交叉保护性沙粒病毒疫苗及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及单独或同时靶向多种沙粒病毒剂的DNA疫苗。
【专利说明】交叉保护性沙粒病毒疫苗及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年7月11日提交的美国临时申请号61/506，579和2011年7月12日提交的美国临时申请号61/507，062的权益，所述美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
[0003]联邦资助的研究和开发
[0004]关于本发明的主题开发的活动至少部分地由美国政府军队合同号W81XWH-12-0154资助，并且因此美国可以在本发明中具有某些权利。
发明领域
[0005]本发明涉及有效于 引出针对沙粒病毒的保护性免疫应答的基于DNA的疫苗，以及制造和使用所述疫苗的方法。
[0006]发明背景
[0007]沙粒病毒(AV)是啮齿动物传播的病毒，所述病毒引起急性和经常致命性的出血热，并具有相关的不适、严重水肿、失血以及高死亡率。拉沙病毒(LASV)是西非地区特有的旧大陆沙粒病毒。已在美国、欧洲和加拿大报道过拉沙热的输入性病例。据估计，每年发生300，000例至500，000例之间的拉沙热病例，在住院患者中有15%至20%的死亡率。新大陆沙粒病毒(呼宁(Junin)病毒(JUNV)、马秋博(Machupo)病毒(MACV)、瓜纳瑞托(Guanarito)病毒以及萨比亚(Sabia)病毒)是南美洲特有的，并且已知每年引起成千上万例严重出血热病例。沙粒病毒是⑶C A类生物威胁剂，并且在新兴疾病爆发或被这些病毒生物恐怖袭击的不利情况下，将不存在可供公众使用的FDA批准的曝露前或曝露后治疗剂或疫苗。已报道了鉴别可以在小鼠中引出免疫应答的HLA I类限制性表位的研究。参见Botten, J.等，J.Vir.9947-9956 (2010 年 10 月)。
[0008]对于因爆发和高度的发病率和死亡率而最近受到所有关注的沙粒病毒，存在非常少的可供使用的治疗。不存在获得许可的疫苗用于AV预防，并且仅获得许可用于治疗人AV感染的药物为抗病毒药物病毒唑。如果在曝露早期服用，病毒唑帮助减小与AV感染相关的发病率和死亡率，但要遭受到高毒性和副作用。存在对于以下的明确未满足的需要:开发低成本和/或对治疗有疗效的药物和用于在世界AV特有区域进行预防以及用于经由生物防御威胁或通过在世界特有的各地部署美国军事人员来防治曝露的有效疫苗。
[0009]此外，还存在对多药剂沙粒病毒疫苗的未满足的需要。如更早所指出，不存在可供使用的竞争性有效的预防法或疗法。据我们所知，由FDA批准的用于在试验性新药(IND)身份下限制使用的呼林减毒活疫苗(候选#1)是用于沙粒病毒感染所测试的唯一疫苗。然而，随后此疫苗还在动物研究中显示出不能针对其它沙粒病毒株进行交叉保护。
[0010]因此，仍存在对提供有疗效药物的疫苗或用于沙粒病毒的有效疫苗以及单独或同时靶向多种沙粒病毒剂的疫苗的需要。
[0011]附图简述
[0012]图1(A)、图1 (B)、图1(C)和图1(D)展示出用非优化的(包含SEQ ID NO: 3)与优化的构建体(包含SEQ ID NO:1)进行疫苗接种的豚鼠的血清病毒血症评分和发病率评分。
[0013]图1 (B2)和图1 (D2)展示出分别添加非侵害性电穿孔(NTVEP)的血清病毒血症评分和发病率评分的图1(B)和图1(D)的数据。
[0014]图2(A)和图2(B)展示出豚鼠中非优化(包含SEQ ID NO: 3)和密码子优化的(包含SEQ ID NO:1)LASV DNA疫苗的存活曲线。
[0015]图3⑷和图3(B)展示出参与反激发(back challenge)研究的豚鼠的重量和温度。
[0016]图4展示出用LASV致命激发存活的LASV-GPC或模拟疫苗接种的猴子的BAERC0M听觉筛分。
[0017]图5 (A)、图5 (B)和图5 (C)展示出接受LASV-GPC (包含SEQ ID NO: 2)或模拟(包含SEQ ID勵:3)0嫩疫苗的食蟹猴(071101]10]^118 macaque)的存活曲线、血清病毒血症评分以及发病率评分。
[0018]图6 (A)、图6 (B)和图6 (C)展示出接受LASV-GPC (包含SEQ ID NO: 2)或模拟(包含SEQ ID NO:3)DNA疫苗的食蟹猴的所选择的血液化学值。
[0019]图7 展示出接受 LASV-GPC(包含 SEQ ID NO: 2)或模拟(包含 SEQ ID NO: 3)DNA疫苗的食蟹猴的选择的血液学值。
[0020]图8展示出针对 豚鼠优化的LASV-GPC密码子(LASV-GPC GP)、针对非人灵长类动物优化的LASV-GPC密码子(LASV-GPC NHP)与参比LASV GPC (对照)之间的序列比对。
