专利名称：人t细胞活化蛋白基因、其编码的多肽及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。更具体地说，本发明涉及一种新的人T细胞活化蛋白，该蛋白是Ly-6抗原家族的一个新成员。
T细胞活化蛋白(T-cell-activating protein，简称“TAP”)是一种通过磷脂酰肌醇锚定于细胞表面的糖蛋白，它参与细胞活化的过程(Cell 47365-370，1986)。TAP并不在所有的T细胞中表达，在约10％具可的松抗性、成熟的胸腺细胞和大部分的静止外周T细胞中表达TAP(Proc.Natl.Acad.Sci.837424-7428，1986)。编码小鼠TAP的基因定位于Ly-6基因座，该基因座上的基因编码一类同源性较高的T细胞分化抗原(Proc.Natl.Acad.Sci.832954-2958，1986)。
1986年，Rock小组和Reiser小组在小鼠T-T杂交瘤细胞中分离到了小鼠的TAP蛋白(Cell 47365-370；J.Exp.Med.163(2)315-333，1986)。1988年，Reiser等人克隆了小鼠TAP的cDNA序列(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。
然而迄今为止，尚没有人公开过本申请中涉及的人的TAP序列。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码Ly-6抗原基因家族的一个新成员，本发明新的人Ly-6抗原被命名为人T细胞活化蛋白，简称“TAP”。
本发明的另一个目的是提供一种新的Ly-6抗原蛋白家族成员，本发明的蛋白被命名为人TAP蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人Ly-6抗原的方法。
本发明还涉及这种人TAP抗原基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人TAP蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人TAP蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人TAP蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人TAP蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人TAP蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人TAP蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为598个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于25-429位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人TAP蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中25-429位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框25-429位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中25-429位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地，在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人TAP相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人TAP蛋白多肽”指具有人TAP蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人TAP相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人TAP蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人TAP DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人TAP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人TAP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了人TAP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人TAP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人TAP蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人TAP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人TAP保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表 1<
本发明还包括人TAP多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人TAP的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有人TAP核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人TAP的核酸分子。
本发明还包括检测人TAP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人TAP多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。较佳地，该引物或探针序列对应于人TAP核酸序列中不同于小鼠TAP核酸序列的部分。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于” 意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人TAP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人TAP基因产物或片段。较佳地，指那些能与人TAP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人TAP蛋白的分子，也包括那些并不影响人TAP蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人TAP基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人TAP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人TAP或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人TAP功能的抗体以及不影响人TAP功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人TAP基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人TAP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人TAP核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的SEQ ID NO.3序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为598个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于25-429位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15′-TCTGAGAGGAACCCTTCTCTGAG-3′和反向引物B15′-ATTAGAGCACCTACCTACCCAGC-3′进行PCR，获得598bp的目的片段。测序后得到SEQ IDNO.3的全长cDNA序列。
根据同源比较的结果，本发明的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列与小鼠TAP基因显示了极高的同源性，因此，两者的功能必然有密切联系。
