微生物絮凝剂普通变形杆菌及其在蔗汁澄清中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了微生物絮凝剂普通变形杆菌及其在蔗汁澄清中的应用。该微生物絮凝剂的产生菌为普通变形杆菌(Proteus vulgaris)N-25，保藏编号为CCTCC NO:M2014549，已于2014年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心。应用时，于甘蔗混合汁中加入磷酸，以石灰乳调节pH至6-8后加热至50～70℃，保温；加入亚硫酸至硫熏量为1.5～2.0g/L，调节pH后7-9后加热至60～100℃，加入微生物絮凝剂静置20～40min。本发明微生物絮凝剂用量少，絮凝效率高，微生物絮凝剂安全无毒、易生物降解，应用于制糖工业，可生产出更健康环保的产品。CCTCC NO:M201454920141105
【专利说明】微生物絮凝剂普通变形杆菌及其在蔗汁澄清中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物絮凝剂，特别是涉及微生物絮凝剂普通变形杆菌（Proteus vulgaris)N-25及其在鹿汁澄清中的应用。
【背景技术】
[0002] 絮凝剂是一类可使液体中不易沉降的固体悬浮颗粒絮凝、沉淀的物质。制糖过程 中，在经过加灰的蔗汁中加入少量絮凝剂，能使汁中的沉淀物絮凝成比较粗大的团块，从而 提高沉降速度。目前，糖厂普遍使用聚丙烯酰胺作为絮凝剂，其单体丙烯酰胺具有致突变、 致畸和致癌作用，在糖汁中残留或进入到成品糖当中影响糖品安全。因此，寻求高效安全的 絮凝剂己成为我国糖业亟待解决的问题。
[0003] 微生物絮凝剂是一类由微生物产生的有絮凝活性的代谢产物，主要含有糖蛋白、 粘多糖、纤维素和核酸等，是利用生物技术通过微生物发酵、分离提取而得到的一种新型、 高效的絮凝剂。与传统的无机和有机合成高分子絮凝剂相比具有许多独特的性质和优点： ①易于固液分离，形成沉淀物少；②易被微生物降解，无毒无害，安全性高；③无二次污染。 有的微生物絮凝剂还具有不受PH条件影响、热稳定性强、用量小等特点。此外产生絮凝剂 的微生物绝大多数来自与人类关系十分密切的土壤中，资源极其丰富，获得方法比较简单。 由于微生物絮凝剂既具有微生物的某些特性，又具有天然高分子絮凝剂的特性，可克服无 机絮凝剂和有机高分子絮凝剂的不足，是当今絮凝剂的研宄热点和发展方向。
[0004] 微生物絮凝剂在处理重金属废水、厌氧废水、低温废水、印染废水等方面均达到良 好应用效果。但在制糖工业应用方面的研宄较少，且鲜有普通变形杆菌产微生物絮凝剂处 理蔗汁的报道。将微生物絮凝剂应用于制糖行业，以满足人们对食品质量和安全的要求，生 产出更健康环保的产品具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对目前甘蔗糖厂使用的聚丙烯酰胺的难降解性、"三致"效 应等问题，筛选适合制糖工业蔗汁澄清的微生物絮凝剂产生菌普通变形杆菌（Proteus vulgaris) N-25,提供一种安全、无毒、无污染的微生物絮凝剂替代已使用的有机高分子絮 凝剂聚丙烯酰胺。
[0006] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0007] 微生物絮凝剂普通变形杆菌，该微生物絮凝剂的产生菌为普通变形杆菌（Proteus vulgaris)N-25,保藏编号为 CCTCC N0:M2014549。
[0008] 所述普通变形杆菌（Proteus vulgaris)N-25 的 16S rDNA 序列为 SEQ ID NO: 1。
[0009] 所述微生物絮凝剂普通变形杆菌在蔗汁澄清工艺中的应用。
[0010] 应用时，于甘蔗混合汁中加入磷酸，以P2O5计，控制磷酸浓度为300?400ppm，调 节pH至6-7后加热至50?70°C，保温；加入亚硫酸至硫熏量为1. 5?2. 0g/L，调节pH后 6. 8-9后加热至60?100°C，加入微生物絮凝剂静置，微生物絮凝剂为待处理甘蔗汁的体积 的I %?5%。如：取甘蔗混合汁100ml，加入质量分数为80?90%的磷酸40?60 μ 1，加 石灰乳调至pH为6?7. 0,加热至50?70°C后加入亚硫酸硫熏，硫熏量为1. 5?2. Og/L， 再用石灰乳调pH至6. 8?9.0,二次加热至60?100°C，加入微生物絮凝剂1?5ml，测量 沉降50ml所需时间。静置20?40min后测量泥底体积，取上清液用0. 45 μ m微孔滤膜过 滤，分别测滤液的转光度、折光度及560nm处的吸光度，计算蔗汁的简纯度和色值。
