专利名称：用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料及其制备方法。
背景技术：
肝脏是人体内物质代谢的中心，具有代谢、排毒等功能，因肝癌、脂肪肝、肝硬化、 肝炎等肝脏疾病导致死亡的情况已屡屡发生，严重威胁着人类健康。研制理想的肝组织工 程支架材料是医学和生物材料科学领域中的重要方向。 生物材料是指一类可对机体组织进行修复、替代与再生，具有特殊功能作用的材 料。生物材料表面在生物和医学中起着至关重要的作用，因为生物材料植入生物体后，首先 与机体接触发挥生物学反应的就是生物材料表面/界面。而绝大部分生物反应，诸如蛋白 吸附、细胞粘附、迁移及生长等生物学行为正是细胞与材料表面之间的相互作用。深入理 解生物材料表面与细胞相互作用并进行表面修饰是临床应用材料设计的关键(Chem. Eng. News, 1999， 73 :51-59)。因此，细胞/基因活化的生物材料，即第三代生物材料(Science, 2002， 295， 1014-1017)，便应运而生，它是组织工程发展的要求和必然趋势。从分子水平对 细胞进行剌激而促进细胞的繁殖分化，进而促进组织的修复及再生。最重要的是，细胞/基 因活化生物材料的产生为基因的可控、耙向性释放提供了新的思路。将基因释放和生物材 料研究的有机结合，构建具有原位基因释放性能的生物材料表面工程在基因治疗和组织工 程研究领域中具有重大意义。 聚乳酸是一种可降解性生物材料，被广泛的应用于组织工程支架和植入体领 域，并获得了美国FDA认证(Biomaterials 1996;17:175-85.)。然而，聚乳酸作为支架 材料所面临的最大问题是对生物环境缺乏组织相容性和抗性(Biomaterials 2001 ;22 : 219-30.)，因为聚乳酸表面不存在利于细胞产生响应的活性功能基团。为了提高聚乳酸的 生物相容性，促进细胞与材料的相互反应，诱导可控的细胞生物学行为，研究者对聚乳酸植 入体的表面工程展开了大量的研究。X. B. YANG等用纤维结合蛋白(FN)和聚赖氨酸(PLL)修 饰聚乳酸表面，与未修饰的材料相比，发现经过蛋白质修饰后的聚乳酸材料能提高细胞的 粘附与铺展，聚乳酸组织相容性增加(Bone 2001 ;29(6) :523-531) 。 Cai K等用黄芩甙对三 维聚乳酸支架表面进行修饰，结果表明黄芩甙修饰的聚乳酸支架生物相容性高于未经修饰 的聚乳酸支架(Acta Biomater. 2007 ;3 :597-605) 。 C. M. Alves等用乳浆修饰聚乳酸表面， 实验表明处理后的聚乳酸表面能够提高蛋白质的吸附量，并且有利于细胞的粘附(Journal ofBiomedical Materials Research Part B :Applied Biomaterials 2008 ;87 :59-66)。
然而，这些方法仍不能解决聚乳酸植入体与肝脏周边组织的整合、长期稳定性等 问题。 半乳糖是肝细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，使肝细胞识别的相应位 点并产生特异性相互作用，通过引入含有半乳糖的残基，壳聚糖可以增加肝细胞的附着点。 半乳糖苷化的壳聚糖(galactosylated chitosan，GC)具有良好的生物相容性和降解性，它 与质粒DNA形成的多层膜可以在生理条件下发生降解，使质粒DNA或GC/DNA颗粒被释放；当GC/DNA颗粒从多层膜的层状结构上释放出来后，GC携带DNA特异的与肝脏细胞表面脱 唾液酸糖蛋白受体相结合，实现基因传递的靶向性；同时，由于多层膜持续降解的特点，GC/ DNA颗粒在长时间内持续产生，维持了质粒DNA的浓度，细胞特异的吸收质粒DNA后在相应 的时间内使质粒DNA持续表达，达到基因治疗的目的。 