由对苯二甲酸钾盐制造有用化学品的方法

由对苯二甲酸钾盐制造有用化学品的方法
【专利摘要】通过将以摩尔换算相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐作为原料，可以使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶的微生物来制造TPA-DHD。进而，可以在TPA-DHD脱氢酶作用下将TPA-DHD转变为原儿茶酸，此外在对羟基苯甲酸羟化酶作用下将原儿茶酸转变为没食子酸。此外，通过将废弃聚酯在含有氢氧化钾的乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中进行加热处理，从而可以高效地将该聚酯解聚，并制备适合于利用微生物制造化学品的对苯二甲酸钾。
【专利说明】由对苯二甲酸钾盐制造有用化学品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及以对苯二甲酸钾盐为原料、使用表达对苯二甲酸1，2-双加氧酶的微生物制造对苯二甲酸-1，2-顺式-二羟基二醇(以下根据需要简称为TPA-DHD)的方法、进一步将TPA-DHD转变成原儿茶酸、没食子酸的方法以及通过废弃聚酯的解聚获得作为原料的对苯二甲酸钾盐的方法。予以说明，本发明中对苯二甲酸钾盐是指对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸1-钾4-铵盐等对苯二甲酸的、对苯二甲酸的至少I个羧基残基与钾离子形成了盐的化合物。
【背景技术】
[0002]对苯二甲酸是主要作为聚对苯二甲酸乙二醇酯(以下简称PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(以下简称PTT)及聚对苯二甲酸丁二醇酯(以下简称PBT)等对苯二甲酸系聚酯的原料而大量生产的廉价化学品。由于对苯二甲酸廉价，因此还开发了使用微生物以对苯二甲酸为原料制造TPA-DHD、2-吡喃酮-4，6- 二甲酸、原儿茶酸、没食子酸等有用化学品的技术(文献I~5)。还已知通过TPA-DHD的脱水反应可以制造作为药品、树脂材料的原料的2-羟基对苯二甲酸(专利文献I和2)。
[0003]在以对苯二甲酸为原料使用微生物制造有用化学品时，理想的是:不是将对苯二甲酸自身、而是将水溶性优异的对苯二甲酸盐添加在培养基中。氢氧化钠由于比氢氧化钾廉价，因此一直以来虽然使用对苯二甲酸的钠盐作为其原料，但是尚不存在以对苯二甲酸的钾盐为原料使用微生物来制造有用化学品的报告、以及与对苯二甲酸的钠盐相比使用对苯二甲酸的钾盐时目标化合物的生产性更优异的报告。
[0004]关于对苯二甲酸系聚酯的再利用，特别是以废弃PET瓶的再利用为核心开发了多种再利用技术，产业化也正在推进。但是，其再利用成本高，需要收益性更高的再利用技术。从而，在以对苯二甲酸为原料的化学品制造中由于以源自废弃聚酯的对苯二甲酸为原料关系到环境问题的解决和制造成本的降低，因此是重要的研究开发课题。
[0005]作为废弃聚酯的再利用方法，除了获得原聚酯的资源再利用法外，还已知将聚酯化学解聚而获得对苯二甲酸、双-2-羟乙基对苯二甲酸酯等的化学再利用法(专利文献6~11)。已知通过在含有氢氧化钠等碱金属氢氧化物的乙二醇反应溶剂或醇反应溶剂中加热PET等聚酯可以解聚。此时，由于氢氧化钠廉价，一般使用氢氧化钠作为碱金属氢氧化物。但是，由于获得的对苯二甲酸碱金属盐的利用用途尚不存在，因此期待再利用事业推进为:进一步通过对对苯二甲酸碱金属盐进行酸处理，以此获得对苯二甲酸。但该再利用事业的制造成本偏高且获得的对苯二甲酸廉价，因此基本未实施。
[0006]虽然已知PET在含有氢氧化钾的乙二醇溶剂中可以解聚(非专利文献1)，但对于PET在乙二醇溶剂中的氢氧化钾和氢氧化钠中的解聚差异的比较结果尚无报告。进而，尚未报告在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂中通过将PET、PTT或PBT解聚而获得对苯二甲酸钾盐后，使用微生物将该对苯二甲酸钾盐转变为其它有用化学品这样的废弃聚酯的再利用技术。[0007]虽然已经报道了:在含有氢氧化钠的1- 丁醇反应溶剂中将废弃PET解聚、通过添加硫酸获得对苯二甲酸的实验例(专利文献12)，但尚未报告:在含有氢氧化钾的1-丁醇反应溶剂中将废弃PET解聚的事例，以及对于在包含碱的1-丁醇反应溶剂中的聚酯解聚反应中氢氧化钾和氢氧化钠的差异进行比较的事例。
[0008]在含有氢氧化钾的乙二醇中将废弃聚酯解聚时，若想获得纯度高的对苯二甲酸钾盐，则其再利用成本增加。因此，期待以含有乙二醇的纯度低的对苯二甲酸钾盐为原料、使用微生物将其转变为有用化学品。但是，尚不存在在对苯二甲酸盐和乙二醇共存的状态下利用微生物生产化学品的报告。予以说明，目前已知:对于在基础研究领域和工业生产领域被广泛使用的埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli ;以下适宜简称为大肠杆菌。)K_12株能够通过乳醛还原酶及乳醛脱氢酶将乙二醇转变为乙醇酸，在此基础上还报告了通过对乳醛还原酶导入突变，提高乙二醇的代谢能力(非专利文献2~4)。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献I:United States Patent5, 068, 414
[0012]专利文献2:United States Patent5, 124, 479
[0013]专利文献3:日本特开2007-104942
[0014]专利文献4:日本特开2009-65839
[0015]专利文献5:日本 特开2009-213392
[0016]专利文献6:日本专利第3715812号
[0017]专利文献7:日本特开2000-169623
[0018]专利文献8:United States Patent3, 544, 622
[0019]专利文献9:日本特开2002-60542
[0020]专利文献10:日本特开平11-21374
[0021]专利文献11:United States Patent4, 542, 239
[0022]专利文献12:W02005/082826
[0023]非专利文献
[0024]非专利文献I:Polym.-Plastics Tech.Eng., 43, 369(2004)
[0025]非专利文献2:J.Bacteriol.，153，134 (1983)
[0026]非专利文献3:J.Bacteriol.，171，6097 (1989)
[0027]非专利文献4:J.Biol.Chem.，273，8308 (1998)

【发明内容】

[0028]本发明的课题在于，提供一种在使用微生物以对苯二甲酸碱金属盐为原料生产TPA-DHD并将生产的TPA-DHD转变为原儿茶酸转变时，使这些化合物的生产性提高的方法，进一步提供一种通过废弃聚酯的解聚获得该对苯二甲酸碱金属盐的方法。
[0029]本发明人等为了解决上述课题，在将作为对苯二甲酸系聚酯的PET在碱溶液中解聚获得对苯二甲酸盐的研究过程中，对由重组大肠杆菌的原儿茶酸的生产性进行了比较，结果发现，与对苯二甲酸二钠盐相比，以对苯二甲酸钾盐(对苯二甲酸二钾盐、1-钾4-铵盐或对苯二甲酸1-钾4-钠盐)为原料时原儿茶酸的生产性更高，从而关注对苯二甲酸钾盐的利用。
[0030]当作为原料的对苯二甲酸盐的水溶性低时，通过从原料槽投入的液量增加，从而减少每一培养槽的目标化合物的生产量。因此，优选使用水溶性高的对苯二甲酸盐作为原料。在这里，研究了对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸二钾盐在水中30°C时的溶解度，结果是:对苯二甲酸二钾盐的溶解度为约1.0M、对苯二甲酸1-钾4-钠盐的溶解度为约0.96M、对苯二甲酸二钠盐的溶解度为约0.63M，发现对苯二甲酸钾盐的水溶性高。此外发现，与对苯二甲酸二钠盐相比，对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐等对苯二甲酸钾盐通过大肠杆菌等微生物生产目标化合物的生产性更优异。
[0031]进而，鉴于每摩尔氨的价格比每摩尔氢氧化钾、氢氧化钠的价格更低廉，研究了各种对苯二甲酸铵盐在水中、30°C时的溶解度，结果是:对苯二甲酸1-钾4-铵盐的溶解度为约0.85M、对苯二甲酸1-钠4-铵盐的溶解度为约0.61M、对苯二甲酸二铵盐的溶解度为约0.51M，发现对苯二甲酸1-钾4-铵盐的水溶性高。此外发现，使用对苯二甲酸1-钾4-铵盐时，通过大肠杆菌等微生物生产目标化合物的生产性更优异，直至解决了本发明的课题。
[0032]然后，对将PET、PTT及PBT分别在碱溶液中加热解聚进行了深入研究，结果发现，当在含有碱金属氢氧化物的乙二醇反应溶剂中解聚时，与氢氧化钠相比，当使用氢氧化钾作为碱金属氢氧化物时聚酯的解聚速度快且对苯二甲酸盐的回收率优异。结果发现，作为通过废弃聚酯的解聚制备对苯二甲酸盐的方法，在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂中将对苯二甲酸系聚酯解聚的方式更为优异。
[0033]进而发现，通过将解聚的反应溶剂由乙二醇变更为1- 丁醇，可以降低解聚的反应温度，且意外的是对苯二甲酸盐的回收效率也优异。进而，在1-丁醇中的解聚反应中，与氢氧化钠相比，使用氢氧化钾作为碱金属氢氧化物的方式中，意外地发现对苯二甲酸盐的解聚效率更优异。
[0034]如上所述，发现 了不仅在以对苯二甲酸的碱金属盐为原料通过微生物生产目标化合物中，而且在用于获得原料用对苯二甲酸钾盐的在乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中的聚酯解聚反应中，不使用钠而使用钾作为所用的碱金属也更为优选。
[0035]即，本发明涉及以下的(I)~(24)。
[0036](I) 一种对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，使具有以下的(a)、(b)、(c)或(d)所示的DNA、以下的(e)、(f)、(g)或(h)所示的DNA、以及以下的(i)、( j)、(k)或(I)所示的DNA且具有由对苯二甲酸生产对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的能力的微生物或该培养物的处理物，在包含对苯二甲酸盐的水性介质中与对苯二甲酸反应，生成对苯二甲酸1，2_顺式-二羟基二醇，前述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
[0037](a)编码包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
[0038](b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
[0039](c)包含序列号I所示的碱基序列的DNA。
[0040](d)与包含和序列号I所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
[0041](e)编码包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
[0042](f)包含在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
[0043](g)包含序列号3所示的碱基序列的DNA。
[0044](h)与包含和序列号3所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。 [0045](i)编码包含序列号6所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
[0046](j)包含在序列号6所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
[0047](k)包含序列号5所示的碱基序列的DNA。
[0048](I)与包含和序列号5所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
