开的培养基中，包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂。
[0021]在另一些的实施例中，所述除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS组成的组。
[0022]在另一些实施例中，所述培养基进一步包含具有生物有效浓度的锂盐；或铁(III)盐；或锂盐和铁(III)盐。
[0023]在另一些实施例中，所述培养基进一步包含选择剂。
[0024]在另一些实施例中，所述培养基进一步包含基本无镁的螯合缓冲液。
[0025]在另一些实施例中，所述培养基用于培养李斯特菌(Listeria spp.)。
[0026]在另一些实施例中，
[0027]所述铁(III)盐的浓度大于约0.05g/L ；
[0028]所述锂盐以大于约0.lg/L的浓度存在；
[0029]所述镁盐以大于约0.lg/L的浓度存在；并且所述除氧剂以大于约0.lg/L的浓度存在。
[0030]在一些实施例中，所述培养基进一步包含选择剂。
[0031]在一个具体实施例中公开了用于培养生物样品的方法，所述方法包含:在包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂的培养基上培养所述生物样品。
[0032]在所述方法的一些实施例中，所述培养基包含锂盐；或铁(III)盐；或锂盐和铁(III)盐。
[0033]在所述方法的另一些实施例中，所述培养基进一步包含选择剂。
[0034]在所述方法的另一些实施例中，
[0035]所述铁(III)盐以大于约0.05g/L的浓度存在；
[0036]所述锂盐以大于约0.lg/L的浓度存在；
[0037]所述镁盐以大于约0.lg/L的浓度存在；并且
[0038]所述除氧剂以大于0.lg/L的浓度存在。
[0039]在一些具体实施例中，所述方法用于培养李斯特菌(Listeria spp.)。
[0040]在一个实施例中公开了一种用于检测样品中的细菌的方法，所述方法包含培养所述样品的步骤，所述样品中存在具有生物有效浓度的:a)非螯合镁离子，和b)除氧剂。
[0041]在所述方法的一个实施例中，所述除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS组成的组。
[0042]在所述方法的一个实施例中，所述培养在下列物质存在的情况下进行:
[0043]a)锂盐；或
[0044]b)铁(III)盐；或
[0045]c)锂盐和铁(III)盐。
[0046]在所述方法的一个实施例中，所述培养在选择剂存在的情况下进行。
[0047]在所述方法的一个实施例中,所述细菌是李斯特菌(Listeria spp.)。
[0048]在一个实施例中公开了一种用于补充培养基的配方，所述配方包含无镁螯合缓冲液和除氧剂。
[0049]在另一些实施例中，所述配方还包含具有生物有效浓度的:
[0050]a)锂盐；或
[0051]b)铁(III)盐；或
[0052]c)锂盐和铁(III)盐
[0053]在另一些实施例中，公开了用所述配方培养李斯特菌的用途。
[0054]在一个具体实施例中，公开了适于稀释的用于制作液体培养基的粉末状培养基，所述培养基包含具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂。
[0055]在所述粉末培养基的另一些实施例中，稀释过的培养基进一步包含具有生物有效浓度的:
[0056]a)锂盐；或
[0057]b)铁(III)盐；或
[0058]c)锂盐和铁(III)盐。
[0059]在一个具体实施例中，公开了用于培养李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括除氧剂和无镁螯合缓冲液。
[0060]此处所述 主题的特征和益处将通过以下详细描述的优选实施例的详细描述而变得更加明显，如附图所示。公开和请求保护的主题可在各方面进行修改，只要不脱离权利要求的范围，都是可以实现的。因此，附图和说明书实质上是用于解释性的，而不是限制性的且所述主题的全部范围记录在权利要求书中。
[0061]优选实施例的详细说明[0062]术语
[0063]在本公开中，“包含”一词被用在非限制性句子中表示紧接着该词的内容被包括进来，但是没有特别提及的内容不代表被排除了。能被理解的是在包含或可能包含特定特征或变量或参数的具体实施例中，一些实施例可能由或基本上由这些特征或变量或参数组成。采用不定冠词“一种”限定的某种元素不排除多种该元素存在的可能，除非上下文明确限定一种和只有一种该兀素。
