油菜nf-yb基因家族基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及油菜NF-YB基因家族基因的应用。
【背景技术】
[0002] 真核生物在转录时不仅需要RNA聚合酶，往往还需要多种蛋白质因子的协助，而 这类蛋白质因子则被称为转录因子（transcription factor)。转录因子，又称为反式作用 因子（trans-acting factor)，是一群能与基因5'端上游或3'端下游特定序列（顺式作 用元件，cis-acting element)专一,性结合，对基因的表达起抑制或增强的作用，从而保证 目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。一般可将转录因子分为两 个类：通用转录因子和特异性转录因子（包括转录激活因子和转录抑制因子）。NF-Y，全称 为Nuclear Factor Y，是一类特异性转录因子，也被称为Heme Activator ￡rotein(HAP) S￡CAAT-box finding Eactor(CBF)，有三个亚单位组成，分别是 NF-YA(CBF-B、HAP2)、 NF-YB(CBF-A、HAP3)及NF-YC(CBF-C、HAP5)，NF-Y就是特异性转录因子（包括转录激活因 子和转录抑制因子）。
[0003] NF-Y与其他蛋白结合形成蛋白复合物结合在许多基因启动子上游的CCAAT框上， 从而发挥功能。在植物体中约30%基因的启动子中含有CCAAT框。在植物中，NF-YA、NF-YB 和NF-YC分别是以多基因家族的形式存在的。然而，在动物及酵母中NF-YA、NF-YB和NF-YC 是单基因。
[0004] NF-Y在动物、植物及微生物中均有研究。NF-Y在微生物的研究涉及的生物有酿 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、乳 酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、红褐肉座菌（Hypocrea jecorina)、构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)〇
[0005]在酵母中，HAP2、HAP3和HAP5能与线粒体上的CYC1 (iso-1-cytochrome c)的UAS2 结合，其中任何一个HAP2、HAP3或者HAP5的突变失活都会阻碍CYC1基因表达，从而导致 酵母在以乳酸为碳源的培养基中无法生长。进一步研究中发现，HAP2、HAP3和HAP5蛋白可 以通过形成HAP复合体来调节CYC1基因表达。此外，HAP4是酵母的第四个HAP亚基，其在 HAP复合体中能够协助该复合体与CCAAT-box结合。酵母的LPD1基因编码硫辛酰胺脱氢酶 (lipoamide dehydrogenase，LPDH)，其与 CYC1 -样，可由 HAP 复合体正向调控。
[0006] NF-Y在动物的研究涉及的生物有小鼠、大鼠、人、果蝇和线虫等，研究表明NF-Y参 与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老和细胞癌变等重要的生理过程NF-Y作为一类关键的 调节因子在植物许多生理过程（比如抗干旱、花期、种子发育等）中扮演着重要的角色。甘 蓝型油菜是一种重要的油料作物，可以用作工业原料、生物能源、食品添加剂、动物饲料等， 在其生长发育过程中，受各种转录因子的调控，以响应体外体内的各种信号。在甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)中，首先鉴定的 NF-Y 是 BnCBF-Bl 和 BnCBF-B2,它们是一个 BnCBF-B 基因的两个不同的选择性剪切（选择性剪切发生在5'端），分别编码314个氨基酸和303 个氨基酸的蛋白质（这两种蛋白质的区别在N端），它们在不同的组织中都有表达。后续研 究表明，该基因在油菜生殖器官发育中扮演着十分重要的作用，在油菜的生殖器官中表达 BnCBF-B反义转录本可导致可育花粉粒的减少并伴有雌性可育能力的。
[0007]在 2011 年，BnLECl(grassica napus LEAFY S0TYLED0N1)和 BnLlL(grassica napus LEAFY C0TYLED0N1-LIKE)得到鉴定，并发现在油菜种子形成时期过表达BnLECl和 BnLIL能够将种子的含油量提高2~20%。在这些转基因油菜的种子形成过程中，许多参 与脂肪酸生物合成和糖酵解的基因表达发生了上调。另外，在转BnLECl基因植株发育的种 子和长角果鞘中，发现一些参与蔗糖合成和转运的基因的表达得到增强。同时还发现在转 基因油菜发育的种子中蔗糖和果糖的积累，这表明流向脂肪酸合成的碳增加了。
[0008] 研究报道发现，在长日照条件下，拟南芥中的AtNF_YB2和AtNF_YB3可以通过激活 FT 的表达，FT 又可以激活 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1(S0C1)的表达，进而促 进拟南芥开花。
[0009] 二穗短柄草的BdNF-YB6和大麦的HvNF-YBl是AtNF-YB2和AtNF-YB3的同源基因， 研究报道表明均能促进植物的开花。