[0049](2)根据(I)所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，前述包含对苯二甲酸盐的水性介质为包含选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的I种以上对苯二甲酸钾盐的水溶液。
[0050](3)根据(I)或(2)所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，将前述对苯二甲酸盐以水溶液的形态、粉末的形态或悬浊液的形态添加在前述微生物、或该培养物的处理物中，使前述微生物或处理物与对苯二甲酸反应。
[0051](4)根据(I)~(3)中任一项所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，(I)所述的微生物为，进一步通过导入下述(m)、(η)、(ο)或(P)所示的DNA从而增强对苯二甲酸的细胞内输送能力的微生物。
[0052](m)编码包含序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
[0053](η)包含在序列号8所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA。
[0054](ο)包含序列号7所示的碱基序列的DNA。
[0055](P)与包含和序列号7所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA。
[0056](5)—种原儿茶酸的制造方法，其特征在于，通过(I)~(4)中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇、进而将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸，前述微生物为进一步具有以下的(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产原儿茶酸的能力的微生物，
[0057](q)编码包含序列号10所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
[0058](r)包含在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA。[0059](s)包含序列号9所示的碱基序列的DNA。
[0060](t)与包含和序列号9所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA。
[0061](6) 一种原儿茶酸的制造方法,其特征在于,在通过(I)~(4)中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物将对苯二甲酸1，2_顺
式-二羟基二醇转变为原儿茶酸。
[0062](7)—种没食子酸的制造方法，其特征在于，通过(I)~(4)中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇，进而，将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸，前述微生物为进一步具有上述(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA及(U)、(V)、(W)或(X)所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产没食子酸的能力的微生物。
[0063](u)编码包含序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
[0064](V)包含在序列号12所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA。
[0065](w)包含序列号11所示的碱基序列的DNA。
[0066](X)与包含序列号11所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA。
[0067](8) 一种没食子酸的制造方法，其特征在于，在通过(I)~(4)中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA以及前述的(U)、(V)、(W)或(X)所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物，将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸。
[0068](9)根据(I)~(4)中任一项所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(A)~(D)获得前述对苯二甲酸盐的工序。
[0069](A)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100~196°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
[0070]( B )从工序(A)中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
[0071]( C )从实施了工序(B )的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
[0072](D)对通过工序(C)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
[0073](10)根据(9)所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序(C)中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述(A)中的乙二醇反应溶剂使用。[0074](11)根据(5)或(6)所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序(A)~(D)获得前述对苯二甲酸盐的工序。
[0075](12)根据(11)所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(C)中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述(A)中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
[0076](13)根据(7)或(8)所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序(A)~(D)获得前述对苯二甲酸盐的工序。
[0077](14)根据(13)所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(C)中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述(A)中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
[0078](15)根据(9)或(10)所述的对苯二甲酸1，2_顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，前述(I)或(4)所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序(A)~(D)所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
[0079](16)根据(11)或(12)所述的原儿茶酸的制造方法，其中，前述(5)所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序(A)~(D)所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
[0080](17)根据(13)或(14)所述的没食子酸的制造方法，其中，前述(7)所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序(A)~(D)所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
[0081](18)根据(I)~(4)中任一项所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(E)~(H)获得前述对苯二甲酸盐的工序。
[0082](E)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1- 丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100~116°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
[0083]( F)从工序(E )中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
[0084]( G )从实施了工序(F )的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
[0085](H)对通过工序(G)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理从而减少该固态物中的1- 丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
[0086](19)根据(18)所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序(G)中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序(E)中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
[0087](20)根据(5)或(6)所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序
(E)~(H)获得前述对苯二甲酸盐的工序。[0088](21)根据(20)所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(G)中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序(E)中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
[0089](22)根据(7)或(8)所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序
(E)~(H)获得前述对苯二甲酸盐的工序。
[0090](23)根据(22)所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(G)中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序(E)中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
[0091](24)根据(I)~(23)中任一项所述的制造方法，其特征在于，前述微生物为大肠埃希氏杆菌。
[0092]根据本发明，将以摩尔换算相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐作为原料时，可以使用微生物高效地制造TPA-DHD。此外，根据本发明，可以将获得的TPA-DHD高效地变换为原儿茶酸、没食子酸。进而，通过废弃聚酯的解聚，可以高效地制备适合于利用微生物制造作为对苯二甲酸衍生物原料的对苯二甲酸钾盐。 【专利附图】

【附图说明】
[0093]图1是表示由对苯二甲酸经由TPA-DHD生产原儿茶酸及没食子酸的途径的图。
[0094]图2是表示在氢氧化钾和/或含有氢氧化钾的乙二醇溶剂中将废弃PET解聚时的对苯二甲酸生成速度的图。
[0095]图3是表示在颗粒状氢氧化钾或含有氢氧化钾水溶液的乙二醇溶剂中解聚时的对苯二甲酸生成速度的图。