[0011] 优选地，所述调节pH至6-7是通过加入石灰乳调节。
[0012] 优选地，所述保温的时间为2?5min。
[0013] 优选地，所述静置的时间为20?40min。
[0014] 本发明微生物絮凝剂普通变形杆菌通过如下步骤得到：
[0015] (1)活性污泥微生物的分离纯化
[0016] 取广州某污水处理厂活性污泥样品稀释至KT1?KT7的不同体积浓度梯度后，取 10'10'10'1(^用涂布平板法将污泥微生物接种于琼脂培养基。接种后在30?35°〇恒 温培养箱中培养1?3天，在平板培养基上分离得到多种微生物菌落。平板划线法挑取菌 落于培养皿进行扩大培养。重复上述步骤，经5?6次分离纯化后得不同菌落形态的微生 物，接种到斜面培养基上，于4°C冰箱储藏。
[0017] (2)絮凝剂产生菌的筛选
[0018] 分离纯化后的菌株液体扩大培养后，以2?5g/L高岭土悬浊液为指标进行筛选， 具体方法为：装有2?5g/L的高岭土悬浊液的IOOml液体中，加入3?5ml质量分数为1? 2%的0 &(：12溶液作为助凝剂，再加入l-3ml的微生物絮凝剂样品，调pH值至7. 4?7. 6,搅 拌后静置5?lOmin，进行测量。以絮凝率超过80%的菌株作为目标菌株，复筛得稳定的高 活性絮凝剂产生菌。
[0019] 3)将高活性微生物絮凝剂产生菌接入发酵培养基中，培养温度为30?40°C，摇床 转速为140?200r/min，发酵培养3?4天，发酵液在6000?8000r/min离心20min，取上 清液作为微生物絮凝剂。发酵培养基组成为：葡萄糖15?20g/L，尿素0. 4?0. 6g/L，酵母 膏0. 4?0. 7g/L，硫酸铵0. 1?0. 2g/L，磷酸氢二钾3?5g/L，磷酸二氢钾1?3g/L，氯化 钠0. 05?0. 2g/L，硫酸镁0. 1?0. 25g/L，初始pH7?8。
[0020] 相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0021] (1)本发明直接从污水处理厂活性污泥筛选微生物絮凝剂产生菌，产絮凝剂菌株 来源广泛，涂布平板法接种后在30?35°C恒温培养箱中培养1?3天，重复纯化5?6次 即可分离、纯化大量不同类型的菌株，菌株生长代谢快，分离纯化的周期短，易于操作，可适 应规模化生产。
[0022] (2)以菌株对高岭土悬浊液的絮凝率为指标，从上述步骤纯化后的菌株中，筛选的 高活性微生物絮凝剂产生菌对高岭土悬浊液的絮凝率在90 %以上。高岭土悬浊液与蔗汁澄 清结果保持高度一致性，保证筛选的菌株在实际应用于蔗汁澄清效果。
[0023] (3)筛选得到的产絮菌在温度为30?40°C，140?200r/min的转速下振荡发酵培 养3?4天，微生物絮凝剂培养温度为常温条件，转速和能耗较低而易于实现，相对化学絮 凝剂的生产成本大大降低。
[0024] (4)微生物絮凝剂处理蔗汁后，蔗汁简纯度为84. 0%以上，色值率为74. 9%以上， 絮凝性能显著改善，且微生物絮凝剂的澄清效果优于化学絮凝剂聚丙烯酰胺，沉降速度快， 絮凝后泥底体积小，便于处理。与聚丙烯酰胺处理后相比，沉降时间缩短了 6min以上，最终 泥底体积压缩了 8ml以上，蔗汁简纯度提高了 1.7%以上，脱色率提高了 12. 7%以上。
[0025] (5)本发明首次将普通变形杆菌生产的微生物絮凝剂应用于蔗汁澄清工艺，且澄 清效果显著，可为蔗汁澄清工艺提供新的思路。
[0026] (6)筛选的产絮凝菌能有效地改善蔗汁澄清效果，且具有易生物降解、高效无毒等 突出优点，可避免化学絮凝剂的二次污染等问题，是具有广阔的应用前景的新型高效絮凝 剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施聚丙烯酰胺与微生物絮凝剂处理蔗汁沉降时间、泥底体积、简 纯度、脱色率对比图。图中横坐标依次为沉降时间、泥底体积、简纯度、脱色率；纵坐标为双 Y坐标，分别为沉降时间/min、泥底体积/ml和简纯度/%、脱色率/%。
【具体实施方式】
[0028] 为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施 方式不限于此。
[0029] 以下实施例中采用的培养基的配方如下：
[0030] 筛选培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，琼脂20g/L，pH7. 5, 121°C高 压蒸汽灭菌30min。