[0021]详述
[0022]本发明的一方面提供包括核苷酸编码序列的DNA疫苗，所述核苷酸编码序列编码一种或多种能够在有需要的受试者中产生针对沙粒病毒的保护性免疫应答的免疫原性蛋白。编码序列编码沙粒病毒的糖蛋白前体，并且是针对感兴趣的受试者进行密码子优化的。另外，编码序列可以是其与糖蛋白前体至少98%同源的免疫原性片段。
[0023]在一些实施方案中，编码序列基本上由以下组成:LASV(LASV-GPC)的糖蛋白前体结构域、LCMV (LCMV-GPC)的糖蛋白前体结构域、MACV (MACV-GPC)的糖蛋白前体结构域、JUNV (JUNV-GPC)的糖蛋白前体结构域、GTOV (GTOV-GPC)的糖蛋白前体结构域、WffAV(WffAV-GPC)的糖蛋白前体结构域或PICV(PICV-GPC)的糖蛋白前体结构域。优选地，片段包括:包括残基441至449的LASV-GPC的片段、包括残基447至455的LMCV-GPC的片段、包括残基444至452的MACV-GPC的片段、包括残基429至437的JUNV-GPC的片段、包括残基427至435的GTOV-GPC的片段、包括残基428至436的WffAV-GPC的片段或包括残基455至463的PICV-GPC的片段。
[0024]在一个优选的实施方案中，DNA疫苗基本上由所述编码序列之一一单一药剂或单价疫苗组成。在另一个优选的实施方案中，DNA疫苗基本上由所述编码序列的至少两个一复合药剂或多价疫苗组成。优选地，单价或多价疫苗包括所公开的LASV-GPC,并且更优选地SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2，或编码SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:5的核苷酸编码序列。
[0025]在一些实施方案中，所提供的DNA疫苗进一步包含选自由以下组成的组的佐剂:IL-12、IL-15、IL-28 或 RANTESo
[0026]在本发明的一方面中，提供了诱导针对沙粒病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括施用本文提供的DNA疫苗，以及电穿孔所述受试者。在一些实施方案中，电穿孔步骤包括将具有能量的电穿孔脉冲递送至发生施用步骤的所述受试者上的部位。优选地，施用步骤和电穿孔步骤都发生在所述受试者的真皮内层中。
[0027]所公开的本发明涉及新型DNA候选疫苗，其在受试者中针对一种或在一些情况下针对多种沙粒病毒(LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WffAV以及PICV)产生保护性免疫应答，所述沙粒病毒涵盖旧大陆病原体和新大陆病原体。
[0028]所提供的疫苗包含AV GPC结构域DNA免疫原以便增加免疫应答的多样性和针对多种相关但相异的病毒的交叉保护。本文进一步描述了基因优化过的免疫原，特别是针对沙粒病毒优化的GPC结构域，其能够靶向更广谱的病原体。疫苗的一个实施方案是优化的LASV编码序列，其可以额外地包括靶向LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WffAV以及PICV病毒并且优选MACV和JUNV病毒的疫苗以便得到复合药剂制剂。
[0029]可以用高度创新的制造方法和优化的疫苗制剂来组合疫苗以便增强复合药剂制剂的效力。传统上，仅能够制造出浓度为2mg/mL至4mg/mL的DNA。此物理限制使得难以在足够高以达到保护性疗效的剂量水平下组合靶向多抗原的DNA质粒。通过利用如在美国专利号7，238，522和美国专利公布号2009-0004716中描述的专有制造方法，可以制造出浓度>10mg/mL且具有高纯度的DNA质粒，所述专利整体并入本文。此高浓度制剂还有益于在小的注射体积(0.1mL)下进行有效递送，如用于常规ID注射。
[0030]疫苗还可以用基于高度创新和有效电穿孔(EP)的DNA递送系统来组合以便增加所注射的DNA疫苗的效力。具有浅电穿孔深度和低/瞬态电参数的EP递送系统使新装置对预防应用和群体疫苗接种的耐受性大得多。
[0031]用所提供的制造方法和电穿孔递送装置组合的此DNA疫苗尤其可以提供以下益处:
[0032].无载体诱导的应答-反复加强；复合疫苗/组合疫苗
[0033].比在灵长类动物中和人中的病毒载体效力更大
[0034].制造优点
[0035]本文提供了单一药剂LASV候选疫苗的细节，所述单一药剂LASV候选疫苗已显示出在受试者中对在豚鼠和非人灵长类动物激发模型中的致死引出100%保护。在非人灵长类动物模型中，LASV候选疫苗显示出促进此疫苗方法的临床转化。先前在具有任何其它沙粒病毒候选疫苗(具载体型或非具载体型)的文献中还没有实现针对两种不同激发模型的这种成功。