将半乳糖苷化的壳聚糖、质粒DNA及聚乳酸材料进行整合，提供一种新型基因活 化聚乳酸材料，不仅能够诱导和提高肝细胞在细胞外基质支架材料上的黏附性能，提高植 入体的稳定性，同时能够原位诱导肝细胞生长，提高肝细胞的生长代谢活性，促进肝脏组织 的修复和再生，进一步介导肝靶向性基因转移，实现基因的可控、靶向性释放，从而实现对 肝病有效治疗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料， 具有良好的细胞相容性，不仅能够原位诱导肝细胞生长，提高肝细胞的生长代谢活性，促进 肝脏组织的修复和再生，而且能够提高肝细胞在细胞外基质支架材料上的黏附性能，提高 植入体的稳定性，进一步介导肝靶向性基因转移，有效地调控基因靶向性释放并增强细胞 活力，提高转染率，实现对肝病有效治疗。 本发明所述的用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料，包括聚乳酸材料本体，所述 聚乳酸材料本体表面覆有活化层，所述活化层由内向外包括依次间隔设置的质粒DNA层和 半乳糖苷化壳聚糖层。 进一步，所述聚乳酸材料本体表面与活化层之间设有聚乙烯亚胺层；
进一步，所述活化层中质粒DNA层与半乳糖苷化壳聚糖的总层数为9-21层。
本发明的目的之二是提供制备所述用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料的方法， 包括如下步骤 (1)将所述聚乳酸材料本体浸于聚乙烯亚胺溶液中10-20分钟后，用去离子水浸 泡l-3次，每次1-2分钟； (2)将步骤(1)所得聚乳酸材料本体浸入含有质粒DNA的磷酸盐缓冲液中10-20 分钟后，用去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟； (3)将步骤(2)所得聚乳酸材料浸于半乳糖苷化壳聚糖的乙酸溶液中10-20分钟 后，用去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟； (4)依次重复步骤(2)和步骤(3)，直至得到所需层数的用于肝病治疗的基因活化 聚乳酸材料。 进一步，所述聚乙烯亚胺溶液中包括的组分及相应组分在溶液中的浓度分别为 2-5mg/ml的聚乙烯亚胺和100-150mM的氯化钠； 进一步，所述含有质粒DNA的磷酸盐缓冲液pH值为7. 4，质粒DNA浓度为0. l_lmg/ ml ; 进一步，所述半乳糖苷化壳聚糖的乙酸溶液包括的组分及相应组分在溶液中的浓 度分别为质量百分比为3% _5%的半乳糖苷化壳聚糖和质量百分比为1_3%的乙酸。
本发明的有益效果是 本发明的用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料具有如下优点
a.将半乳糖基与将半乳糖苷化的壳聚糖、质粒DNA及聚乳酸材料进行整合，利用 肝细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体对半乳糖基的特异性识别，提高肝细胞在壳聚糖表面的附 着点。 b.利用半乳糖苷化的壳聚糖的生物相容性和降解特性，在聚乳酸材料本体表面依 次间隔设置半乳糖苷化壳聚糖层和质粒DNA层形成活化层，在特定时期内，活化层在人体 内逐步降解，使质粒DNA或GC/DNA颗粒被释放；当GC/DNA颗粒从多层膜的层状结构上释放 出来后，GC携带DNA特异的与肝脏细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体相结合，实现基因传递的 靶向性。 c.由于多层膜持续降解的特点，GC/DNA颗粒在长时间内持续产生，维持了质粒 DNA的浓度，细胞特异的吸收质粒DNA后在相应的时间内使质粒DNA持续表达，达到基因治 疗的目的。 综上，本发明的用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料具有良好的细胞相容性，不 仅能够原位诱导肝细胞生长，提高肝细胞的生长代谢活性，促进肝脏组织的修复和再生，而 且能够提高肝细胞在细胞外基质支架材料上的黏附性能，提高植入体的稳定性，进一步介 导肝靶向性基因转移，有效地调控基因靶向性释放并增强细胞活力，提高转染率，从而实现 对肝病有效治疗，非常适合临床应用。 本发明所述的制备用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料的方法利用半乳糖苷化