[0031] 液体培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH7. 5，121°C高压蒸汽灭菌 30min〇
[0032] 发酵培养基：葡萄糖20g/L，尿素0. 5g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸铵0. 2g/L，磷酸氢二 钾5g/L，磷酸二氢钾2g/L，氯化钠0. lg/L，硫酸镁0. 2g/L，初始pH7. 0,115°C高压蒸汽灭菌 20min〇
[0033] 实施例1
[0034] 取广州某污水处理厂活性污泥样品lmL，稀释至KT1?KT7的不同体积浓度梯度 后，取10'10'10'1(^用涂布平板法将污泥微生物接种于琼脂培养基。接种后在30°〇 恒温培养箱中培养2天，在平板培养基上分离得到多种微生物菌落。平板划线法挑取菌落 于培养皿进行扩大培养。重复上述步骤，经5次分离纯化后得不同菌落形态的微生物，接种 到斜面培养基上，于4°C冰箱储藏。再分别将纯化后菌株接入50ml筛选培养基中，置35°C、 150r/min摇瓶培养3天，采用以下方法对所得培养液进行絮凝活性的初步测定。
[0035] 装有5g/L的高岭土悬浊液的IOOml液体中，加入5ml质量分数为1%的0&(：1 2溶 液作为助凝剂，再加入2ml的微生物絮凝剂样品，调pH值至7. 5,搅拌后静置5min，用分光 光度计测定上清液在波长为550nm处的吸光度，同时以蒸馏水代替待测样品作为对照，计 算待测微生物絮凝剂样品的絮凝率：絮凝率（％) = (A - B)/AX 100%，A为对照上清液在 550nm处的吸光度，B为样品上清液在550nm处的吸光度。以絮凝率超过80%的菌株作为 目标菌株，复筛得稳定的高活性絮凝剂产生菌。该普通变形杆菌N-25生产的微生物絮凝剂 对高岭土悬浊液絮凝效果显著，其絮凝率高达92. 6%，处理后的高岭士颗粒凝聚程度提高， 悬浊液浊度降低。
[0036] 所得菌株菌落表面光滑半透明，在营养琼脂表面上扩展成均匀的薄层，菌落形 态为直杆状。其生理生化鉴定结果如表1所示，DNA测序结果如SEQ ID ΝΟ:1所示，通过 BLAST对比，与普通变形杆菌（Proteus vulgaris)同源性高达99. 9%。经菌株形态和生理 生化及16SrDNA基因序列鉴定为普通变形杆菌（Proteus vulgaris)，命名为普通变形杆菌 (Proteus vulgaris)N_25〇
[0037] 本实施例所得的微生物絮凝剂普通变形杆菌（Proteus vulgaris)N-25已于2014 年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC N0:M2014549。保藏地址为： 湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学保藏中心，邮政编码：430072。
[0038] 表1高活性絮凝剂产生菌生理生化鉴定（+ :阳性；一，阴性）
[0039]
【权利要求】
1. 微生物絮凝剂普通变形杆菌，其特征在于：所述微生物絮凝剂的产生菌为普通变形 杆菌（Proteus vulgaris)N-25,保藏编号为 CCTCC N0:M2014549。
2. 根据权利要求1所述的微生物絮凝剂普通变形杆菌，其特征在于，所述普通变形杆 菌（Proteus vulgaris)N-25 的 16S rDNA 序列为 SEQ ID NO: 1。
3. 权利要求1所述微生物絮凝剂普通变形杆菌在蔗汁澄清工艺中的应用。
4. 根据权利要求3所述的微生物絮凝剂在蔗汁澄清工艺中的应用，其特征在于，应用 时，于甘蔗混合汁中加入磷酸，以P2〇5计，控制磷酸浓度为300?400ppm，调节pH至6-7后 加热至50?70°C，保温；加入亚硫酸至硫熏量为1. 5?2. Og/L，调节pH后6. 8-9后加热至 60?100°C，加入微生物絮凝剂静置，微生物絮凝剂为待处理甘蔗汁的体积的1 %?5%。
5. 根据权利要求3所述的微生物絮凝剂在蔗汁澄清工艺中的应用，其特征在于，所述 调节pH至6-7是通过加入石灰乳调节。
6. 根据权利要求3所述的微生物絮凝剂在蔗汁澄清工艺中的应用，其特征在于，所述 保温的时间为2?5min。
7. 根据权利要求3所述的微生物絮凝剂在蔗汁澄清工艺中的应用，其特征在于，所述 静置的时间为20?40min。
【文档编号】C12N1/20GK104480036SQ201410676883
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】扶雄, 罗玉琴, 侯轶, 胡松青 申请人:华南理工大学