【具体实施方式】
[0096]以下详细说明本发明。
[0097]就作为通过微生物制造化合物的原料而使用的对苯二甲酸的形态而言，由于与对苯二甲酸自身相比对苯二甲酸盐的水溶性更高，因此通常优选对苯二甲酸盐。作为出于这种目的而使用的对苯二甲酸盐，可以列举对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐、对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐、及对苯二甲酸二铵盐。
[0098]在这里，对苯二甲酸二钾盐是指，对苯二甲酸的I位和4位的羧基残基与钾离子形成了离子键的盐。
[0099]对苯二甲酸1-钾4-钠盐是指，对苯二甲酸的I位的羧基残基与钾离子形成了离子键且对苯二甲酸的4位的羧基残与钠离子形成了离子键的盐。
[0100]对苯二甲酸1-钾4-铵盐是指，对苯二甲酸的I位的羧基残基与钾离子形成了离子键，且对苯二甲酸的4位的羧基残基与铵离子形成了离子键的盐。
[0101]对苯二甲酸二钠盐是指，对苯二甲酸的I位和4位的羧基残与钠离子形成了离子键的盐。
[0102]对苯二甲酸1-钠4-铵盐是指，对苯二甲酸的I位的羧基残与钠离子形成了离子键，且对苯二甲酸的4位的羧基残基与铵离子形成了离子键的盐。
[0103]对苯二甲酸二铵是指，对苯二甲酸的I位和4位的羧基残基与铵离子形成了离子键的盐。
[0104]关于对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐、对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐、及对苯二甲酸二铵盐，可以通过分别将相对于对苯二甲酸粉末以摩尔比计为2倍量的氢氧化钾、以摩尔比计为I倍量的氢氧化钾和I倍量的氢氧化钠、包含以摩尔比计为I倍量的氢氧化钾和I倍量的氨的氨水溶液、以摩尔比计为2倍量的氢氧化钠、包含以摩尔比计为I倍量的氢氧化钠和I倍量的氨的氨水溶液、及包含以摩尔比计为2倍量的氨的氨水溶液加入适量的水中后，边加热边搅拌，从而获得各对苯二甲酸盐的水溶液。对苯二甲酸盐的粉末可以通过对对苯二甲酸盐的水溶液施加加热干燥处理、减压干燥处理、或结晶处理而获得。
[0105]本发明中使用的对苯二甲酸盐是指:相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐。更优选相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.6倍量以上且2倍量以下的钾的对
苯二甲酸盐。
[0106]在这里，规定为相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算成0.5倍量以上且2倍量以下的量的钾为源自对苯二甲酸钾盐的钾，即与对苯二甲酸的羧基残基形成离子键的钾的量。即，当使用粗对苯二甲酸盐时，即使其中作为杂质包含源自氢氧化钾等的钾，在计算钾量时也将其排除在外。
[0107]反应时，水性溶剂中只要含有相对于全部对苯二甲酸以摩尔换算为0.5倍量以上且2倍量以下的量的源自对苯二甲酸钾盐的钾(离子)即可。
[0108]作为对苯二甲酸盐，对苯二甲酸盐的粉末、溶解有对苯二甲酸盐的水溶液、或对苯二甲酸盐的粉末以淤浆状态混杂在该对苯二甲酸盐的水溶液中的对苯二甲酸盐悬浊液的形态均可在本发明中使用。以下，若对对苯二甲酸盐没有特别声明，则均包括任意形态的对
苯二甲酸盐。
[0109]本发明中优选使用如下的对苯二甲酸盐:包含选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的I种以上的对苯二甲酸钾盐，且相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
[0110]本发明中，也可以使用以选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸1-钾4-铵盐中的对苯二甲酸盐作为单一成分的对苯二甲酸盐。
[0111]另一方面，本发明中使用的对苯二甲酸盐只要满足上述钾含量即可，除了上述对苯二甲酸钾盐外，还可以包含对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐及对苯二甲酸二铵盐等。
[0112]例如，当使用对苯二甲酸1-钾4-钠盐和对苯二甲酸二钠盐这2种对苯二甲酸盐的混合物时，可以使用相对于对苯二甲酸二钠盐含有以摩尔比计为I倍量以上的对苯二甲酸1-钾4-钠盐的对苯二甲酸盐。
[0113]此外，当使用对苯二甲酸二钾盐和对苯二甲酸二钠盐这2种对苯二甲酸盐的混合物时，可以使用相对于对苯二甲酸二钠盐含有以摩尔比计为1/3倍量以上的对苯二甲酸二钾盐的对苯二甲酸盐。
[0114]本发明中，还可以使用3种以上的对苯二甲酸盐的混合物，此时，该混合物相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算需要含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。优选使用包含选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的I种以上的对苯二甲酸钾盐和选自对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐及对苯二甲酸二铵盐组成的组中的2种以上对苯二甲酸盐的对苯二甲酸盐。作为其具体例，可以列举将对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸二钠盐及对苯二甲酸二铵盐以摩尔比1:2:1的比例混合制备的水溶液。该水溶液相对于全部对苯二甲酸含有0.5倍量的钾，还可以通过将相对于I摩尔对苯二甲酸为0.5摩尔的氢氧化钾、1.0摩尔的氢氧化钠及0.5摩尔的氨添加在水中、溶解而获得。
[0115]本发明中，通过在含有氢氧化钾或氢氧化钾及氢氧化钠的混合物的乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中将废弃聚酯解聚而获得的包含对苯二甲酸二钾盐或对苯二甲酸1-钾4-钠盐的对苯二甲酸盐，可以作为通过微生物制造化合物的原料使用。
[0116]此时，由于与氢氧化钾相比，每I摩尔的氢氧化钠、氨水的价格更为低廉，因此相对于废弃聚酯的解聚所获得的对苯二甲酸盐加入高纯度对苯二甲酸以及氢氧化钠或氨水，利用所生成的对苯二甲酸盐的方式，在制造成本上更加低廉。作为其具体例，例如可以列举分别将废弃聚酯的解聚所获得的对苯二甲酸二钾盐、高纯度对苯二甲酸及氨水按照摩尔比6:4:8的比例混合，使用所获得的对苯二甲酸盐的水溶液。这样获得的对苯二甲酸盐的水溶液与将对苯二甲酸二钾盐和对苯二甲酸二铵盐以摩尔比6:4的比例混合制备的水溶液相同。
[0117]在使用本发明公开的方法由废弃聚酯制备对苯二甲酸钾盐时，除了钾离子、钠离子、铵离子以外，有时会混入作为异物的钙离子、锂离子等其它金属离子。此时，对于本发明中使用的对苯二甲酸盐而言，只要是相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐即可，对苯二甲酸钙盐、对苯二甲酸锂盐等对苯二甲酸盐的含有率低的话，混入也无妨。
[0118]对本发明中由对苯二甲酸制造TPA-DHD、原儿茶酸及没食子酸的工序进行说明。如图1所示，对苯二甲酸在苯二甲酸1，2-双加氧酶作用下被氧化，转变为TPA-DHD。进而，在TPA-DHD脱氢酶作用下可以将TPA-DHD转变为原儿茶酸。进而，在对羟基苯甲酸羟化酶或改良型对羟基苯甲酸羟化酶(例如，对羟基苯甲酸羟化酶的第199位的亮氨酸或第200位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第385位或第386位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体)作用下可以将原儿茶酸转变为没食子酸。
[0119]本发明中使用的对苯二甲酸1，2-双加氧酶包含加氧酶组分(oxygenasecomponent)和还原酶组分。此外,加氧酶组分包含大小2个亚基。作为加氧酶大亚基蛋白，可以列举例如具有序列号2所示的源自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testeroni)72W2株的氨基酸序列的蛋白质。该菌株于2012年I月24日以受领号NITE ABP-1209在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NPMD)(日本，邮编292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8)进行了国际保藏，可以受让。此外，作为本发明中使用的加氧酶大亚基蛋白，可以列举包含在序列号2的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号2的氨基酸序列具有75 %以上同源性、优选90 %以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。在这里，“由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能”是指:与对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白和对苯二甲酸1，2_双加氧酶还原酶蛋白质同样地在与对苯二甲酸反应时能够生成TPA-DHD的功能。
[0120]作为对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白，可以列举例如具有序列号4所示的源自上述睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白，可以列举包含在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号4的氨基酸序列具有75%以上同源性、优选90%以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。在这里，“由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能”是指:与对苯二甲酸1，2_双加氧酶加氧酶大亚基蛋白和对苯二甲酸1，2_双加氧酶还原酶蛋白质同样地在与对苯二甲酸反应时能够生成TPA-DHD的功能。
[0121]作为本发明中使用的对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质，可以列举例如具有序列号6所示的源自上述睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质，可以列举包含在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号6的氨基酸序列具有75%以上同源性、优选90%以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。在这里，“由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能”是指:与对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白和对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白同样地在与对苯二甲酸反应时能够生成TPA-DHD的功能。
[0122]作为本发明中使用的对苯二甲酸转运蛋白，可以列举例如具有序列号8所示的源自红球菌jostii (Rhodococcus jostii) RHAl株的氨基酸序列的蛋白质。此外,作为本发明中使用的对苯二甲酸转运蛋白，可以列举包含在序列号8的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有对苯二甲酸的细胞内输送能力的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号8的氨基酸序列具有75 %以上同源性、优选90 %以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有将对苯二甲酸输送至细胞内的活性的蛋白质。