T细胞表面蛋白TAP可以按不依赖抗原的方式激活T细胞(J.Immunol.13891-97，1987)。小鼠的TAP基因被定位于Ly-6基因座(Immunogenetics 2047-56，1984)，其蛋白内含有10个半胱氨酸残基(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。TAP蛋白上的糖基可能通过O-连接方式和蛋白相连(Proc.Natl.Acad.Sci.843370-3374，1987)。TAP蛋白的C端具有和磷脂酰肌醇相连的蛋白中普遍存在的疏水区，因而可通过磷脂酰肌醇锚定于细胞表面(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。T细胞表面上与磷脂酰肌醇相连的蛋白大多具有刺激T细胞的能力(Cell 47365-370，1986)。
TAP参与的T细胞活化过程可能包括以下两个步骤首先抗TAP的抗体诱导T细胞活化，并促进T细胞受体的刺激；然后，TAP在几乎所有的L3T4+外周T细胞上表达(Proc.Natl.Acad.Sci.832255-2259，1988)。
TAP在个体发育中的表达情况显示TAP在胎儿胸腺发育的早期即开始表达(J.Immunol.1371232-1238，1986)。TAP的表达在T细胞受到促有丝分裂的刺激后显著上升，而且还受到外源γ干扰素的上调作用(Immunology 64267-271，1988)。当TAP表达缺陷时会导致产生一些免疫缺陷，如未成熟T细胞不应答及lpr/lpr疾病中异常的淋巴细胞。
另外，在阵发性夜间血红蛋白尿症中淋巴细胞应答减弱可能和磷脂酰肌醇复合物的形成缺陷有关(Cell 52665-674，1988)。TAP所在的Ly-6基因座在脾、肾、肺中有表达，在心、脑中也有稍低的表达。Ly-6基因座上的基因在许多非淋巴组织可活性转录，这提示它们在这些组织中可能存在一些特殊的功能(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。
在附图中，
图1为本发明的人TAP与小鼠TAP的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人TAP与小鼠TAP的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“.”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人TAP的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15′-TCTGAGAGGAACCCTTCTCTGAG-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B15′-ATTAGAGCACCTACCTACCCAGC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段约为600bp的目的片段。
2. PCR产物的测序将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共598bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于25-429位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人TAP的氨基酸序列，共134个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用本发明的人TAP的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+Swiss Prot+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与小鼠TAP基因(gi|198921|gb|M18184|MUSLY62[198921])显示了极高的同源性，如用PCGENE软件分析，它与小鼠TAP基因在核酸水平上有97.7％的同一性(图1)，在蛋白水平上则完全一致(图2)，因此可以肯定本发明蛋白是人的TAP蛋白，并且具有与小鼠TAP相同或相近的的功能。
研究表明，T细胞活化可以通过T细胞上的受体识别由辅助细胞上主要组织相容性复合物呈递的抗原而实现(Ann.Rev.Immunol.3237-261，1985)。而T细胞表面蛋白TAP可以按不依赖抗原的方式活化T细胞(J.Immunol.13891-97，1987)。小鼠的TAP基因被定于Ly-6基因座，该基因座编码许多在发育过程中受调节的造血细胞表面蛋白(Immunogenetics 2047-56，1984)。
TAP是T细胞表面糖蛋白，其分子量在非还原条件下介于10-12KD，在还原条件下介于15-17KD(Proc.Natl.Acad.Sci.837424-7428，1986)。SDS-PAGE胶电泳显示TAP蛋白的分子量在还原环境中增大，表明其蛋白内含有二硫键(Cell47365-370，1986)，TAP的cDNA序列分析表明TAP蛋白中含有10个半胱氨酸残基(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)，本发明中对应为SEQ ID NO.4中第29位、第32位、第41位、第46位、第53位、第74位、第78位、第98位、第99位和第104位的半胱氨酸(第10位与第20位半胱氨酸为信号肽序列的氨基酸)。
TAP的氨基酸序列不含有N-糖基化位点，其蛋白上的糖基可能通过O-连接方式和蛋白相连(Proc.Natl.Acad.Sci.843370-3374，1987)。TAP蛋白不含有典型的穿膜结构域，C端具有和磷脂酰肌醇相连蛋白普遍存在的疏水区(C端富含亮氨酸以及缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等)，可通过磷脂酰肌醇锚定于细胞表面(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。实验表明，在T细胞表面上和磷脂酰肌醇相连的蛋白的内化作用不依赖衣被凹陷方式(coated pit-independent pathway)进行的(Eur.J.Immunol.2215-21，1992)。这些与磷脂酰肌醇相连的蛋白大多具有刺激T细胞的能力，提示磷脂酰肌醇连接方式可能代表了一种信号传导途径(Cell47365-370，1986)。
抗TAP的单克隆抗体可以诱导成熟胸腺细胞的增殖，其强度与伴刀豆球蛋白A的刺激反应相当(J.Immunol.1371232-1238，1986)。TAP参与的T细胞活化过程可能包括以下两个步骤首先抗TAP的抗体诱导T细胞活化，并促进T细胞受体的刺激；然后，TAP在几乎所有的L3T4+外周T细胞上表达。在胸腺组织，TAP的表达标志着免疫活性的获得(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。TAP在个体发育中的表达情况显示TAP在胎儿胸腺发育的早期即开始表达，这时候其它大多数T细胞的标志分子还未出现。这些早期淋巴细胞可以通过TAP分子被活化也说明，TAP的表达和免疫活性的获得存在相关性(J.Immunol.1371232-1238，1986)。TAP的表达在T细胞受到促有丝分裂的刺激后显著上升，也受到外源γ干扰素的上调作用。已知T细胞在活化后能分泌γ干扰素，表明TAP在活化的T细胞中表达上升是受内源γ干扰素的自分泌作用(Immunology 64267-271，1988)。当TAP表达缺陷时会导致产生一些免疫缺陷，如未成熟T细胞不应答及lpr/lpr疾病中异常的淋巴细胞。另外，在阵发性夜间血红蛋白尿症中淋巴细胞应答减弱可能和磷脂酰肌醇复合物形成缺陷有关(Cell 52665-674，1988)。Northern Blot实验表明，TAP所在的Ly-6基因座在脾、肾、肺中有表达，在心、脑中也有稍低的表达。Ly-6基因座上的基因在许多非淋巴组织有活性转录，这提示它们在这些组织中可能存在一些特殊的功能(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。
本发明的人TAP除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人TAP还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。
针对本发明人TAP的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员，如小鼠的TAP)。
例如，本发明人TAP核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人TAP的表达水平或者抑制人TAP的过度表达。本发明的人TAP蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人TAP缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人TAP在大肠杆菌中的表达编码人TAP的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)或实施例1中的扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCGGATCCATGGACACTTCTCACACTA-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人TAP编码序列的19个核苷酸；3’寡核苷酸引物序列为5’-GTTCGTCGACTCAGAGCAAGGTCTGCAGG-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和人TAP的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和SalI消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明人TAP的cDNA插入片段已正确装入载体。