[0064]本公开中,通过端点表示的数值范围包括此范围内所有的数,包括所有完整的数，所有整数，所有的小数(例如，I到5包括1、1.5、2、2.75,3,3.80、4和5等)。
[0065]本公开中，单数形式“一个”和“所述”包括对复数的指代除非上下文内容明确限定指代其它的。因此，例如，包含“一种化合物”配方的表述包括表示两种或以上化合物的混合物。
[0066]本公开中，“或者”一词采用包括“和/或”的含义，除非上下文另有明确规定。
[0067]本公开中，除非另有指明，说明书和权利要求书中列出的用于表示数量或组成成分、特性测量值等的所有数值可在所有情况下理解为采用“大约” 一词进行修饰后的意思。因此，除非根据上下文有相反的或必要的指示，本公开中列出的数值参数为基于所需特性的可变化的近似值，本领域技术人员利用本公开的内容并根据测量和定量的不准确性可试图获得所述特性。在不限制 等同原则适用于权利要求的范围的情况下，每个数值参数应至少根据已报道的重要数值的数量以及利用普通的四舍五入方法进行分析。尽管本公开宽范围中列出的数值范围和参数为近似值，它们在具体实施例中所列的数值仅广义地理解到一定程度，该程度与使本公开的有效性以及公开和请求保护的主题与现有技术的区别是一致的。
[0068]本公开中，术语“P0D”表示差异概率，且术语“dPOD”表示差异概率方面的差异。
[0069]本公开中，“灵敏度”或“灵敏度比率”的定义为:灵敏度比率=(Actero李斯特菌法得到的阳性环境样品数/ 二代扩繁得到的阳性环境样品数)X100%。
[0070]本公开中，“特异性”或“特异性比率”的定义为:特异性比率=(Actero李斯特菌法得到的阴性环境样品数/ 二代扩繁得到的阴性环境样品数)X100%。
[0071]本公开中，“方法一致性”的定义为:方法一致性=[1 -1 (Actero李斯特菌法得到的真阳性和真阴性检测样品数-参考方法得到的真阳性和真阴性检测样品数)/总样品数
]X 100%O
[0072]本公开中，“精确性”的定义为:精确性[ActeiO李斯特菌法得到的阳性检测样品数/参考方法得到的阳性检测样品数]X 100%。
[0073]本公开中，“培养基”、“肉汤”、“培养液”等均涉及适于培养所需微生物(可能是细菌或微生物菌株或品种)的营养混合物。在特定的实施例中，培养基可能包含水、琼脂、蛋白质、氨基酸、酪蛋白水解物、盐、脂类、碳水化合物、盐、矿物质和PH缓冲液的一种或多种以及可能含有提取物例如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、蛋白胨和麦芽提取物并可能包含LB培养基。在实施例中，培养基可能是简单的、复杂的或限定的培养基并且可能是扩繁培养基并且可能以不同方式进行补充，这些方式为本领域技术人员所熟知。在实施例中，培养基可能包含MOPS缓冲液、铁(III)盐比如柠檬酸铁，镁盐比如硫酸镁，锂盐比如氯化锂并且可能包含丙酮酸盐。在实施例中，培养基可能包含或由本文所定义的任何核心培养基组成。在实施例中，培养基可能是简单的、复杂的或限定的培养基并且可能是扩繁培养基并且可能以不同方式进行补充，这些方式为本领域技术人员所熟知。“Actero/李斯特菌”和“ALEM”肉汤、培养基、扩繁培养基等被用作基于实施例的培养基的一般用词。
[0074]在实施例中，培养基含有可能是无镁螯合缓冲液的pH缓冲液。在一个系列的实施例中，所述PH缓冲液是MOPS钠盐和MOPS游离酸的混合物，但是在替代实施例中一系列其他缓冲液如碳酸盐和磷酸盐溶液也是可用的并且本领域技术人员能够轻易地选择使用并获得所需的培养基PH值。
[0075]在实施例中，培养基可能以粉末或浓缩物的形式被提供，通常也被称为“粉末培养基”、“培养基粉末”、“培养基浓缩物”、“浓缩培养基”等，它包含多种成分并适于与定量的水结合提供具有所需浓度的特定成分的液体培养基。这样的粉末培养基或浓缩培养基可能是完整的，这意味着只需在使用前将它溶于适量的水(一般是无菌水)。作为选择，在实施例中另一种情况是，粉末或浓缩培养基可能是不完整的，这意味着需要添加额外的成分来获得适于使用的完整的培养基。在实施例中，粉末或浓缩的培养基也包括浓缩的至少部分水合的培养基，它在溶解后形成用于培养细菌的培养基。除非文章另有要求，本文所用的“培养基”可以理解为不仅包括成分浓度适合培养细菌和微生物的最终培养基，还包括适于稀释的粉末或浓缩培养基。