[0123]作为本发明中使用的TPA-DHD脱氢酶蛋白质，可以列举例如具有序列号10所示的源自上述睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的TPA-DHD脱氢酶蛋白 质，可以列举包含在序列号10的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将TPA-DHD转变为原儿茶酸的活性的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号IO的氨基酸序列具有75 %以上同源性、优选90 %以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有将TPA-DHD转变为原儿茶酸的活性的蛋白质。
[0124]作为本发明中使用的对羟基苯甲酸羟化酶，可以列举例如绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO 株的 GenBank(以下 GenBank 简记为 GB)GB 登录号 AAG03636的蛋白质、或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440株的GB登录号AAN69138的蛋白质、或具有序列号12所示的源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium Rlutamicum)ATCC13032株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质，可以列举包含在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质。特别优选使用:GB登录号AAG03636的第199位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第385位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体，GB登录号AAN69138的第199位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第386位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体，或GB登录号BAB98470的第200位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第385位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号12的氨基酸序列具有75%以上同源性、优选90%以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质。
[0125]作为本发明中使用的乳醒还原酶，可以列举例如大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)K-12株的GB登录号AAB40449的蛋白质。此外，作为本发明中使用的乳醛还原酶蛋白质，可以列举包含在GB登录号AAB40449的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将乙二醇转变为羟乙醛(Glycoaldehyde)的活性的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与GB登录号AAB40449的氨基酸序列具有75%以上同源性、优选90%以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有将乙二醇转变为羟乙醛的活性的蛋白质。
[0126]作为本发明中使用的乳醛脱氢酶，可以列举例如大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)K-12株的GB登录号AAC74497的蛋白质。此外，作为本发明中使用的乳醛脱氢酶蛋白质，可以列举包含在GB登录号AAC74497的氨基酸序列中缺失、置换或附加I或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将羟乙醛转变为乙醇酸的活性的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与GB登录号AA C74497的氨基酸序列具有75%以上同源性、优选90%以上、特别优选95%以上同源性的氨基酸序列且具有将羟乙醛转变为乙醇酸的活性的蛋白质。
[0127]这些菌株可以由ATCC、独立行政法人制品基盘技术基盘机构生物遗传资源部门(以下简称为NBRC)、独立行政法人理化学研究筑波研究所生物资源中心、国立遗传学研究所国立生物资源课题组(以下简称为NBRP)、或The Coli Genetic Stock Center (以下根据需要有时简称为CGSC)等获得。
[0128]关于上述包含在对苯二甲酸1，2_双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1，2_双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1，2_双加氧酶还原酶蛋白质、TPA-DHD脱氢酶蛋白质、对苯二甲酸转运蛋白、乳醛还原酶蛋白质、乳醛脱氢酶蛋白质中缺失、置换或附加I个或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有各自的目标酶活性的蛋白质，可以使用 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)(以下简称为分子克隆第 2 版)、Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley&Sons (1987-1997)(以下简称为 Current Protocolsin Molecular Biology)、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)> Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA, 79，6409 (1982)、Gene, 34，315 (1985)、Nucleic Acids Res.，13，4431 (1985)、Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA, 82，488(1985)等所述的位点特异性变异导入法按照在各蛋白质中特定的位置导入缺失、置换或附加的方式在DNA中导入位点特异性变异，从而获得。缺失、置换或附加的I个或数个这样的氨基酸的个数只要能够维持各个酶活性即可，没有特别限定，理想的是为与原氨基酸序列的差异的个数以内，优选I~20个，更优选I~10个，特别优选I~5个。
[0129]作为编码本发明中使用的对苯二甲酸1，2_双加氧酶加氧酶大亚基蛋白的DNA，可以列举例如具有序列号I所不的喊基序列的DNA。
[0130]作为编码本发明中使用的对苯二甲酸1，2_双加氧酶加氧酶小亚基蛋白的DNA，可以列举例如具有序列号3所不的喊基序列的DNA。
[0131]作为本发明中使用的对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质，可以列举例如具有序列号5所示的碱基序列的DNA。
[0132]作为编码本发明中使用的对苯二甲酸转运蛋白的DNA，可以列举例如具有序列号7所不的喊基序列的DNA。
[0133]作为本发明中使用的TPA-DHD脱氢酶蛋白质，可以列举例如具有序列号9所示的喊基序列的DNA。
[0134]作为本发明中使用的对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质，可以列举例如具有序列号11所不的喊基序列的DNA。
[0135]作为本发明中使用的乳醛还原酶蛋白质，可以列举例如具有GB登录号U2958的由第13420位至第4571位的碱基序列的DNA。
[0136]作为本发明中使用的乳醛脱氢酶蛋白质，可以列举例如具有GB登录号NC_000913的由第1486256位至第1487695位的碱基序列的DNA。
[0137]本发明中使用的DNA中还包含如下DNA:将在不使各DNA编码的蛋白质失去目标酶活性的范围内导入了置换变异、缺失变异、插入变异等变异的DNA如序列号1、3、5、7、9或11表示的DNA的全部或一部分作为探针，通过杂交法在严格条件下杂交的DNA。在严格条件下杂交的DNA具体是指:使用固定有DNA的过滤器在0.7~1.0M的NaCl存在下于65°C进行杂交后，通过在浓度为0.1倍浓度~2倍浓度间的SSC溶液(I倍浓度的SSC溶液的组成为150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)中、65°C下清洗过滤器能够鉴定的DNA。予以说明，杂交实验方法记载在分子克隆:Molecular Cloning, A laboratory manual、第 2 版〔Sambrook、Fritsch、Maniatis 编著、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989 年出版〕中。
[0138]作为用于本发明、即以相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐为原料生产TPA-DHD中使用的微生物，只要是具有编码上述对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶大亚基的DNA、编码上述对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基的DNA及编码上述对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶还原酶的DNA且具有由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的微生物即可，可以使用任意微生物。SP，可以使用具有前述(I)所述的DNA且具有由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的微生物。具有这种性质的微生物也可以是使用重组技术将前述(I)所述的DNA中的I个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
[0139]此外，使用上述微生物以对苯二甲酸盐为原料生产TPA-DHD时，优选使用使该微生物具有编码对苯二甲酸转运体的DNA且对苯二甲酸的输送能力得到增强的微生物。具有这种性质的微生物也可以是使用重组技术将前述(I)所述的DNA中的I个以上DNA以及前述(4)所述的DNA中的I个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
[0140]作为原儿茶酸的生产中使用的本发明所使用的微生物，只要是在上述由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的基础上包含编码具有TPA-DHD脱氢酶活性的蛋白质的DNA且具有由TPA-DHD生产原儿茶酸的能力的微生物即可，可以使用任意微生物。即，可以使用具有前述(5)所述的DNA且具有由TPA-DHD生产原儿茶酸的能力的前述(I)或(4)所述的微生物。具有这种性质的微生物可以是使用重组技术将前述(I)所述的DNA中的I个以上DNA以及前述(5)所述的DNA中的I个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。此外，在使用上述微生物以对苯二甲 酸盐为原料生产原儿茶酸时，优选使用使该微生物具有编码对苯二甲酸转运体的DNA且对苯二甲酸的输送能力得到增强的微生物。具有这种性质的微生物可以利用使用重组技术将前述(I)及(4)所述的DNA以及前述(5)所述的DNA中的I个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