[0036]LASV候选疫苗是靶向旧大陆病毒和新大陆病毒两者的复合药剂候选疫苗。GPC抗原(病毒的免疫原性组分)在LASV、MACV以及JUNV中不是高度保守的，在不同沙粒病毒亚型(分别为LASV-MACV/JUNV和MACV-JUNV)中具有42%至71%范围内的同源性并且在不同亚型内的序列之中具有2%至10%的差异。因此，开发复合药剂疫苗不是显而易见的并且充满若干技术挑战。
[0037]本文所提供的候选疫苗已优化了 GPC候选疫苗用于各靶标的病毒亚型，以使得它们单独针对各自的株系(例如，LASV、JUNV、MACV)有效并且共同对这些和其它沙粒病毒株进行交叉保护。制造候选疫苗以使得质粒组分处于高浓度(>10mg/mL)。候选疫苗的组分可以被组合用于用EP进行递送。相对于不带有EP的DNA递送，EP递送已显示出改进DNA转染和基因表达效率超过1000倍，并且改进免疫原性和疗效超过10至100倍。复合DNA疫苗-低注射体积-EP递送使得此方法尤其适用于预防性疫苗接种并且具体是复合药剂疫苗递送。
[0038]本文所描述的DNA疫苗方法拥有优于其它竞争性减毒活病毒/死病毒方法以及其它基于载体的方法(Ad5、MVA、YF)的独特安全优势，因为DNA疫苗是非复制的，不能整合到基因组中，并且不像载体，不能引起可以进一步限制具载体的疫苗的效力的抗载体血清学。DNA疫苗如今经过几百个不同的疫苗试验已递送至好几千人受试者，从安全角度来看具有较少的注意。与EP递送一起，DNAEP疫苗(HIV、HPV、流感、HCV、前列腺癌、黑素瘤)已经由肌肉内或真皮内途径递送至超过150人以上的受试者和超过350次以上的疫苗接种，并且安全特性(safety profile)不值得注意。
[0039]在一个实施方案中，候选疫苗可以具有以下性能说明:
【权利要求】
1.一种包含核苷酸编码序列的DNA疫苗，所述核苷酸编码序列编码一种或多种能够在有需要的受试者中产生针对沙粒病毒的保护性免疫应答的免疫原性蛋白，所述DNA疫苗包含: 编码沙粒病毒的糖蛋白前体的编码序列，所述编码序列针对所述受试者进行密码子优化；或其与所述糖蛋白前体98%同源的免疫原性片段。
2.如权利要求1所述的DNA疫苗，其中所述编码序列基本上由以下组成:LASV (LASV-GPC)的糖蛋白前体结构域、LCMV (LCMV-GPC)的糖蛋白前体结构域、MACV (MACV-GPC)的糖蛋白前体结构域、JUNV (JUNV-GPC)的糖蛋白前体结构域、GTOV (GTOV-GPC)的糖蛋白前体结构域、WffAV (WffAV-GPC)的糖蛋白前体结构域或PICV (PICV-GPC)的糖蛋白前体结构域。
3.如权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述片段包括: 包括残基441至449的LASV-GPC的片段， 包括残基447至455的LMCV-GPC的片段， 包括残基444至452的MACV-GPC的片段， 包括残基429至437的JUNV-GPC的片段， 包括残基427至435的GTOV-GPC的片段， 包括残基428至436的WffAV-GPC的片段，或 包括残基455至463的PICV-GPC的片段。
4.如权利要求1至3中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗基本上由所述编码序列之一组成。
5.如权利要求1至3中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗基本上由所述编码序列的至少两个组成。
6.如权利要求1至5中任一项所述的DNA疫苗，其进一步包含选自由以下组成的组的佐剂:IL-12、IL-15、IL-28 或 RANTESo
7.如权利要求6所述的DNA疫苗，其中所述编码序列为: SEQ ID N0:1 或 SEQ ID N0:2，或编码 SEQ ID N0:4 或 SEQ ID N0:5 的核苷酸序列。
8.一种诱导针对沙粒病毒的保护性免疫应答的方法，其包括: 向有需要的受试者施用如权利要求1至6中任一项所述的DNA疫苗，以及 电穿孔所述受试者。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括: 将具有能量的电穿孔脉冲递送至发生施用步骤的所述受试者上的部位。
10.如权利要求9 所述的方法，其中所述施用步骤和电穿孔步骤都发生在所述受试者的真皮内层。
【文档编号】C12N15/00GK103687625SQ201280034401
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年7月11日
【发明者】凯特·布罗德里克, 尼兰詹·萨尔德赛, 凯瑟琳·卡什曼, 康妮·施马尔约翰 申请人:艾诺奥医药品有限公司