进 行阳性苗检测，结果见图3。
[0092] 实施例6.拟南芥转基因阳性苗纯合体的筛选
[0093] 将收取到的拟南芥转基因阳性苗的F2的种子按照实施例5中的方法筛选，根据孟 德尔遗传与分离定律的理论指导，筛选获得转基因拟南芥纯合体植株（图4)。
[0094] 实施例7.转基因拟南芥开花实验
[0095] 将P35S: :BnYB2/3/4/5/6过表达转基因拟南芥纯合体种子播种于黑色方形小花 盆中，每个花盆中只点播一粒种子。此时记下拟南芥播种的时间。WT和过表达的每个株系 分别播种10粒种子，将播过种子的血盘放在拟南芥最适合生长的条件下（光照，湿度，温度 等条件要适宜），在长日照条件下（光照时间16h光照/8h黑暗）。当拟南芥第一个花苞开 放时，我们开始统数拟南芥莲座叶的叶片数并且记下此时拟南芥生长的天数。当所有的WT 和过表达的每个株系植株都统计结束后，我们计算出拟南芥开花时的平均叶片数和平均生 长天数，结果见图5和图6。实验结果显示(^-81^82/3/4/5/6(?353 ::8成82/3/4/5/6)拟南 芥与野生型拟南芥相比较，开花时的天数均比野生型少，并且开花时的叶片数也均比野生 型拟南芥少。实验结果表明BnYB2/3/4/5/6促进拟南芥提前开花。
[0096] 实施例8. BnNF-YB2/3/4/5/6亚细胞定位实验
[0097] 将P35S: :BnYB2/3/4/5/6过表达转基因拟南芥纯合体种子，表面消毒处理（先用 70%的酒精，消毒lmin.用无菌水洗涤3-4次，再用30% d的次氯酸钠消毒处理3min，用无 菌水洗涤4-5次）后点播到含有Hyg(潮霉素）的培养基上，取10-day的幼苗的根做切片 在荧光共聚焦显微镜下观察绿色荧光，结果见图7。实验结果显示BnYB2/3/4/5/6均在拟南 芥根尖细胞的细胞核中表达。
[0098] 实施例9.转基因拟南芥根伸长率统计实验
[0099] 将WT及转基因拟南芥纯合体种子，经过表面消毒灭菌（将种子放在1. 5ml离心管 中，用自来水浸泡30min,倒掉自来水，在无菌超净台下用70%酒精消毒lmin,用灭过菌的 去离子水洗涤3-4次，再用30%的NaclO处理3min，用灭过菌的去离子水洗涤5-6次，将 消过毒的种子点播在l/2MS、l/2MS+75mM NaCl、l/2MS+100mM mannitol处理过的方形培养 皿上。将平板密封，放在4°C冰箱中3天，之后将平板垂直放置在适宜条件下（光照时间、光 照强度、湿度等条件适宜的条件下），在拟南芥种子萌发出芽尖并方便标记的时候标出第一 个点，之后每两天标记一次，将两次标记的点连接成线段，共统计5次，然后用单反相机拍 照，利用Image J软件统计两天的伸长率。统计的数据利用SigmaPlot作图，结果见图8。 结果显示，在空白对照处理下、75mM NaCl处理下及100mM mannitol处理下，过表达拟南芥 (P35S: :BnYB2/3/4/5/6)与野生型拟南芥相比较，第一个两天的伸长率有所增加，但不明 显；第二个两天、第三个两天、第四个两天、第五个两天时，测定的两天的伸长率转基因拟南 芥与野生型拟南芥有明显的增加。从图中结果可以得知，第二个两天、第三个两天、第四个 两天、第五个两天内拟南芥根生长的速率比第一个两天里的生长快，伸长率随时间有递增 的趋势。在75mM NaCl处理下，与空白处理相比较，野生型拟南芥根生长受到抑制，而过表 达拟南芥根生长不但没有受到抑制，根伸长率较野生型增加，促进了拟南芥根的伸长，实验 结果表明Bn-YB2/3/4/5/6提高了拟南芥的耐盐性。在lOOmM mannitol处理下，对野生型 拟南芥根伸长率影响不明显；而过表达拟南芥根伸长率较野生型拟南芥增加，这一实验结 果表明Bn-YB2/3/4/5/6提高了拟南芥抗旱性。
[0100] 实施例10.根系扫描实验
[0101] 将WT及转基因拟南芥纯合体种子，经过表面消毒灭菌（将种子放在1. 5ml离心 管中，用自来水浸泡30min，倒掉自来水，在无菌超净台下用70%酒精消毒lmin，用灭过菌 的去离子水洗涤3-4次，再用30%的NaclO处理3min，用灭过菌的去离子水洗涤5-6次， 将消过毒的种子点播在 l/2MS、l/2MS+75mM Nacl、l/2MS+100mM Nacl 1/2MS+0. luM ABA、 l/2MS+50mM mannitol、l/2MS+100mM mannitol处理过的方形培养皿上。将平板密封，放 在4°C冰箱中3天，之后将平板垂直放置在适宜条件下（光照时间、光照强度、湿度等条件 适宜的条件下），到拟南芥生长至20天时用根系扫描仪扫描拟南芥不同生理条件处理下的 根系。统计的数据利用SigmaPlot作图，结果见图9和图10。图9和图10分别是在空白、 75mM Nacl、100mM Nacl、0? luMABA、50mM mannitol 及 100mM mannitol 处理下，拟南芥总根 长（主根和侧根长之和）及跟分支数，结果见图9-10。