[0141]作为没食子酸的生产中使用的本发明所使用的微生物，只要是在上述由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的基础上包含编码具有TPA-DHD脱氢酶活性的蛋白质的DNA、及包含编码对羟基苯甲酸羟化酶的蛋白质的DNA且具有由TPA-DHD生产没食子酸的能力的微生物即可，可以使用任意微生物。即，可以使用在前述(5)所述的DNA的基础上具有前述(7)所述的DNA且具有由对苯二甲酸生产没食子酸的能力的微生物。具有这种性质的微生物可以是使用重组技术将前述(I)及(5)所述的DNA中的I个以上DNA以及前述(7)所述的DNA中的I个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。此外，在使用上述微生物以对苯二甲酸盐为原料生产没食子酸时，优选使用使该微生物具有编码对苯二甲酸转运体的DNA且对苯二甲酸的输送能力得到增强的微生物。具有这种性质的微生物可以是使用重组技术将前述(I)及(4)及(5)所述的DNA以及前述(7)所述的DNA中的I个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
[0142]作为分解在乙二醇溶剂中将聚酯解聚时混入到对苯二甲酸盐中的乙二醇的、本发明中使用的微生物，可以使用对上述由对苯二甲酸生产TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的微生物在乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中导入变异、和/或增加乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而增强了乙二醇分解能力的微生物。
[0143]以下详细说明DNA的克隆和转化株的构建方法。
[0144]将上述大肠埃希氏杆菌K-12株、睾丸酮丛毛单胞菌72W2株、红球菌jostiiRHAl株、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株等细菌通过上述微生物受让机构推荐的培养条件或通常使用的公知方法进行培养。培养后通过公知方法(例如Current Protocols in MolecularBiology所述的方法)分离精制该微生物的染色体DNA。可以使用合成DNA利用杂交法或PCR法等由该染色体DNA获得包含编码目标蛋白质的DNA的片段。
[0145]编码目标蛋白质的DNA也可以通过化学合成而获得。该合成DNA例如可以基于源自睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白的DNA即序列号I所示的碱基序列、及源自睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白的DNA即序列号3所示的碱基序列、及源自睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质的DNA即序列号5所示的碱基序列进行设计。[0146]作为编码对苯二甲酸转运蛋白的合成DNA，可以基于红球菌jostiiRHAl株的编码对苯二甲酸转运蛋白的DNA即序列号7所示的碱基序列进行设计。
[0147]作为编码TPA-DHD脱氢酶的合成DNA，可以基于睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码TPA-DHD脱氢酶蛋白质的DNA即序列号9所示的碱基序列进行设计。
[0148]作为编码对羟基苯甲酸羟化酶的合成DNA，可以基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的编码对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质(第385位的酪氨酸置换为苯丙氨酸的蛋白质)的DNA即序列号11所示的碱基序列进行设计。
[0149]作为编码乳醛还原酶的合成DNA，可以基于大肠埃希氏杆菌K-12株的编码乳醛还原酶蛋白质的DNA即GB登录号U2958的第13420位至第4571位的碱基序列进行设计。
[0150]作为编码乳醛脱氢酶的合成DNA，可以基于大肠埃希氏杆菌K-12株的编码乳醛脱氢酶蛋白质的DNA即GB登录号NC_000913的第1486256位至第1487695位的碱基序列进行设计。
[0151]作为将上述DNA连接的载体，只要是能够在大肠埃希氏杆菌K12株等中自主复制的载体即可，可以使用质粒载体、噬菌体载体等任意载体，具体而言，可以使用PUC19〔Gene,33,103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelixl(Roche Diagnostics K.K.制)、ZAP Express〔Stratagene 公司制、Strategies, 5，58 (1992)〕、pBluescript II SK (+)〔 Stratagene 公司制、Nucleic Acids Res.，17，9494 (1989)〕、pUC118 (宝生物公司制)等。
[0152]作为将上述获得的DNA连接至该载体而获得的重组DNA的宿主而使用的大肠埃希氏杆菌，只要是属于大肠埃希氏杆菌的微生物则可以任意使用，具体可以列举大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli) XLl-Blue MRF’ (Stratagene 公司制、Strategies, 5, 81 (1992)〕、大肠埃希氏杆菌 C600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、大肠埃希氏杆菌 Y1088〔 Science, 222`，778 (1983)〕、大肠埃希氏杆菌 Y1090〔 Science, 222，778 (1983)〕、大肠埃希氏杆菌NM522〔J.Mol.Biol.,166，I (1983)〕、大肠埃希氏杆菌K802 (J.Mol.Biol.，16，118(1966)〕、大肠埃希氏杆菌 JM105〔Gene, 38，275 (1985)〕、大肠埃希氏杆菌JM109、大肠埃希氏杆菌BL21等。
[0153]在将上述DNA导入属于红球菌(Rhodococcus)属、丛毛单胞菌(Comamonas)属、棒状杆菌属(Corynebacterium)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、Polaromonas属、雷尔氏菌(Ralstonia)属或伯克氏菌属(Burkholderia属)的微生物中时,可以使用能够在这些微生物中自主复制的载体。可以优选使用能够在该微生物的任一种和大肠埃希氏杆菌K12株两种微生物中自主复制的穿梭载体将重组DNA导入到作为宿主的该微生物中。
[0154]作为重组DNA的导入方法，只要是将DNA导入上述宿主细胞的方法则可以任意使用，例如可以列举使用钙离子的方法〔Proc.NatI.Acad.Sc1., USA, 69，2110 (1972)〕、电穿孔法〔Nucleic Acids Res.，16，6127 (1988)〕、接合转移(conjugational transfer)法(J.G.C.0ttow, Ann.Rev.Microbiol., Vol.29, p.80(1975)〕、细胞融合法(Μ.H.Gabor, J.Bacteriol.，Vol.137，p.1346 (1979)〕等。
[0155]可以从上述获得的转化体选取重组DNA，测定该重组DNA中包含的本发明中使用的DNA的碱基序列。可以使用通常使用的碱基序列解析方法、例如双脱氧法〔Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 74, 5463 (1977)〕或 3730x1 型 DNA 分析仪(applied biosystems 公司制)等碱基序列分析装置进行碱基序列的测定。[0156]此外，也可以基于上述测定的DNA碱基序列使用拍金埃尔默公司(PerSeptiveBiosystems)制8905型DNA合成装置等进行化学合成,来制备目标DNA。
[0157]关于表达上述对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1，2_双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质、对苯二甲酸转运蛋白、TPA-DHD脱氢酶蛋白质、对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质、乳醛还原酶蛋白质、和/或乳醛脱氢酶蛋白质的转化体，可以使用下述方法使宿主细胞中表达上述DNA从而获得。
[0158]使用编码上述蛋白质的DNA时，可以根据需要制备包含编码本发明中使用的蛋白质的部分的适当长度的DNA片段。此外，也可以对编码该蛋白质的部分的碱基序列进行碱基置换从而使其成为最适合在宿主中表达的密码子，来提高该蛋白质的生产率。关于表达本发明中使用的DNA的转化体，可以通过将上述DNA片段插入适当表达载体的启动子下游而制作重组DNA，将该重组DNA导入至适合该表达载体的宿主细胞，从而获得。
[0159]作为表达本发明中使用的蛋白质的宿主，只要是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等能够表达目标基因的载体即可任意使用。可以优选使用不具有TPA-DHD的代谢能力的微生物。可以更优选列举不具有TPA-DHD的代谢能力的大肠杆菌属的细菌或假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌。进而,可以优选列举大肠埃希氏杆菌K_12株或恶臭假单胞菌ΚΤ2440 株。
[0160]作为表达载体，可以使用能够在上述宿主细胞中自主复制或能够整合至染色体中、在能够转录本发明中使用的DNA的位置含有启动子的表达载体。
[0161]在使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，含有本发明中使用的DNA而成的重组DNA优选为能够在原核生物中自主复制且由启动子、核糖体结合序列、本发明中使用的DNA、转录终止序列构成的重组DNA。也可以包含控制启动子的基因。
[0162]作为用于将编码本发明中使用的蛋白质、或该蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白的DNA导入大肠埃希氏杆菌等微生物并进行表达的载体，优选所谓的多拷贝型，可以列举具有源自ColEl的复制起点的质粒，例如pUC系质粒、pBR322系质粒或其衍生物。在这里，“衍生物”是指对质粒通过碱基的置换、缺失、插入、附加和/或倒位等施加改变而得的产物。予以说明，这里所称改变也包括利用诱变剂、UV照射等进行的变异处理、或自然变异等产生的改变。更具体而言，作为载体，可以使用例如PUC19 (Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelixl (Roche Diagnostics Κ.K.制)、pKK233_2 (安玛西亚生物技术公司制)、pSE280(Invitrogen 公司制)、pGEMEX_I(Promega 公司制)、pQE_8(Qiagen 公司制)、pET_3(Novagen公司制)pBluescriptll SK(+)、pBluescript II KS(+) (Stratagene 公司制)、pSTV28 (宝生物公司制)、pUC118 (宝生物公司制)等。
[0163]作为启动子，只要是可能够在大肠埃希氏杆菌等宿主细胞中表达的即可，可以为任意启动子。可以使用例如trp启动子(Ptrp)、Iac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子等的、T7启动子等源自大肠埃希氏杆菌、噬菌体等启动子及tac启动子、lacT7启动子这类人为设计改变的启动子等、及受恶臭假单胞菌的TOL质粒的XylS蛋白质控制的Pm启动子。
