基于Biolog技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法
【专利摘要】基于Biolog技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，涉及一种降解功能菌群的筛选方法，包括选取含有PAEs降解功能菌群的环境介质作为菌源；将上述菌源制成菌悬液，接种于驯化培养基中进行培养；Biolog生态板接种和培养，确定能够被菌群利用的优势碳源；按C:N=25:1分别配制含不同优势碳源的驯化培养基；检测菌群对PAEs的降解能力变化，筛选出使菌群保持最高降解能力的培养方案；在培养过程中检测菌群的PAEs降解功能和菌群结构特征，若在连续2代培养过程中，菌群对PAEs的降解能力和菌种组成稳定，则获得了PAEs降解功能菌群。本发明方法得到的PAEs降解功能菌群能够保持多种菌间的协同作用，具有较高的降解效率。
【专利说明】基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种降解功能菌群的筛选方法，特别是涉及一种基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法。
【背景技术】
[0002]邻苯二甲酸酯又名酞酸酯(PAEs)，是一类普遍使用的化学工业品，主要用作增塑齐[J，也应用于涂料、油漆、医疗产品、汽车玻璃、化妆品、杀虫剂等产品的生产过程中。近年来，由于PAEs类化合物的大量生产与广泛应用，导致其大量进入环境，在水、大气、土壤及生物体等各种环境介质中均有检出，现已成为最普遍的全球性污染物之一。PAEs类化合物具有环境雌激素效应，长期接触可对人类与动物的行为和生殖能力产生不良影响，部分PAEs类化合物(如邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯，DEHP)还具有“三致”效应，对人体健康和生态系统安全构成极大威胁。
[0003]近年来，国内外学者针对PAEs在土壤中的微生物降解、非生物降解、植物吸收与挥发等环境行为开展了大量的研究工作。结果表明，微生物降解是PAEs从土壤环境中消减的主要途径。因此，筛选获得PAEs高效降解菌具有重要的实践意义，可为消除PAEs污染、保护生态环境、保障农产品安全提供菌种资源和技术支撑。
[0004]目前，已有研究中报道的PAEs降解菌主要为单一菌。然而，单一菌在实际应用中存在一定的弊端。一方面，单一菌在纯化过程中失去了与自然条件下长期处于协同关系的其他菌共存的机会，导致降解功能大大降低；另一方面，单一菌孤立生长，容易受到其它菌的污染和抑制，难以在复杂的环境中正常生长和发挥作用，从而难以成功应用于环境治理和修复中。因此，研究开发PAEs高效降解菌群，建立筛选与培养方法对于PAEs污染环境的修复治理具有重要意义。
[0005]B1log技术是由美国的B10L0G公司于1989年开发成功的能够进行95种唯一碳源的生化反应测试技术，最初应用于纯种微生物鉴定。1991年，Garland和Mill开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究。B1log技术用于环境微生物群落研究，具有以下特点:①灵敏度高，分辨力强。②无需分离培养纯种微生物，可最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征。③微生物对不同碳源代谢能力的测定在一块微平板上一次完成，大大提高测试效率。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，该方法以PAEs的降解功能为核心，通过定向驯化获得高效稳定的PAEs降解菌群。本发明方法得到的PAEs降解功能菌群能够保持多种菌间的协同作用，具有较高的降解效率。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，所述方法包括以下过程:
1)选取含有PAEs降解功能菌群的环境介质作为菌源；
2)将上述菌源制成菌悬液，接种于驯化培养基中进行培养，并逐级进行定向驯化培养;
3)B1log生态板接种和培养，确定能够被菌群利用的优势碳源；
4)按C:N=25:1分别配制含不同优势碳源的驯化培养基，继续进行驯化培养；
5)检测菌群对PAEs的降解能力变化，筛选出使菌群保持最高降解能力的培养方案，并进行传代培养；
6)在培养过程中检测菌群的PAEs降解功能和菌群结构特征，若在连续2代培养过程中，菌群对PAEs的降解能力和菌种组成稳定，则获得了 PAEs降解功能菌群。
[0008]所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，所述含有PAEs降解功能菌群的环境介质为连续多年进行农业生产的塑料蔬菜大棚土壤、塑料制品厂厂区土壤或其废水处理车间产生的活性污泥。