[0076]本公开中，“除氧剂”表示能去除或失活游离氧或氧自由基的化学制品。在特定的实施例中，除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐或化合物、L_(+)_半胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸、oxyrase?酶(Patel，1995),Na2S和FeS组成的组。在特定的实施例中，除氧剂是左旋的(L)或右旋的(D)形式的并且可能是外消旋形式的或这几种的混合物。本领域技术人员能熟练选择这些 试剂并基于所讨论的实施例根据其生物兼容性对这些除氧剂进行选择。在实施例中，当除氧剂或任何其他与本公开有关的试剂为盐时，任何生物有效的和兼容的盐都是可用的并且本领域技术人员能熟练的识别和避免使用不适合的盐。在实施例中，盐为钠盐或钾盐。
[0077]在本公开中，“丙酮酸盐”表示和包括所有丙酮酸(也叫2-氧代丙酸)的所有盐类和任何包含丙酮酸盐阴离子的化合物和任何它们的生物有效异构体或替代物。在实施例中，丙酮酸盐是丙酮酸钠或丙酮酸钾。本领域技术人员能熟练的识别和避免使用不具有生物有效性或不适合的盐类，比如有毒性的盐类。
[0078]本领域技术人员可以轻而易举地意识到应当避免使用对目标细菌致命或有毒的盐和其他化合物且本领域技术人员能够很容易地识别这种盐和化合物。
[0079]在本公开中，碱金属为锂、钠、钾、铷、钙和钫中的任何一种以及碱金属盐并且碱金属盐为前述中任何一种碱金属的生物可接受的盐类。在实施例中，盐是可溶解的并且可能是有机或无机的，并且根据实施例可能是氯化物、磷酸盐、硝酸盐、磷酸氢盐、丙酮酸盐、醋酸盐。
[0080]本公开中，动词“缓冲”指以本领域技术人员显而易见的方式使溶液的pH稳定在预定范围内，所述溶液可能是培养基。名词“缓冲”表示适于稳定溶液PH的化学药品。
[0081]本公开中，“盐”指可溶的盐或在相应条件下基本或部分可溶的盐。
[0082]本公开中，关于“生长”或“培养”样品或微生物表示一个过程，即将样品或微生物放置在适宜或基本适宜维持或促进生长或分化一种或多种目标微生物的条件下的过程。这些术语可以理解为包括一种情况，其中样品被暴露于目的微生物是否真实存在或能被检测到的相关条件下。
[0083]本公开中，“盐”指任何生物相容的盐，它是可溶的或基本可溶的或在适宜培养条件下的溶解程度能达到所需生物有效性。
[0084]本公开中，“无镁螯合缓冲液”或“基本无镁螯合缓冲液”表示基本不含来自溶液的螯合的或螯合溶解的镁离子的缓冲液或者镁离子含量未达到生物显著程度的缓冲液。在特定实施例中，无镁螯合缓冲液是或包含3-(N-吗啉)丙磺酸，也指3-吗啉代丙烷-1-磺酸、3-(N-吗啉)丙磺酸、3-(N-吗啉)propansulfonic酸、4-吗啉丙磺酸和“M0PS”，或者无镁螯合缓冲液是或包含MOPS钠盐和MOPS游离酸的混合物。在替代实施例中，可以利用无镁螯合缓冲液生物可接受的范围，且本领域技术人员容易识别和选择该范围。在某些实施例中，这种缓冲液可被替代或者是MOPS的化学修饰形式。类似地，“未螯合的”或“非螯合的”表示离子或化学成分在溶液中为基本游离状态。
[0085]本公开中，“基础”或“核心”培养基或肉汤指包含某些为本领域技术人员所熟知的基本需要的成分的部分培养液，并且它的具体组成是可以变动的只要仍然适合于支持任何目标微生物的生长。因此在实施例中，核心培养基包含盐、缓冲液和蛋白提取物，并且在实施例中，核心培养基包含碳酸盐或磷酸盐或MOPS缓冲液或可能包含钠盐、镁盐和钙盐。在实施例中，I升核心培养基的配方如表1所不。然而，在替代实施例中，核心培养基包含水、琼脂、蛋白质、氨基酸、酪蛋白水解物、盐类、脂类、碳水化合物、盐、矿物质和PH缓冲液中的一种或多种，并且在实施例中核心培养基包含提取物比如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、蛋白胨和麦芽提取物，并且在实施例中，培养基是或者包含LB培养基；低盐LB培养基(1%蛋白胨，0.5%酵母提取物和0.5%NaCl )，SOB培养基(2%蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl、2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgSO4), SOC 