[0164]优选使用将作为核糖体结合序列的SD (Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间调节为适当距离(例如5~18个碱基)的质粒。本发明中使用的重组DNA中，虽然对于本发明中使用的DNA的表达而言转录终止序列并非是必需的，但优选紧接着结构基因配置转录终止序列。[0165]可以使用重组DNA技术等构建与母株相比增强了上述任意I种以上蛋白质的生产量的微生物，来提高TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生产量。具体而言，可以列举:使用转录活性高于天然启动子的启动子作为用于使编码上述任意蛋白质的基因表达的启动子、或使用转录终止活性高于天然的终止子的终止子作为用于终止编码该蛋白质的基因的转录的终止子、或利用高拷贝数载体作为表达载体通过同源重组整合在染色体上等。
[0166]通过使用如上获得的表达对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、及对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质的微生物，可以由对苯二甲酸盐制造TPA-DHD。例如，可以在通过液体培养基培养该微生物后，将相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐以0.1mM~IM的浓度添加在该微生物的培养液中，生成、蓄积TPA-DHD,从该培养液收集TPA-DHD。在培养基中培养本发明中使用的微生物的方法可以按照微生物培养中使用的通常方法来进行。 [0167]此外，也可以在培养上述微生物后，在包含如下的对苯二甲酸盐的水性介质中添加该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物，从而生成、蓄积TPA-DHD，由该介质收集TPA-DHD，从而制造TPA-DHD，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
[0168]通过使用表达对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质、及TPA-DHD脱氢酶的微生物，可以由对苯二甲酸盐制造原儿茶酸。例如，可以在通过液体培养基培养该微生物后，将相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐以0.1mM~IM的浓度添加在该微生物的培养液中，生成、蓄积原儿茶酸，从该培养液收集原儿茶酸。在培养基中培养本发明中使用的微生物的方法可以按照微生物培养中使用的通常方法来进行。
[0169]此外，也可以在培养上述微生物后，在包含如下的对苯二甲酸盐的水性介质中添加该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物，从而生成、蓄积原儿茶酸，由该介质收集原儿茶酸，从而制造原儿茶酸，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
[0170]此外，还可以在通过前述(I)~(4)中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成TPA-DHD后，使用通过转化法导入有前述(q)、( r )、( s )或(t)所示的DNA而获得的其它微生物的培养物或该培养物的处理物将TPA-DHD转变为原儿茶酸，从该培养液或该介质收集原儿茶酸，从而制造原儿茶酸。
[0171]通过使用表达对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1，2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1，2-双加氧酶还原酶蛋白质、TPA-DHD脱氢酶、及对羟基苯甲酸羟化酶的微生物，可以由对苯二甲酸盐制造没食子酸。例如，可以在通过液体培养基培养该微生物后，将相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐以0.1mM~IM的浓度添加在该微生物的培养液中，生成、蓄积没食子酸，从该培养液收集没食子酸。在培养基中培养本发明中使用的微生物的方法可以按照微生物培养中使用的通常方法来进行。
[0172]此外，也可以在培养上述微生物后，在包含如下的对苯二甲酸盐的水性介质中添加该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物，从而生成、蓄积没食子酸，由该介质收集没食子酸，从而制造没食子酸，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
[0173]此外，还可以通过前述(I)~(4)中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成TPA-DHD后，使用通过转化法导入有前述(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA及前述(U)、(V)、(w)或(X)所示的DNA而获得的其它微生物的培养物或该培养物的处理物将TPA-DHD转变为没食子酸，从该培养液或该介质收集没食子酸，从而制造没食子酸。
[0174]关于相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐，可以使用包含对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸1-钾4-铵盐等对苯二甲酸钾盐的纯度高的对苯二甲酸盐，也可以由废弃聚酯获得。
[0175]以下说明由废弃聚酯获得作为通过微生物制造化合物的原料使用的、相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐的方法。
[0176]对于废弃聚酯的形状为容器、薄膜、片材、部件、纤维、粒状粉碎物、粉状粉碎物等任意形状的材料，均可以利用。收集以这些聚酯作为主成分(主成分是指例如含有80 %以上的PET和/或PTT和/或PBT)、包含异物成分(主成分可以列举例如聚乙烯、聚丙烯)的聚酯废弃物。根据需要去除金属、聚酯以外的塑料等异物后，利用粉碎机将聚酯废弃物粉碎。作为聚酯废弃物的粉碎物，还可以将PET瓶再利用业者加工处理后的PET瓶碎片作为起始原料。通过比重分选法、利用磁石的金属分离法、利用水的清洗法或用水去除浮游异物的方法等对如此获得的聚酯废弃物的粉碎物进行处理，从而由聚酯破碎物中分离金属、玻璃、石头、食品/饮料的残渣、聚酯以外的塑料、及聚乙烯/聚丙烯的片材等异物.夹杂物。
[0177]称量如此获得的聚酯破碎物并测定对苯二甲酸的含量(摩尔数)后，投入金属性反应釜中。进而，将氢氧化钾或氢氧化钾和氢氧化钠的混合物、以及乙二醇或1-丁醇中的任一反应溶剂加入反应釜后，仅加热适当时间，从而进行聚酯破碎物的解聚反应。当解聚反应的溶液中含有适量的水时，反应快速进行且回收到的对苯二甲酸盐的收率也提高。
[0178]添加的氢氧化钾或氢氧化钠可以在固态粒子或水溶液的任一形态下添加，优选按照相对于加入到反应釜的聚酯破碎物中的对苯二甲酸的摩尔数为约2倍量的摩尔数、优选共计2~2.2倍的摩尔数的方式添加。更优选碱的添加量相对于聚酯破碎物中的对苯二甲酸的含量共计为2.10倍的摩尔数为宜。
[0179] 添加的乙二醇或1- 丁醇的量优选以相对于该聚酯破碎物的体积为3~10倍量的方式进行添加。更优选溶剂的添加量为共计5倍量为宜。理想的是在该解聚反应的溶液中加入适量的水，该解聚反应的溶液中含有的水的总量相对于聚酯破碎物中的对苯二甲酸的摩尔数为I倍量~5倍量是理想的。
[0180]反应釜中的压力优选为大气压附近的压力、例如0.9~1.1大气压(91.193~111.458kPa)。使用乙二醇作为反应溶剂时的反应温度为水蒸发且乙二醇不会蒸发的温度。反应釜中的压力为I大气压时，优选为100~196°C。当在比I大气压低的气压下反应时，在100~196°C的范围内、水蒸发且乙二醇不会蒸发的温度下反应。此外，当在比I大气压高的气压下反应时，在100~196°C的范围内、水蒸发且乙二醇不会蒸发的温度下反应。使用1-丁醇作为反应溶剂时的反应温度为水蒸发且1-丁醇不会蒸发的温度。当反应釜中的压力为I大气压时，优选为100~116°C。当在比I大气压低的气压下反应时，在100~116°C的范围内、水蒸发且1-丁醇不会蒸发的温度下反应。此外，当在比I大气压高的气压下反应时，在100~116°C的范围内、水蒸发且1-丁醇不会蒸发的温度下反应。
[0181]加热时间优选为聚酯破碎物完全分解的时间，通常为10~240分钟，由于溶解速度是按照PET、PTT、PBT的顺序减慢，因此当对PTT和PBT解聚时，理想的是延长加热分解时间。加热反应中蒸发的水分等挥发性物质可利用冷凝器进行回收。
[0182]解聚反应结束后，除了乙二醇或1-丁醇的溶液和源自对苯二甲酸盐的固态物以外还存在浮游物形式的聚酯以外的异物塑料如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、氯乙烯时，去除该浮游物。然后，使用由过滤、离心处理等的固液分离法将对苯二甲酸盐的固态物从乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中分离。
[0183]通过上述固液分离法分离的乙二醇溶剂中溶解有大量的对苯二甲酸盐，因此优选使用该溶剂作为上述PET、PTT或PBT的解聚反应溶剂。此外，虽然对苯二甲酸盐在1-丁醇溶剂中的溶解度低，但将解聚反应中使用的1-丁醇溶剂再次作为上述PET、PTT或PBT的解聚反应溶剂使用时能够降低制造成本，因此是优选的。从而，PET、PTT或PBT的解聚反应中使用的乙二醇溶剂或1- 丁醇溶剂可以通过将所生成的对苯二甲酸盐分离而反复用于聚酯的解聚反应中。
[0184]接着，当对苯二甲酸盐的固态物中包含的杂质多时，可以利用适量的乙二醇或1- 丁醇对获得的对苯二甲酸盐的固态物实施清洗处理。特别是，在对包含PTT、PBT的聚酯废弃物进行解聚时，I, 3-丙二醇、1，4- 丁二醇会混入该固态物中，因此优选利用乙二醇或1-丁醇实施清洗处理。此外，当在1-丁醇反应溶剂中将PET树脂解聚时，虽然乙二醇混入该固态物中，但该乙二醇可以通过下述的减压干燥而被去除，但也可以通过1- 丁醇进行清洗处理去除该乙二醇。
[0185]如此获得的对苯二甲酸盐的固态物中包含大量的乙二醇或1-丁醇，因此根据需要使用减压干燥机等进行减少该固态物中的乙二醇或1-丁醇的处理、或使用离心分离机等进行液体状物质的分离。如此获得的相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐可以在TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的制造中使用。
[0186]此外，当该对苯二甲酸盐中混入有难水溶性的固态异物时，可以将该对苯二甲酸盐溶解于适量的水后，通过过滤法去除异物，将由此获得的对苯二甲酸盐的水溶液用于利用微生物进行的化合物生产中。
[0187]予以说明，为了将通过乙二醇溶剂中的废弃聚酯的解聚而获得的对苯二甲酸盐中所混入的乙二醇分解，还可以在液体培养基中培养使乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量增强的、本发明中使用的微生物后，按照在培养液中达到0.1mM~IM的浓度的方式将其添加到含有乙二醇且相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐中，从而边分解乙二醇边生成TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸。
[0188]还可以在培养本发明中使用的微生物后，将该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物添加到包含如下对苯二甲酸盐的水性介质中，从而生成、蓄积TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，从该介质收集TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