[0009]所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，所述驯化培养基为以PAEs为唯一碳源的无机盐培养基，其配方为:Κ2ΗΡ04.3Η20 l.0g.Γ1, NaCl1.0.ΙΛ (NH4) 2S04 0.5g.ΙΛ MgS04.7H20 0.4g.?Λ CaCl2 0.0755 g.?Λ FeCl3.6H20
0.0143 g.!/1，水 1000 ml, pH 7.0。
[0010]所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，所述每升培养基中加入一种或多种PAEs，如邻苯二甲酸正二丁酯(DnBP、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP))的丙酮溶液，使培养基中PAEs终浓度分别为50mg七1、100mg吨―1和150mg吨―1，分装到三角瓶中，20ml/瓶，121 °C灭菌30 min。
[0011]所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，所述B1log生态板接种和培养，确定能够被菌群利用的优势碳源的方法为:将菌液依次稀释至10 3?10 6，向B1log生态板上每孔加入150μ1稀释液，然后置于25°C恒温培养箱中培养，每隔24h用B1log Reader进行测定，测定波长为590 nm。根据测定结果分析菌群对不同碳源的利用情况，确定能够被菌群利用的优势碳源。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例，对本发明作进一步详述。
[0013]本发明的筛选过程，包括:
1.选取含有PAEs降解功能菌群的环境介质作为菌源。
[0014]2.将上述菌源制成菌悬液，接种于驯化培养基中进行培养，并逐级进行定向驯化培养。
[0015]3.B1log生态板接种和培养,确定能够被菌群利用的优势碳源。
[0016]4.按C:N=25:1分别配制含不同优势碳源的驯化培养基，继续进行驯化培养。
[0017]5.检测菌群对PAEs的降解能力变化，筛选出使菌群保持最高降解能力的培养方案，并进行传代培养。
[0018]6.在培养过程中检测菌群的PAEs降解功能和菌群结构特征，若在连续2代培养过程中，菌群对PAEs的降解能力和菌种组成稳定，则获得了 PAEs降解功能菌群。
[0019]含有PAEs降解功能菌群的环境介质为连续多年进行农业生产的塑料蔬菜大棚土壤、塑料制品厂厂区土壤或其废水处理车间产生的活性污泥。
[0020]驯化培养基为以PAEs为唯一碳源的无机盐培养基，其配方为:K2HP04.3H20l.0g.L'NaCl 1.0.?Λ (NH4) 2S04 0.5g.?Λ MgS04.7Η20 0.4g.Γ1，CaCl2 0.0755 g.?ΛFeCl3.6H20 0.0143 g.!/1，水1000 ml, pH 7.0。每升培养基中加入一种或多种PAEs (如邻苯二甲酸正二丁酯(DnBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)等)的丙酮溶液，使培养基中PAEs终浓度分别为50mg.L'lOOmg.L-1和150mg.L ―1，分装到三角瓶中，20ml/瓶，121°C灭菌 30 min。
[0021]B1log生态板接种和培养,确定能够被菌群利用的优势碳源的方法为:将菌液依次稀释至10 3?10 6，向B1log生态板上每孔加入150μ1稀释液，然后置于25°C恒温培养箱中培养，每隔24h用B1log Reader进行测定，测定波长为590 nm。根据测定结果分析菌群对不同碳源的利用情况，确定能够被菌群利用的优势碳源。
[0022]检测菌群PAEs降解功能的方法为液液萃取-气相色谱法。向驯化培养液中加入10 ml 二氯甲烷，转移到分液漏斗中，振荡萃取10 min，静置，收集有机相；水相再分别用10ml色谱纯二氯甲烷萃取2次，合并有机相，经无水Na2S04除水后，于40°C下旋转蒸发至近干，用色谱纯正己烷定容至1.0 mL，备测。用气相色谱仪测定待测液中PAEs含量，测定条件:DB-5 色谱柱(30m*0.32mm), FID 检测器，分析程序:柱温:150°C 0.5min ；5°C.min—1，220V ；3°C.min—1 275°C ;保持5min。检测器温度:300°C ;进样口温度:275°C ;氮吹速度:
1.2ml.mirT1;进样体积lul,不分流进样模式。