壳聚糖分子与质粒DNA之间的静电作用使半乳糖苷化壳聚糖层与质粒DNA层在聚乳酸材料
表面依次沉积，不仅操作简单，成本低廉，而且实施容易，非常适合用于产业化运用。 本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并
且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可
以从本发明的实践中得到教导。
附图为H印G2及HEK293细胞分别在聚乳酸材料1、聚乳酸材料2和聚乳酸材料3 表面得转染效率的对比图。
具体实施例方式以下将结合具体实施例对本发明进行详细的描述。应当理解，所选实施例仅为了
说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
实施例 ①制备半乳糖苷化壳聚糖 配置NaHC03/乙酸缓冲溶液(缓冲液的pH4. 7，溶液中NaHC03的浓度为0. IN);取 乳糖醛酸(LA)溶于NaHC0乂乙酸缓冲溶液中，制备成摩尔浓度为64mM乳糖醛酸溶液，然后 加入1-乙基_3- (3- 二甲基氨丙基)_碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，所得 溶液中，LA、 NHS和EDC三者的摩尔比为2 : 1 : 1，当然，此处LA、 NHS和EDC三者的摩尔
比为1:1:1-2:1:1均可； 室温下磁力搅拌5min使物料完全溶解后于4。C环境中放置3小时，然后室温反应 3小时，再向溶液中加入壳聚糖(LA与壳聚糖的摩尔比为2 : 1)，持续搅拌3天，以透析袋在去离子水中透析3天，透析所得溶液经冷冻干燥后分别得到半乳糖接枝率为10. 9%半乳 糖苷化壳聚糖固体； ②取半乳糖苷化壳聚糖并将其溶于乙酸溶液，得半乳糖苷化壳聚糖得乙酸溶液；
③将聚乳酸材料本体浸于聚乙烯亚胺溶液中10分钟，然后用去离子水浸泡1分 钟； ④再将步骤③所得表面覆有聚乙烯亚胺层的聚乳酸材料浸入含有质粒DNA的 pH7. 4的磷酸盐缓冲液中20分钟，然后用去离子水浸泡1分钟；最后将聚乳酸材料浸于半 乳糖苷化壳聚糖的乙酸溶液中，10分钟后，用去离子水浸泡1分钟，本实施例中，质粒DNA为 pSV-P-galactosidase质粒；当然，所述质粒DNA还可以为其他质粒，如带有功能性蛋白基 因序列的质粒。 ⑤重复步骤④的操作直至在聚乳酸材料外表面形成的质粒DNA层和半乳糖苷化
壳聚糖层的总层数为15层，得所需用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料。 本实施例所述聚乙烯亚胺溶液包括的组分及相应组分在溶液中的浓度分别为
5mg/ml的聚乙烯亚胺和150mM的氯化钠，所述磷酸盐缓冲液pH值为7. 4，缓冲液中质粒DNA
浓度为lmg/ml，所述半乳糖苷化壳聚糖的乙酸溶液中包括的组分及相应组分在溶液中的浓
度分别为质量百分比为5%的半乳糖苷化壳聚糖和质量百分比为1%的乙酸。 本实施例中，聚乳酸材料本体表面与活化层之间设有聚乙烯亚胺层，其优点在于
聚乙烯亚胺通过物理吸附作用吸附在聚乳酸表面，使不带电荷的聚乳酸表面带上正电荷，
其作为引发层，引发后续电解质的沉积。当然，聚乳酸材料本体表面与活化层之间不设置聚
乙烯亚胺层同样可实现本发明的目的，区别在于后续大分子的沉积效果较差，活化层稳定