[0189]本发明中使用的微生物的培养可以在包含碳源、氮源、无机盐、各种维生素等的通常的营养培养基中进行，作为碳源，可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类，乙醇、甲醇等醇类，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等有机酸类，废糖蜜等。作为氮源，可以将例如氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素等各自单独使用或混合使用。此外，作为无机盐，可以使用例如磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁等。其它的还可以在培养基中添加蛋白胨、肉浸出物、酵母浸出物、玉米浆、酪蛋白氨基酸(casamino acids)、生物素等各种维生素等营养素。作为用于生产TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的原料，添加如上制备的、相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐。
[0190]培养通常在通气搅拌、振荡等好氧条件下进行。培养温度只要是本发明中使用的微生物能够生育的温度即可，没有特别限定，此外，对于培养过程中的PH，只要是本发明中使用的微生物能够生育的PH即可，没有特别限定。培养中的PH调节可以通过添加酸或碱来进行。
[0191]作为该培养菌体的处理物，可以使用将本发明中使用的微生物固定化在载体上的处理物。此时，可以以由培养物回收的状态使用、或者可以使用用适当缓冲液、例如0.02~0.2M左右的磷酸缓冲液(pH6~10)等清洗后的菌体。此外，在本发明的TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的制造中，还可以使用:将由培养物回收的菌体用超声波、挤压等手段破碎而得的破碎物，用水等对该破碎物进行提取而获得的含有本发明中使用的蛋白质的提取物，将对该提取物进一步进行硫酸铵盐析、柱色谱等处理而获得的本发明中使用的蛋白质的部分精制成分等固定化在载体上的产物。
[0192]关于这些菌体、菌体破碎物、提取物或精制酶的固定化，可以按照方法本身已经公知的常用的方法，通过将菌体等固定化在丙烯酰胺单体、藻酸、或角叉菜胶等适当的载体上的方法而进行。
[0193]反应中使用的水性介质可以是含有对苯二甲酸盐的水溶液或适当的缓冲液，例如
0.02~0.2M左右的磷酸缓冲液(pH6~10)。在需要提高菌体的细胞膜的物质透过性时，可以向该水性介质中添加0.05~2.0% (w/v)的甲苯、二甲苯、非离子性表面活性剂等。
[0194]水性介质中的作为反应原料的对苯二甲酸盐的浓度为0.1mM~IM左右是适当的。上述水性介质中的酶反应温度及pH没有特别限定，通常为10~60°C、优选15~50°C是适当的，反应液中的PH可以设为5~10、优选6~9左右。此外，pH的调节可以通过添加酸或碱来进行。
[0195]关于发明中使用的酶，可以直接为菌体提取液，或者由菌体提取液通过离心分离、过滤等收集后将其悬浊于水或缓冲液中而获得。如此获得的酶在对苯二甲酸盐的存在下可以反应，但在不抑制酶活性的范围内尽量提高反应液中的对苯二甲酸盐的浓度更为有利。反应可以通过静置、搅拌、振荡中的任意方法进行。此外，还可以利用将酶固定化在适当的支持体上后填充在柱中、使包含对苯二甲酸盐的溶液流过的方法。反应通常在10~60°C、优选15~50°C、pH5~9、优选pH6~9下进行。
[0196]此外，如果在反应时向上述水性介质中添加抗氧化剂或还原剂，有时TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成收率会进一步提高。作为抗氧化剂/还原剂，可以列举抗坏血酸、异抗坏血酸、半胱氨酸、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠等亚硫酸盐、硫代硫酸钠等硫代硫酸盐。添加浓度根据抗氧化剂/还原剂的种类而不同，理想的是以不阻碍TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成的浓度进行添加，通常为0.001~5% (w/v)，优选0.005~1%。
[0197]此外，如果在反应时向上述水性介质中添加氧化剂，有时TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成收率会进一步提高。作为氧化剂，可以列举亚硝酸钠、亚硝酸钾等硝酸盐、氯化铁和硫酸铁等金属盐、卤素、过氧酸等，优选亚硝酸钠、氯化铁、硫酸铁。添加浓度根据氧化剂的种类而不同，理想的是以不阻碍TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成的浓度进行添加，通常为 0.001 ~0.05% (w/v)，优选 0.005 ~0.02%。
[0198]关于结束培养后的培养液或反应液中的TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，可以根据需要通过离心分离等从该培养液去除菌体等不溶成分后，通过单独使用或组合使用例如利用乙酸乙酯等有机溶剂的提取法、使用活性炭的方法、使用离子交换树脂的方法、晶析法、盐析等沉淀法、蒸馏法等方法收集TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸。对于TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，当需要在酸的状态下而非盐的状态下获得化合物时，可以在上述精制工序中通过硫酸、盐酸等的添加来降低pH使形成了盐的羧酸变成游离酸的状态。
[0199]以下通过实施例具体说明本发明的方法，但本发明不受其限定。
[0200]实施例1.各种对苯二甲酸盐的溶解度的测定
[0201]将对苯二甲酸(粉末状，Sigma-Aldrich Japan制；以下没有特别声明时，试剂均使用 Sigma-Aldrich Japan 制品。)2.99g (0.018mol)和氢氧化钾(颗粒状)0.036mol 投入到50mL玻璃烧杯中，用蒸馏水调整为约15mL。用铝箔盖住，边用加热搅拌器(AS ONECorporation制)搅拌，边在50°C下加热60分钟后，放冷，冷却至30°C。在30°C搅拌120分钟以上，确认溶液中残存有沉淀后，收集溶液lmL，使用微量高速离心机(Τ0ΜΥ SEIKOC0., LTD.制)离心〔30°C、14000rpm (17800g)、30 秒钟〕，从而回收上清。
`[0202]测定该上清的对苯二甲酸的浓度，作为对苯二甲酸二钾盐的溶解度。关于对苯二甲酸的浓度的测定，用2.5%乙腈水溶液将样品稀释至16000倍，使用高速液相色谱(Water公司，LCT Premier XE)按照表1的分离条件分析后,基于与作为对照的已知浓度的对苯二甲酸水溶液的对苯二甲酸峰的面积之比而算出。
[0203][表1] LCT Premier XE 的 HPLC 分析条件
[0204]
【权利要求】
1.一种对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，使具有以下的(a)、(b)、(c)或(d)所示的DNA、以下的(e)、(f)、(g)或(h)所示的DNA、以及以下的(i)、(j)、(k)或(I)所示的DNA且具有由对苯二甲酸生产对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的能力的微生物或该培养物的处理物，在包含对苯二甲酸盐的水性介质中与对苯二甲酸反应，生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇，前述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾， (a)编码包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA； (b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA ； (c)包含序列号I所不的喊基序列的DNA； Cd)与包含和序列号I所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA ； Ce)编码包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA ； (f)包含在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA ； (g)包含序列号3所不的喊 基序列的DNA； (h)与包含和序列号3所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA ； (i)编码包含序列号6所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA； (j)包含在序列号6所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA ； (k)包含序列号5所不的喊基序列的DNA ； (I)与包含和序列号5所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
2.根据权利要求1所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，前述包含对苯二甲酸盐的水性介质为包含选自由对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的I种以上对苯二甲酸钾盐的水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，前述对苯二甲酸盐以水溶液的形态、粉末的形态或悬浊液的形态添加在前述微生物、或该培养物的处理物中，使前述微生物或处理物与对苯二甲酸反应。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，权利要求1所述的微生物为进一步通过导入下述(m)、(n)、(o)或(P)所示的DNA从而增强对苯二甲酸的细胞内输送能力的微生物，(m)编码包含序列号8所不的氣基酸序列的蛋白质的DNA ； (η)包含在序列号8所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA ； (ο)包含序列号7所不的喊基序列的DNA ； (P)与包含和序列号7所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA。
5.一种原儿茶酸的制造方法，其特征在于，通过权利要求1~4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇、进而将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸，前述微生物为进一步具有以下的(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产原儿茶酸的能力的微生物， (q)编码包含序列号10所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA ； Cr)包含在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA ； (s)包含序列号9所示的碱基序列的DNA ； (t)与包含和序列号9所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA。
6.一种原儿茶酸的制造方法，其特征在于，在通过权利要求1~4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物将对苯二甲酸1，2_顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸。