[0023]菌种组成的检测方法为聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术。首先提取复合菌群总DNA，然后其为模板，采用细菌16S rDNA V3区引物F338-GC和R518进行PCR扩增，扩增的目的片段约为230bp。扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，比较分析各代间菌种组成的变化，当连续2代之间的PCR-DGGE条带稳定时，说明复合菌群组成稳定。
[0024]实施例1:
一种基于B1log技术的DEHP降解菌群的筛选方法，包括以下过程:
1.选取沈阳市郊棚龄为20年的塑料蔬菜大棚土壤作为菌源。
[0025]2.将上述菌源制成菌悬液，接种于选择培养基中进行培养，并逐级进行定向驯化培养，驯化培养基中的DEHP终浓度依次为50mg.L-1，100mg.L-1，150mg.L-1。
[0026]3.B1log生态板接种和培养。将菌液依次稀释至10_6，向B1log生态板上每孔加入150μ1 土壤稀释液,然后置于25°C恒温培养箱中培养,每隔24h用B1log Reader进行测定，测定波长为590 nm。根据测定结果分析菌群对不同碳源的利用情况，确定能够被菌群利用的优势碳源。结果发现α-D-乳糖、甘氨酰-L-谷氨酸、腐胺是能够被菌群利用的优势碳源。
[0027]4.按C:N=25:1分别配制含不同优势碳源的驯化培养基，继续进行驯化培养。
[0028]5.检测菌群对PAEs的降解能力变化，筛选出使菌群保持最高降解能力的培养方案，并进行传代培养。结果表明培养基中添加a -D-乳糖时菌群获得了最高的降解能力。当培养液中DEHP初始浓度为150mg.L—1时，按1%的接种量接种混合菌群，培养24h，DEHP的降解率可达到98.02%。
[0029]6.在培养过程中检测菌群的PAEs降解功能和菌群结构特征，结果表明经连续3代培养以后，菌群对PAEs的降解能力和菌种组成稳定，该菌群即可作为DEHP降解功能菌群。
【权利要求】
1.基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下过程: 选取含有PAEs降解功能菌群的环境介质作为菌源； 将上述菌源制成菌悬液，接种于驯化培养基中进行培养，并逐级进行定向驯化培养； B1log生态板接种和培养,确定能够被菌群利用的优势碳源； 按C:N=25:1分别配制含不同优势碳源的驯化培养基，继续进行驯化培养； 检测菌群对PAEs的降解能力变化，筛选出使菌群保持最高降解能力的培养方案，并进行传代培养； 在培养过程中检测菌群的PAEs降解功能和菌群结构特征，若在连续2代培养过程中，菌群对PAEs的降解能力和菌种组成稳定，则获得了 PAEs降解功能菌群。
2.根据权利要求1所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，其特征在于，所述含有PAEs降解功能菌群的环境介质为连续多年进行农业生产的塑料蔬菜大棚土壤、塑料制品厂厂区土壤或其废水处理车间产生的活性污泥。
3.根据权利要求1所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，其特征在于，所述驯化培养基为以PAEs为唯一碳源的无机盐培养基,其配方为:K2HPO4.3H20 1.0g.ΙΛ NaCl 1.0.?Λ (NH4)2SO4 0.5g.?Λ MgSO4.7H20 0.4g.?Λ CaCl20.0755 g.ΙΛ FeCl3.6H20 0.0143 g.?Λ水 1000 ml, pH 7.0。
4.根据权利要求3所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，其特征在于，所述每升培养基中加入一种或多种PAEs，如邻苯二甲酸正二丁酯(DnBP、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP))的丙酮溶液，使培养基中PAEs终浓度分别为50mg.L \ 10mg.L 1 和 150mg.L1,分装到三角瓶中，20ml/ 瓶，121°C灭菌 30 min。
5.根据权利要求1所述的基于B1log技术的邻苯二甲酸酯类降解功能菌群的筛选方法，其特征在于，所述B1log生态板接种和培养，确定能够被菌群利用的优势碳源的方法为:将菌液依次稀释至1(Γ3?10 _6，向B1log生态板上每孔加入150μ1稀释液，然后置于25°C恒温培养箱中培养,每隔24h用B1log Reader进行测定,测定波长为590 nm ;根据测定结果分析菌群对不同碳源的利用情况，确定能够被菌群利用的优势碳源。
【文档编号】C12N1/02GK104480037SQ201410677065
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】李玉双, 侯永侠, 宋雪英, 胡晓钧, 郭倩, 杨晶 申请人:沈阳大学