性较低。 本实施例中，聚乙烯亚胺溶液中包括的组分及相应组分在溶液中的浓度为 2-5mg/ml的聚乙烯亚胺和100-150mM的氯化钠均可；本实施例中，所述含有质粒DNA的磷 酸盐缓冲液pH值为7. 4以及质粒浓度为0. l-lmg/ml均可；本实施例中，所述半乳糖苷化壳 聚糖的乙酸溶液包括的组分及相应组分在溶液中的浓度为质量百分比为3% _5%的半乳 糖苷化壳聚糖和质量百分比为1_3%的乙酸均可。 本实施例中，活化层中质粒DNA层和半乳糖苷化壳聚糖总层数不低于五层即可， 因为总层数大于5层的活化层结构较为完善，使用者可以根据需要限定聚乳酸材料本体表 面活化层的总层数，以实现特定时间内质粒DNA的持续释放，活化层总层数以9-21层最佳， 原因在于9层以上的质粒DNA层数是能够确保质粒DNA的总含量，达到长时间持续释放的 目的，但过多层数可能导致质粒DNA在特定时间段释放过量或难于控制。
所述用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料制备方法中，聚乳酸材料本体在聚乙烯 亚胺溶液、磷酸盐缓冲液以及壳聚糖的乙酸溶液中的浸泡时间可分别为10-20分钟，但并 不表示本发明方法中，各溶液浸泡阶段的时间局限于10-20分钟，浸泡的目的在于使质粒 DNA层及半乳糖苷化壳聚糖层能够依次间隔附着于聚乳酸材料本体的外表面，由于同层介 质(聚阴离子或聚阳离子)的同性电荷排斥，理论上倾向于形成单层结构，浸泡时间长，可 使聚阴离子或聚阳离子层形成更充分，对聚乳酸材料表面覆盖更完整，形成的覆盖层更平 整，浸泡时间以质粒DNA层或者半乳糖苷化壳聚糖能够完整覆盖聚乳酸材料表面形成单层
结构即可。
本实施例中，各溶液对聚乳酸材料的浸泡结束后，皆需采用去离子水进行浸泡洗 涤，各阶段去离子水浸泡的次数均以l-3次为宜、去离子水浸泡时间均以每次l-3min为宜， 原因在于浸泡目的在于移除在同一层中可能形成双层或多层的聚阴离子或聚阳离子，以 免它们对后面铺层结构的稳定性造成影响，但浸泡时间过长，则可能导致已形成的多层结 构解离。
结果验证 H印G2及HEK293细胞分别在聚乳酸材料1、聚乳酸材料2和聚乳酸材料3表面的 转染效率的鉴定。 本实施例中所述接枝率为10. 9%的半乳糖苷化壳聚糖与pSV-P -galactosidase 质粒修饰的基因活化聚乳酸材料记为聚乳酸材料1。( — )重复步骤①的操作，区别在于此步骤中LA与壳聚糖的摩尔比及4 : l，制备 得到接枝率为19. 4%的半乳糖苷化壳聚糖； (二)重复步骤②-⑤的操作，在另一聚乳酸材料表面构建活化层，本步骤所 述活化层包括由内向外依次间隔设置的接枝率为19.4%的半乳糖苷化壳聚糖层与质粒 pSV-P -galactos idase层，所得基因活化聚乳酸材料记为聚乳酸材料2 ;
(三)重复步骤②_⑤的操作，在第三个聚乳酸材料表面构建活化层，本步骤所述 活化层包括由内向外依次间隔设置的壳聚糖层与质粒pSV-P -galactosidase层，所得基 因活化聚乳酸材料记为聚乳酸材料3 ;(四)将H印G2及HEK293细胞分别接种在聚乳酸材料1、聚乳酸材料2和聚乳酸材 料3的表面。H印G2细胞及HEK293细胞接种密度分别为150000cells/well和80000cells/ well ;分别用DMEM培养基加10%的新生牛血清对三种聚乳酸材料表面的细胞进行培养， 细胞在材料表面培养2天后，以0. 25%胰酶消化，收集细胞并用半乳糖苷酶检测试剂盒 (Sigma公司产品)检测三种体系中半乳糖苷酶在H印G2及HEK293细胞中的表达，结果如图 1。 从图可知，不同活化层修饰的聚乳酸表面对基因转染存在细胞选择性；对于细胞 表面表达脱唾液酸糖蛋白受体(半乳糖为其配体)的H印G2而言，转染率随着半乳糖接枝 率的上升而增加，而HEK293细胞不存在这种趋势；与聚乳酸材料3的表面相比，其它两种基 因活化的聚乳酸材料表面都可促进半乳糖苷酶的表达，且半乳糖苷酶表达量也随着半乳糖 接枝率的上升而增加，说明半乳糖苷化壳聚糖/质粒DNA活化的聚乳酸表面能够调控基因 释放并增强细胞活力，提高转染率。 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。