7.一种没食子酸的制造方法，其特征在于，通过权利要求1~4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇，进而，将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸，前述微生物为进一步具有上述(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA及(U)、(V)、(W)或(X)所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产没食子酸的能力的微生物， (q)编码包含序列号10所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA ； Cr)包含在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA ； (s)包含序列号9所示的碱基序列的DNA ； (t)与包含和序列号9所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA ； (U)编码包含序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA ； (V)包含在序列号12所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加I个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA ； (w)包含序列号11所不的喊基序列的DNA ； (X)与包含序列号11所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA。
8.一种没食子酸的制造方法，其特征在于，在通过权利要求1~4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述(q)、(r)、(s)或(t)所示的DNA以及前述的(U)、(V)、(W)或(X)所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物，将对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸。
9.根据权利要求1~4中任一项所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(A)~(D)获得前述对苯二甲酸盐的工序， (A)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100~196°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、 (B )从工序(A )中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、 (C)从实施了工序(B)的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、 (D)对通过工序(C)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
10.根据权利要求9所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序(C)中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述(A)中的乙二醇反应溶剂使用。
11.根据权利要求5或6所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(A)~(D)获得前述对苯二甲酸盐的工序， (A)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100~196°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、 (B )从工序(A )中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、 (C)从实施了工序(B)的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、 (D)对通过工序(C)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
12.根据权利要求11所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(C)中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述(A)中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
13.根据权利要求7或8所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(A)~(D)获得前述对苯二甲酸盐的工序，(A)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100~196°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、 (B )从工序(A )中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、 (C)从实施了工序(B)的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、 (D)对通过工序(C)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
14.根据权利要求13所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(C)中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述(A)中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
15.根据权利要求9或10所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，前述权利要求1或4所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序(A)~(D)所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
16.根据权利要求11或12所述的原儿茶酸的制造方法，其中，前述权利要求5所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序(A)~(D)所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
17.根据权利要求13或14所述的没食子酸的制造方法，其中，前述权利要求7所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序(A)~(D)所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
18.根据权利要求1~4中任一项所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(E)~(H)获得前述对苯二甲酸盐的工序， (E)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1- 丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100~116°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、 (F )从工序(E )中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、 (G)从实施了工序(F)的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、 (H)对通过工序(G)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的1-丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
19.根据权利要求18所述的对苯二甲酸1，2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序(G)中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序(E)中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
20.根据权利要求5或6所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(E)~(H)获得前述对苯二甲酸盐的工序， (E)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1- 丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100~116°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、 (F )从工序(E )中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、 (G)从实施了工序(F)的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、 (H)对通过工序(G)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的1-丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
21.根据权利要求20所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(G)中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序(E)中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
22.根据权利要求7或8所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序(E)~(H)获得前述对苯二甲酸盐的工序， (E)通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1- 丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100~116°C之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、 (F )从工序(E )中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、 (G)从实施了工序(F)的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、 (H)对通过工序(G)回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的1-丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
23.根据权利要求22所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序(G)中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序(E)中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
24.根据权利要求1~23中任一项所述的制造方法，其特征在于，前述微生物为大肠埃希氏杆菌。
【文档编号】C12R1/19GK103703137SQ201280034139
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年1月27日 优先权日:2012年1月27日
【发明者】贯井宪之, 小牧真树, 西泽明人, 西达也 申请人:株式会社吉那里斯