过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人TAP。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人TAP。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为14KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人TAP在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人TAP的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)或实施例中的扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCAAGCTTATGGACACTTCTCACACTA-3′(SEQ ID NO.7)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人TAP编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为
5’-GTTCGGATCCTCAGAGCAAGGTCTGCAGG-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人TAP的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明人TAP的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为14KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将如上获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人TAP基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称人T细胞活化蛋白基因、其编码的多肽及制法和用途(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1TCTGAGAGGA ACCCTTCTCT GAG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2ATTAGAGCAC CTACCTACCC AGC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)长度598bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3TCTGAGAGGA ACCCTTCTCT GAGGATGGAC ACTTCTCACA CTACAAAGTC CTGTTTGCTG 60ATTCTTCTTG TGGCCCTACT GTGTGCAGAA AGAGCTCAGG GACTGGAGTG TTACCAGTGC 120TATGGAGTCC CATTTGAGAC TTCTTGCCCA TCAATTACCT GCCCCTACCC TGATGGAGTC 180TGTGTTACTC AGGAGGCAGC AGTTATTGTG GATTCTCAAA CAAGGAAAGT AAAGAACAAT 240CTTTGCTTAC CCATCTGCCC TCCTAATATT GAAAGTATGG AGATCCTGGG TACTAAGGTC 300AACGTGAAGA CTTCCTGTTG CCAGGAAGAC CTCTGCAATG TAGCAGTTCC CAATGGAGGC 360AGCACCTGGA CCATGGCAGG GGTGCTTCTG TTCAGCCTGA GCTCAGTCCT CCTGCAGACC 420TTGCTCTGAT GGTCCTCCCA ATGACCTCCA CCCTTGTCCT TTTATCCTCA TGTGCAACAA 480TTCTTCCTGG AGCCCTCTAG TGATGAATTA TGAGTTATAG AAGCTCCAAG GTGGGAGTAG 540TGTGTGAAAT ACCATGTTTT GCCTTTATAG CCCCTGCTGG GTAGGTAGGT GCTCTAAT 598(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度134个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Asp Thr Ser His Thr Thr Lys Ser Cys Leu Leu Ile Leu Leu 15Val Ala Leu Leu Cys Ala Glu Arg Ala Gln Gly Leu Glu Cys Tyr 30Gln Cys Tyr Gly Val Pro Phe Glu Thr Ser Cys Pro Ser Ile Thr 45Cys Pro Tyr Pro Asp Gly Val Cys Val Thr Gln Glu Ala Ala Val 60Ile Val Asp Ser Gln Thr Arg Lys Val Lys Asn Asn Leu Cys Leu 75Pro Ile Cys Pro Pro Asn Ile Glu Ser Met Glu Ile Leu Gly Thr 90Lys Val Asn Val Lys Thr Ser Cys Cys Gln Glu Asp Leu Cys Asn 105Val Ala Val Pro Asn Gly Gly Ser Thr Trp Thr Met Ala Gly Val 120Leu Leu Phe Ser Leu Ser Ser Val Leu Leu Gln Thr Leu Leu 134(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGGATCC ATGGACACTT CTCACACTA 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TCAGAGCAAG GTCTGCAGG 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGGACACTT CTCACACTA 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TCAGAGCAAG GTCTGCAGG 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列。
4.一种分离的人TAP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.一种产生具有人TAP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人TAP蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人TAP蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人TAP蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人TAP蛋白活性的多肽。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸25-429位。
10.一种能与权利要求4所述的人TAP蛋白多肽特异性结合的抗体。
11.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
12.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及了一种新的Ly－6抗原基因家族的成员T细胞活化蛋白(简称“TAP”)。本发明提供了该新的人TAP的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的新的人TAP蛋白的方法。本发明还提供了这种新人TAP基因和蛋白的应用。
文档编号C07K14/435GK1251861SQ98121529
公开日2000年5月3日 申请日期1998年10月20日 优先权日1998年10月20日
发明者余龙, 傅强, 赵勇, 张宏来, 屠强 申请人:复旦大学