权利要求
一种用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料，其特征在于包括聚乳酸材料本体，所述聚乳酸材料本体表面覆有活化层，所述活化层由内向外包括依次间隔设置的质粒DNA层和半乳糖苷化壳聚糖层。
2. 根据权利要求1所述的用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料，其特征在于所述聚 乳酸材料本体表面与活化层之间设有聚乙烯亚胺层。
3. 根据权利要求1或2所述的用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料，其特征在于所述活化层中质粒DNA层与半乳糖苷化壳聚糖的总层数为9-21层。
4. 制备权利要求1所述的用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在于 包括如下步骤(1) 将所述聚乳酸材料本体浸于聚乙烯亚胺溶液中10-20分钟后，用去离子水浸泡1-3次，每次l-2分钟；(2) 将步骤(1)所得聚乳酸材料本体浸入含有质粒DNA的磷酸盐缓冲液中10-20分钟 后，用去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟；(3) 将步骤(2)所得聚乳酸材料浸于半乳糖苷化壳聚糖的乙酸溶液中10-20分钟后，用 去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟；(4) 依次重复步骤(2)和步骤(3)，直至得到所需层数的用于肝病治疗的基因活化聚乳 酸材料。
5. 根据权利要求4所述的制备用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在 于所述聚乙烯亚胺溶液中包括的组分及相应组分在溶液中的浓度分别为2-5mg/ml的聚 乙烯亚胺和100-150mM的氯化钠。
6. 根据权利要求5所述的制备用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在 于所述含有质粒DNA的磷酸盐缓冲液pH值为7. 4，质粒DNA浓度为0. l_lmg/ml。
7. 根据权利要求6所述的制备用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在 于所述半乳糖苷化壳聚糖的乙酸溶液包括的组分及相应组分在溶液中的浓度分别为质 量百分比为3% _5%的半乳糖苷化壳聚糖和质量百分比为1-3%的乙酸。
全文摘要
本发明公开了一种用于肝病治疗的基因活化聚乳酸材料，包括聚乳酸材料本体和活化层，活化层包括由内向外依次间隔设置的质粒DNA层和半乳糖苷化壳聚糖层，所述基因活化聚乳酸材料具有良好的细胞相容性并且能够原位诱导肝细胞生长，可增强肝细胞在细胞外基质支架材料上的黏附性能，提高植入体的稳定性，进一步介导肝靶向性基因转移，有效地调控基因靶向性释放并增强细胞活力，提高转染率，从而实现肝病的治疗；本发明还提供了所述基因活化聚乳酸材料的制备方法，利用半乳糖苷化壳聚糖分子与质粒DNA之间的静电作用使半乳糖苷化壳聚糖层与质粒DNA层在聚乳酸材料表面依次沉积，不仅操作简单，成本低廉，而且实施容易，非常适合用于产业化运用。
文档编号A61K48/00GK101745151SQ20091025089
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者胡燕, 蔡开勇 申请人:重庆大学