培养基(2% 蛋白胨、0.5% 酵母提取物、IOmM NaCl,2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgS04、20mM Glucose)，超级肉汤(3.2%蛋白胨、2%酵母提取物和0.5%NaCl)，2xTY培养基(1.6%蛋白胨、1%酵母提取物和0.5%NaCl)，TB培养液(1.2%蛋白胨、2.4%酵母提取物、72mM K2HPO4,17mM KH2PO4和0.4%甘油)，LB米勒培养液或LB伦诺克斯培养液(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和l%NaCl)。
[0086]表1:基础培养基的一般成分
[0087]
【权利要求】
1.培养基，包含具有生物有效浓度的: a)非螯合镁离子；和 b)除氧剂。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS组成的组。
3.权利要求1中的培养基，进一步包含具有生物有效浓度的: a)锂盐；或 b)铁(III)盐；或 c)锂盐和铁(III)盐。
4.根据权利要求3所述的培养基，进一步包含选择剂。
5.根据权利要求1所述的培养基，进一步包含基本无镁螯合缓冲液。
6.权利要求1的所述培养基用于培养李斯特菌(Listeriaspp.)。
7.根据权利要求2所述的培养基，其中 所述铁(III)盐以大于约0.05g/L的浓度存在； 所述锂盐以大于约0.lg/L的浓度存在； 所述镁盐以大于约0.lg/L的浓度存在； 所述除氧剂以大于约0.lg/L的浓度存在。
8.根据权利要求7所述的培养基，进一步包含选择剂。
9.用于培养生物样品的方法，所述方法包括在具有生物有效浓度的非螯合镁离子和除氧剂的培养基上培养所述生物样品。
10.根据权利要求9中所述的方法，其中所述培养基包含: a)锂盐；或 b)铁(III)盐；或 c)锂盐和铁(III)盐。
11.根据权利要求9所述的方法，所述培养基进一步包含选择剂。
12.根据权利要求10所述的方法，其中 所述铁(III)盐以大于约0.05g/L的浓度存在； 所述锂盐以大于约0.lg/L的浓度存在； 所述镁盐以大于约0.lg/L的浓度存在； 所述除氧剂以大于约0.lg/L的浓度存在。
13.权利要求11所述的方法用于培养李斯特菌(Listeriaspp.)。
14.在样品中检测细菌的方法，所述方法包含在具有生物有效浓度的: a)非螯合镁离子；和 b)除氧剂存在的情况下培养所述样品的步骤。
15.根据权利要求14所述的培养基，其中所述除氧剂选自由丙酮酸盐、过氧化氢、巯基乙酸盐、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS组成的组。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述培养在以下成分存在的情况下发生: a)锂盐；或 b)铁(III)盐；或c)锂盐和铁(III)盐。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述培养在选择剂存在的情况下进行。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述细菌是李斯特菌。
19.用于补充培养基的配方，所述配方包含无镁离子螯合缓冲液和除氧剂。
20.根据权利要求18所述的配方，进一步包含具有生物有效浓度的: a)锂盐；或 b)铁(III)盐；或 c)锂盐和铁(III)盐。
21.权利要求18中的配方培养李斯特菌的用途。
22.适于稀释以获得包含具有生物有效量的非螯合镁离子和除氧剂的液体培养基的粉末培养基。
23.根据权利要求21所述的粉末培养基，其中所述稀释的培养基进一步包含具有生物有效量的: a)锂盐；或 b)铁(III)盐；或 c)锂盐和铁(III)盐 。
24.用于培养李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包含除氧剂和无镁离子螯合缓冲液。
【文档编号】C12N1/00GK103748211SQ201280034383
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年7月13日
【发明者】马汀内兹·加布里耶拉, 克拉沃·戴维, 马杜罗·莱拉 申请人:食品安全测试系统公司