[0010] 在拟南芥中，过表达AtNF-YBl可以增强拟南芥抵抗干旱的能力。在水分充足 的条件下，AtNF-YBl在拟南芥的各个器官和组织中均有不同程度的表达，在干旱试验中， AtNF-YBl在成熟叶中的表达增加了 12倍。在玉米（Zea mays)中，与AtNF-YBl同源的 ZmNF-YB2同样也表现出相应的抵抗干旱的功能。
[0011] 目前对油菜的NF-YB家族基因的研究报道的还不是太多，对其功能的研究还不深 入，我们目前的研究对他人及后续功能研究奠定了基础。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供油菜NF-YB基因家族基因的应 用。
[0013] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0014]油菜 NF-YB 基因家族中的五个成员 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF-YB6基因在促进植物提前开花、增加根伸长率、提高植物抗逆性中的应用；其中所述 的 BnNF-YB2 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示，BnNF-YB3 基因 cDNA 序列如 SEQ ID N0. 2 所示，BnNF-YB4基因cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，BnNF-YB5基因cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0015] 其中，所述的抗逆性优选抗干旱和/或抗盐。
[0016] 含有油菜NF-YB基因家族中的五个成员BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/ BnNF-YB5/BnNF-YB6基因的重组表达载体在促进植物提前开花、增加根伸长率、提高植物抗 逆性中的应用；其中所述的BnNF-YB2基因cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，BnNF-YB3基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 2 所示，BnNF-YB4 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示，BnNF-YB5 基因cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0017] 其中，所述的抗逆性优选抗干旱和/或抗盐。
[0018] 所述的重组表达载体优选将所述的BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF_YB6基因分别插入在表达载体Binary vector pCAMBIA-1302的Nco I和Spe I两个 酶切位之间所得。
[0019] 有益效果：
[0020] 本发明克隆得到油菜NF-YB基因家族中的五个成员BnNF-YB2/BnNF-YB3/ BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 基因，BnNF-YB2 和 BnNF-YB3/ 都是 AtNF-YB2 的同源基 因，BnNF-YB2 和 BnNF-YB3/ 与 AtNF-YB2 相似度分别是 61. 9 % 和 61. 4 %。BnNF-YB4/ BnNF-YB5/BnNF-YB6 都是 AtNF-YB3 的同源基因，BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 与 AtNF-YB3 的相似度分别是 59. 3%、69. 2%和 66. 6%。
[0021] 我们实验研究的结果发现 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 不 仅参与植物光周期花期调控，均能促进拟南芥提前开花，在植物抗逆境途径中也发挥着正 调控作用。过表达的拟南芥比野生型的拟南芥根的伸长率增加。在盐（75mMNaCl)及干旱 (lOOmMmannitol)胁迫处理下，与野生型拟南芥相比，过表达拟南芥根伸长率仍然增加。这 为培育耐盐、耐干旱的油菜新品种提供了一定的理论基础和依据。
【附图说明】
[0022] 图1.高保真PCR扩增BnNF-YB2/3/4/5/6的结果
[0023] M:Marker I ;A、B、C、D、E 分别是 BnNF-YB2/3/4/5/6
[0024] 图2?双酶切结果
[0025] Ml ：Maker I ；M2 ：DL2000DNA Marker ；M3 ：DL15000DNA Marker ； 1 ：BnNF-YB2 ； 2 ：BnNF-YB4 ；3 ：BnNF-YB3 ；4 ：BnNF-YB5 (483) ；5 ：BnNF-YB5 (489) ；6 ：BnNF-YB6 (579) ；7 ： BnNF-YB6(570) ；8 ：Binary vector pCAMBIA-1302
[0026] 图3. 35S: :BnNF-YB2/3/4/5/6转基因拟南芥阳性苗PCR检测验证
[0027] 注（A)、（C)、（E)和（F)所用验证引物为35S GFP