一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及的是一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇 3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 糖基转移酶（glycosyltransferase, GT, EC 2. 4.X.y)是负责催化生物体内糖基 化反应的酶类，它们将活性糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体，并形成糖苷键。糖基转 移酶广泛存在于于原核生物、真核生物以及病毒中。由于糖苷化产物具有潜在的药用价值 以及对植物生命活动调节的重要性，现在已受到人们的广泛关注。GT家族是一个超家族， 其中的GT1家族，由于其C末端含有1个由44个氨基酸组成的保守PSPG序列，该保守序列 被认为是糖基化过程中与UDP-糖的结合的区域；被称为PSPG box或特征基序（signature motif)，据此将GT1单独归类为一个尿苷二磷酸糖基依赖的转移酶超家族（UGTs)，其成员 主要以UDP-半乳糖，UDP-半乳糖，UDP-鼠李糖和UDP-葡糖醛酸为糖基供体。
[0003] 黄酮醇及其衍生化产物是决定茶叶品质和质量的重要组成成分。在2005年， Scharbert和Hofmann的研究中，证实黄酮醇3-0-糖苷化合物赋予了茶饮料柔和湿味的口 感。而且黄酮醇糖苷化合物作为仅次于儿茶素含量的酚类化合物以很低的阈值赋予茶叶柔 和涩感。茶鲜叶中黄酮醇化合物占茶鲜叶干重的3% -4%，其中约95%为黄酮醇3-0-糖 苷。尿苷二磷酸糖依赖的糖基转移酶（UDP_glycosyltransferases，UGTs)是参与茶叶中黄 酮醇3-0-糖苷合成的关键酶类。研究黄酮醇类化合物的合成代谢，不仅是茶树多酚代谢 调控，开展分子育种领域基础性工作，也为通过生物工程，改善或开发不同口味茶饮料奠定 了基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄 酮醇3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因及其编码蛋白和应用，以提供一种新的能够编 码茶树黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 本发明提供了一种黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因，该基因从茶树 鲜叶中分离获得，具有如SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列。
[0007] 本发明还提供了上述黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因在改善茶饮料 滋味中的应用。
[0008] 本发明还提供了一种上述黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因的编码蛋 白，所述编码蛋白具有如SEQ ID N0 :2所不的氣基酸序列。
[0009] 本发明还提供了上述黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因的编码蛋白在 改善茶饮料滋味中的应用。
[0010] 本发明还提供了一种含有上述黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶CSUGT78A15基因的重 组质粒。
[0011] 所述重组质粒为将上述黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶CSUGT78A15基因连接到 pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT78A15。
[0012] 本发明还提供了一种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有上述重组质粒，或其 基因组中整合有外源的黄酮醇3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因序列。
[0013] 所述转基因工程菌为含有上述重组质粒，或其基因组中整合有外源的黄酮醇 3-0-半乳糖基转移酶CsUGT78A15基因序列的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株。
[0014] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种黄酮醇3-0-半乳糖基转 移酶CsUGT78A15基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了形成茶饮料柔和涩味相关 的黄酮醇3-0-半乳糖苷酶基因CsUGT78A15功能，本发明还提供了含有CsUGT78A15基因的 重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，为开发具有改善茶叶滋味的酶类或工程微生物，深化 茶饮料加工，开发不同滋味茶饮品，奠定了坚实基础。
【附图说明】
[0015] 图1是pMal_c2X载体的质粒图谱；
[0016] 图2是以VvGTl的晶体模型2c9z为模版创建的CsUGT78A15的蛋白晶体模型；
[0017] 图3是CsUGI78A15重组蛋白（r CsUGI78A15)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图；其 中，M为蛋白Marker ;1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4 为诱导后破碎后沉淀；5为纯化后蛋白。
[0018] 图4是HPLC分析rCsUGT78A15催化的酶活产物结果图；其中，图4-A~4-C分别 是以UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖为糖供体，以山奈素、槲皮素或杨梅素作为糖受体反应的液 相色谱图；
[0019] 图5是rCsUGT78A15催化合成黄酮醇3-0-半乳糖苷和黄酮醇3-0半乳糖苷产物 的一级质谱和二级质谱分析图谱；其中，图5-A是山奈酚为底物时糖苷化产物的一级质谱 和二级质谱分析图谱；图5-B是槲皮素为底物时糖苷化产物的一级质谱和二级质谱分析 图谱；图5-C是杨梅素为底物时糖苷化产物的一级质谱和二级质谱分析图谱；
[0020] 图6是rCsUGT78A15分别以UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖为糖供体比活力比较柱状 图。
【具体实施方式】
[0021] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0022] 实施例1
[0023] 一、材料
[0024] 1、茶树品种：农抗早（Camellia sinensis (L. )0? Kuntze. var. sinensis cultivar Nongkangzao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于-80°C冰箱中备用；
[0025] 2、pMal_c2X载体：其质粒图谱如图1所示；
[0026] 3、大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌：购于上海北诺生物科技有限公司；
[0027] 4、LB培养基：称取10g的NaCl，5g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，加入950mL去 超纯水搅拌溶解，用lmol/L的NaOH调pH至7. 0,加水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌15min， 即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可；
[0028] 5、质量浓度为40%的半乳糖溶液：称取40g半乳糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定 容至 100mL，110°C灭菌 10min ;
[0029] 6、氨节青霉素母液（Amp+，100mg/mL):称取lg氨节青霉素Amp，溶于10mL灭菌水， 过滤除菌，分装小管，_20°C保存；
[0030] 7、lmol/L的IPTG (异丙基硫代-D-半乳糖苷）：称取2. 383g IPTG，溶于灭菌 超纯水，定容至10mL，过滤除菌，分装并于-20°C保存；
[0031] 8、蛋白纯化缓冲液：上柱缓冲液：称取0? 37gEDTA，11. 67gNaCl，2. 42gTris， 0. 15gDTT于足量纯水中，搅拌使其充分混匀。用稀盐酸调其PH至7. 4,定容至1L，即得上 柱缓冲液。洗脱缓冲液：1L上柱缓冲液中加入3. 60g麦芽糖，溶解搅拌均匀。
[0032] 9、lOOmM的pH7. 5的Tris-HCL缓冲溶液：称取1. 1214gTris加水至90mL搅拌溶 解均匀，加稀HCL调pH至7. 5,补水定容至100mL ;
[0033] 10、体积比为1 %的乙酸：用移液管量取10mL色谱级乙酸溶液于1L容量瓶中，用 超纯水定容至1L。
[0034] 二、CsUGI78A15 基因的克隆：
[0035] 1、设计带有表达载体pMal_c2X载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列 如 SEQ ID N0 :3 和 SEQ ID N0 :4 所示：
[0036] SEQ IDN0 :3 :正向引物：5' -TCTAGAATGTCGACGATGGTGACTAACTCCTC-3
[0037] SEQ IDN0 :4 :反向引物：5' -CTGCAGTCAAAGATTGAGACTTGTTACCACC-3' ；
[0038] 2、按照TaKaRa RNAiso试剂盒和RNAisoPlus试剂盒说明书，提取茶树品种农抗 早鲜叶RNA，并反转录为cDNA ;
[0039] 3、