[0102] 图9结果显示，在空白处理下，过表达拟南芥与野生型拟南芥相比较，总根长增 加。在75mM Nacl和lOOmM Nacl胁迫处理下，与空白处理相比较，拟南芥根生长受到 抑制，拟南芥总根长变短；而过表达拟南芥与野生型拟南芥相比较总根长增加，并且随 着盐浓度的增加，转基因拟南芥比野生型拟南芥根总长受到的抑制小，这进一步说明了 Bn_YB2/3/4/5/6提高了拟南芥的耐盐性。在50mM mannitol及100mM mannitol处理下，与 空白处理相比较，拟南芥总根长增加。并且随着mannitol浓度的增加，过表达拟南芥总根 长比野生型拟南芥总根长增加，实验结果进一步说明Bn-YB2/3/4/5/6提高了拟南芥抗旱 性。在O.luM ABA处理下，与空白处理相比较，拟南芥总根长较少；而过表达拟南芥与野生 型拟南芥相比较总根长明显增加。
[0103] 图10结果显示，在空白处理下，过表达拟南芥与野生型拟南芥相比较，拟南芥根 分支数（根尖总数）增加。在75mM Nacl和lOOmM Nacl胁迫处理下，与空白处理相比 较，拟南芥根生长受到抑制，拟南芥根分支数变少；而过表达拟南芥与野生型拟南芥相比 较根分支数明显增加，并且随着盐浓度的增加，转基因拟南芥比野生型拟南芥根分支数增 加的多，转基因拟南芥根系更为发达，这进一步说明了 Bn-YB2/3/4/5/6提高了拟南芥的 耐盐性。在50mM mannitol处理下，与空白处理相比较，野生型拟南芥根分支数增加；在 100mM mannitol处理下，与空白处理相比较，野生型拟南芥根分支数减少；在高浓度的甘露 醇处理下，过表达拟南芥与野生型拟南芥相比较，根分支数明显增加，实验结果进一步说明 Bn-YB2/3/4/5/6提高了拟南芥的耐旱性。在0. luM ABA处理下，与空白处理相比较，野生型 拟南芥根分支数减少；在〇. luM ABA处理下，过表达拟南芥与野生型拟南芥相比较根分支 数明显增加。
【主权项】
1. 油菜 NF-YB 基因家族中的五个成员 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF-YB6基因在促进植物提前开花、增加根伸长率、提高植物抗逆性中的应用；其中所述 的 BnNF-YB2 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示，BnNF-YB3 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 2 所示，BnNF-YB4基因cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，BnNF-YB5基因cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗逆性为抗干旱和/或抗盐。3. 含有油菜 NF-YB 基因家族中的五个成员 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF-YB6基因的重组表达载体在促进植物提前开花、增加根伸长率、提高植物抗逆性中的 应用；其中所述的BnNF-YB2基因cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，BnNF-YB3基因cDNA序列 如 SEQ ID NO. 2 所示，BnNF-YB4 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示，BnNF-YB5 基因 cDNA 序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的抗逆性为抗干旱和/或抗盐。5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体为将所述的 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 基因分别插入在表达载体 Binary vector pCAMBIA-1302的Nco I和Spe I两个酶切位之间所得。
【专利摘要】本发明公开了油菜NF-YB基因家族基因的应用。油菜NF-YB基因家族中的五个成员BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6基因在促进植物提前开花、增加根伸长率、提高植物抗逆性中的应用。我们实验研究的结果发现BnNF-YB2/3/4/5/6不仅参与植物光周期花期调控，均能促进拟南芥提前开花，在植物抗逆境途径中也发挥着正调控作用。过表达的拟南芥比野生型的拟南芥根的伸长率增加。在盐及干旱胁迫处理下，与野生型拟南芥相比，过表达拟南芥根伸长率仍然增加。这为培育耐盐、耐干旱的油菜新品种提供了一定的理论基础和依据。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82
【公开号】CN105063060
【申请号】CN201510417212
【发明人】梁明祥, 付蕊欣, 殷祥贞
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月15日